一种神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗及其制备方法，该疫苗为FAT10多价表位肽与Tim-3基因重组表达载体的复合物；FAT10多价表位肽由表位FAT10154-162/FAT10155-163/FAT1049-57与穿膜序列HIV-Tat40-48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成，穿膜序列位于氨基端，内质网滞留信号序列位于羧基端，表位与穿膜序列或内质网滞留信号序列之间以接头序列连接；该疫苗可成功进入细胞并靶向内质网，有效促进表位FAT10154-162/FAT10155-163/FAT1049-57进入MHC-I类抗原递呈途径激发特异性CTL应答，同时Tim-3发挥抑制免疫逃逸作用，协助刺激T细胞活化，从而产生广泛的免疫激活效应，诱导强有力的抗肿瘤免疫。
【专利说明】一种神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多价治疗性疫苗，特别涉及一种神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]神经胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤，是颅内最常见的恶性肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40%-50%，以发病率高、复发率高、致死率高，成为肿瘤治疗的难题。传统治疗方法主要是手术和放化疗提高患者的生存质量。但是位于重要功能区的胶质瘤要很难做到全切除。放射治疗几乎是各型胶质瘤的常规治疗，但疗效评价不一，除髓母细胞瘤对放疗高度敏感，室管膜瘤中度敏感外，其他类型对放疗均不敏感。化疗药物限于血脑屏障及药物的毒副作用，疗效尚不肯定。近年来免疫治疗成为脑胶质瘤继手术、放化疗后的有效治疗手段。与其他方式联合应用具体有很强的互补作用，对患者受损的免疫系统能够起到恢复与重建的独特疗效，从而进一步防止肿瘤的复发和转移。
[0003]FATlO也称为双泛素，是一种由165个氨基酸组成的18KD的蛋白，属于泛素样调节子(UBL)蛋白家族，由两个泛素样部分前后融合而成。UBL蛋白家族通过与其他蛋白质共价结合而行使泛素样修饰作用。最近的研究表明UBL蛋白家族参与多种生物学过程，包括细胞分裂、DNA修复、自噬、信号转导及胚胎发育等。因此，UBL蛋白家族在许多人类疾病(尤其是肿瘤)的发生及发展中扮演了重要角色。研究发现FATlO在多种肿瘤中高表达，如肝癌、结直肠癌、 宫颈癌、卵巢癌等，与肿瘤的发生、发展、转移密切相关。而其中FATlO与月父质瘤的关系最为密切。
[0004]CTL是通过其T细胞受体(TCR)特异性识别抗原递呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC) I类分子-肽复合物而得以活化，并最终杀死靶细胞。其中，与MHC-1类分子特异性结合的短肽即CTL表位在CTL活化过程中起关键作用。但大多数MHC-1类分子只递呈内源性抗原。外源性抗原绝大多数进入MHC-1I类抗原递呈途径以激活辅助性T细胞(Th细胞)，仅有少数可被MHC-1类分子递呈，即交叉递呈。因此，如何将外源性短肽有效投入APC内MHC-1类抗原递呈途径是激发特异性CTL应答的关键，也是基于表位开发疫苗的瓶颈问题。
[0005]由于细胞膜的屏障作用，生物大分子不能自由进入细胞。近年来，一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽(其长度一般不超过30个氨基酸)相继被发现，其可有效携带外源性大分子进入细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。这些具有细胞穿透能力的多肽被命名为细胞穿膜肽(CPP)。研究最早的CPP为人类免疫缺陷病毒(HIV)-1的反式激活蛋白Tat。1988年，Green和Frankel证实Tat能跨膜转移到细胞质和细胞核内。1997年，Vives等发现Tat中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片段与蛋白转导功能密切相关，称之为蛋白转导域。进一步研究发现，由Tat中的40-48位氨基酸残基组成的序列(Arg-Arg-ArgArg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln7RRRRKKRRQ)即可完全行使蛋白转导的功能,这是Tat既有穿膜特性又无细胞毒性的最小片段。[0006]肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系。肿瘤微环境(tumormicroenviroment)是肿瘤在其发生和发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及一些浸润细胞(如树突状细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫细胞)共同组成。肿瘤细胞可通过修饰自身表面抗原、表达负性调控分子或分泌抑制因子来逃避免疫细胞的识别与攻击，获得免疫逃逸，从而得以发生和发展。CTL细胞是抗肿瘤免疫的主要免疫效应细胞，细胞的活化有赖于特异性抗原信号和共刺激分子信号双重信号的共同作用。共刺激分子B7家族对激活和抑制CTL细胞免疫起着非常关键的作用。CTL细胞免疫反应受抑是肿瘤获得免疫逃逸重要途径。大量研究显示，人类肿瘤表达的B7-H1是负性调控分子，有利于肿瘤的发生和发展。Tim-3 (T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子3)是在激活的T、B细胞上表达的B7-H1和B7-DC分子的受体，具有抑制CTL细胞的活化和诱导活化CTL细胞凋亡的作用。国外多项研究表明，肿瘤微环境的刺激可上调B7-H1分子在肿瘤细胞和激活的APC表面表达上的表达，并进一步与活化T细胞上Tim-3的结合，抑制细胞免疫应答，从而参与肿瘤细胞的免疫逃避。因此，如果能阻断B7-H1分子对免疫细胞的抑制，将在一定程度上抑制肿瘤免疫逃逸机制，并提高免疫治疗效果。
[0007]本发明拟应用复合疫苗载体，将阳离子穿膜肽Tat与FATlO表位肽偶连，并通过正负电荷的吸引作用，包裹负电荷的表达Tim-3的表达载体，形成纳米样结果的复合颗粒。疫苗免疫机体后，被抗原递呈细胞吞噬，FATlO表位肽被处理后递呈到细胞表面，诱导体内的FATlO特异性的CTL免疫应答。同时疫苗中的载体表达分泌Tim-3蛋白，通过阻断封闭Tim-3与其配体的结合作用，减弱Tim-3的负反馈抑制作用，从而协同增强FATlO表位肽诱导CTL的抗肿瘤效应，达到增强抗肿瘤免疫应答和抑制肿瘤逃逸的“双向调节”的治疗作用。
【发明内容】
[0008]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗，目的之二在于提供所述神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗的制备方法。
[0009]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
1、神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗，该疫苗为fatio154_162表位肽、fatio155_163表位肽、FAT1049_57表位肽与Tim-3基因重组表达载体的复合物；
所述FATlO154.表位肽由表位FAT10154_162、穿膜序列HIV-Tat40-48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成；
所述FAT10155_163表位肽由表位FAT10155_163、穿膜序列HIV-Tat40-48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成；
所述FAT1049_57表位肽由表位FAT1049_57、穿膜序列HIV_Tat40_48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成；
在所述FAT10154_162表位肽、FATlO155^163表位肽和FAT1049_57表位肽中，穿膜序列均位于氨基端，内质网滞留信号序列均位于羧基端，表位与穿膜序列或内质网滞留信号序列之间均以接头序列连接。
[0010]进一步，所述接头序列为YAA ；
进一步，所述FATKW162表位肽、FAT10155_163表位肽和FAT1049_57表位肽的摩尔比为1:1:1。
[0011]进一步,所述Tim-3基因重组表达载体是在真核表达载体PC1-neo中插入Tim_3cDNA全长序列而得到。
[0012]2、所述神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗的制备方法，在搅拌条件下，向溶解有Tim-3基因重组表达载体的磷酸盐缓冲液中滴加溶解有FAT10154_162表位肽、FAT10155_163表位肽和FAT1049_57表位肽的水溶液，滴加完毕后继续搅拌60分钟，再静置60分钟，即得。
[0013]进一步，所述？4110154_162表位肽、FAT10155_163表位肽和FAT1049_57表位肽摩尔比为1:1:1。
[0014]本发明的有益效果在于:本发明疫苗可通过穿膜序列进入细胞，再通过内质网滞留信号序列靶向并滞留于内质网，有效促进胶质瘤蛋白抗原表位fatio154_162/ fatio155_163/FAT1049_57进入MHC-1类抗原递呈途径激发特异性CTL应答，同时疫苗中的载体表达分泌Tim-3蛋白，通过阻断封闭Tim-3与其配体的结合作用，减弱Tim_3的负反馈抑制作用，从而协同增强FATlO表位肽诱导CTL的抗肿瘤效应。达到增强抗肿瘤免疫应答和抑制肿瘤逃逸的“双向调节”的治疗作用。动物实验结果证实，本发明疫苗能够激发CTL分泌干扰素-Y (IFN- Y );能够激发CTL产生细胞毒效应，杀伤胶质瘤细胞，提高荷瘤小鼠的平均生存率。本发明疫苗制备方法简单，成本低廉，在神经胶质瘤的治疗领域有着较好的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为FATlO154.表位肽、FATlO155.表位肽、FATlO49^57表位肽一级结构示意图； 图2为Tim-3基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；
图3为本发明疫苗的透射电镜图；
图4为酶联免疫斑点(ELISP0T)法检测本发明疫苗激发CTL分泌IFN- Y的能力；
图5为51Cr法检测本发明疫苗激发CTL杀伤靶细胞的能力检测结果；
图6为给予本发明疫苗免疫后荷瘤小鼠的肿瘤生长结果；
图7为给予本发明疫苗免疫后荷瘤小鼠的平均生存期结果。
【具体实施方式】
[0016]以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0017]一、神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗的制备
1、FATlO154.表位肽、FATlO155^163表位肽、FATlO49^57表位肽的设计与合成本发明设计的FAT10154_162表位肽、FATlO155^163表位肽、FATlO49^57表位肽的一级结构如图1所示，各表位与穿膜序列或内质网滞留信号序列之间以接头序列连接，以便于各表位保持独立性和能够有效递呈。在本实施例中，接头序列为丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸(Tyr-Ala-Ala, YAA);表位 FAT10154_162 的氨基酸序列为 NLLFLACYC，表位 FATlO155.的氨基酸序列为LLFLACYCI，表位FAT1049_5』^氨基酸序列为VLLLGSKIL ;同时，以卵清蛋白(OVA)表位肽作为对照肽(由表位0VA257-264、穿膜序列HIV-Tat40_48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成)(表位0VA257-264的氨基酸序列为SIINFEKL)。
[0018]多肽的合成在ABI 431A型固相多肽合成仪(美国PE公司)上进行。方法采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。起始选用0.125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP树脂)，按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol,与树脂的摩尔比为4:1。各种氨基酸的α -氨基为Fmoc保护,其余侧链保护基团分别为:Lys (Boc)、Ser (tBu)、Glu (OtBu)、Arg (Pmc)、His (Trt)、Thr (tBu)和 Tyr (tBu)。第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氨基酸的活化用1-羟基苯并三唑(HOBt)和二环己基碳二亚胺(DCC)，偶联后用体积分数为20%的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽合成后，将树脂-粗肽产品在冰浴条件下混合于IOmL切割液A(由结晶苯酚0.75g、
I,2-乙二硫醇即EDT 0.25mL、苯甲硫醚0.5mL、去离子水0.25mL和三氟乙酸即TFA IOmL组成)中，待切割液温度上升至室温后，搅拌反应2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团。将反应混合液经G4玻砂漏斗过滤以去除树脂，先后用ImL TFA、5~IOmL 二氯甲烷反复冲洗反应瓶 、树脂和漏斗。将滤液在常温低压下蒸发至I~2mL，加入50mL预冷乙醚沉淀多肽，4°C放置过夜，G6玻砂漏斗过滤，真空抽干，即得多肽粗品，_20°C保存备用。
[0019]将多肽粗品用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成浓度为20mg/mL的溶液，经孔径为
0.45 μ m的微孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪(瑞典AmersshamBioscienc公司)上用SOURCE凝胶柱进行纯化。流动相A由体积百分含量为10%的乙醇和体积百分含量为0.1%的TFA组成，流动相B由体积百分含量为90%的乙醇和体积百分含量为0.1%的TFA组成；洗脱梯度为:先用流动相A 1.5个柱体积洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0%逐渐增加至80%)洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由80%逐渐增加至100%)洗脱，在主峰处收集多肽溶液，冷冻干燥，即得多肽纯品，用DMSO溶解，-20°C保存备用。
[0020]将多肽纯品用Delta 600型高压液相色谱仪(美国Waters公司)鉴定纯度，采用Symmetry Shield? C18柱，流动相由体积百分含量为10%~60%的乙腈和体积百分含量为
0.1%的TFA组成，梯度洗脱，流速为lmL/min。结果显示，合成多肽的纯度均达到90%以上。同时，将多肽纯品用API 2000 LC/MS型电喷雾离子化质谱仪测定分子量。结果显示，合成多肽的分子量均与理论值相符。
[0021]2、TIM-3基因重组表达载体的构建
收集人外周血单个核细胞(PBMC)，用重组白介素4(rIL-4)和重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)诱导分化成未成熟树突状细胞(DC)，用RNA抽提试剂盒抽提未成熟DC细胞总RNA，紫外分光光度法测定浓度和纯度后，_70°C保存备用。根据GenBank登录号为NM_032782.3的Tim_3基因的完整开放阅读框0RF，设计如下PCR引物:上游引物:5'-TCCCTACACAGAGCTGTC-3'，下游引物:5' - CAGAAATGAAGGCGAGC-3'，上下游引物两端未加限制性酶切位点。PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
[0022]将未成熟DC细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用上述上下游引物PCR扩增Tim cDNA全长，PCR体系总体积为100 μ L，PCR循环条件参数为:94°C预变性2分钟；再94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸I分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。将PCR产物经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定(结果如图2所示，M泳道为DNA分子量标准，I泳道为PCR产物，可见PCR产物在分子量约900bp处有唯一条带，与预期分子量相符)后，切胶回收纯化，再与T载体pGEM-T Easy在T4 DNA连接酶作用下于16°C连接过夜，连接产物转化DH5 α感受态细菌，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有氨苄青霉素的LB培养基过夜培养后提取质粒，用限制性内切酶EcoR I和Pst I进行双酶切鉴定，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序验证，正确插入了 Tim-3 cDNA全长序列的阳性克隆质粒命名为Tim-3-pGEM-T Easy。
[0023]用EcoR I从Tim-3-pGEM-T Easy中酶切出Tim_3 cDNA全长，经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收纯化，紫外分光光度法测定浓度；同时，用EcoR I使真核表达载体PC1-neo线性化，经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收纯化，紫外分光光度法测定浓度；再将Tim-3 cDNA全长与线性化载体pC1-neo在T4 DNA连接酶作用下于16°C连接过夜，连接产物转化DH5a感受态细菌，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有氨苄青霉素的LB培养基过夜培养后提取质粒，用EcoR I和Kpn I进行双酶切鉴定，所得阳性克隆质粒命名为Tim-3-pC1-neo。
[0024]3、FATlO154^162/ FATlO155^163/ FATlO49^57 表位肽与 Tim_3 基因重组表达载体的复合物的制备
将Tim-3-pC1-neo用浓度为0.lmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解制成浓度为500 μ g/mL的溶液，取该溶液100 μ L，在混旋状态下以5 μ L/min的速度滴加总浓度为1000 μ g/mL 的多肽溶液(由摩尔比为 1:1:1 的 FAT10154_162/ FATlO155./ FATlO49^57 表位肽组成)100 μ L，滴加 完毕后继续混旋60分钟，再静置60分钟，即得FATlO154./ FATlO155^163/FATlO49^57表位肽与Tim-3基因重组表达载体的复合物，也即本发明所述神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗。
[0025]透射电镜分析:将新制复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干，晾干30秒，以质量体积百分浓度为1%的醋酸铀水溶液负染30秒，用吸水纸吸干，晾干30秒，SOkV透射电镜观察。结果如图3所示，所得复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。
[0026]二、神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗的抗肿瘤效应研究
效应细胞的制备:将30只6~8周龄雌性Babl/c小鼠随机分为3组:实验组、对照组和空白组，每组10只；将治疗性疫苗用浓度为0.lmol/L、pH为7.4的PBS溶解制成浓度为lmg/mL的溶液；实验组以浓度为lmg/mL的Tim_3基因溶液为免疫原，对照组以浓度为Img/mL的Tim-3基因溶液为免疫原，空白组以浓度为0.lmol/L、pH为7.4的PBS为免疫原；各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100 μ L，之后每间隔I周，以同样方法加强免疫I次，共免疫3次；末次免疫后I周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为I X IO6个/mL，作为后续实验的效应细胞。
[0027]1、ELISP0T法检测治疗性疫苗激发T细胞分泌IFN- Y的能力
采用ELISP0T检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书:在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70%的乙醇100 μ L，室温放置10分钟，PBS洗涤，加入IFN- Y捕获抗体(稀释度为1: 100) 100 μ L，温度4°C孵育过夜，PBS洗涤，加入质量百分浓度为2%的脱脂奶粉100 μ L，室温封闭2小时，PBS洗涤，加入效应细胞100 μ L，温度37°C孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0.1%的吐温20的PBS)洗涤，加入生物素标记的抗IFN-Y抗体(稀释度为1: 100)100 μ L，温度37°C孵育1.5小时，PBST洗涤，加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为1: 5000)100 μ L，温度37°C孵育I小时，PBST洗涤，拍干培养板，加入即用型BCIP/NBT底物反应液100 μ L，室温避光显色2~10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。
[0028]结果见图4，实验组的斑点数(226个/IO5细胞)明显高于其它3组(空白组为14个/IO5细胞，阴性对照组为3个/IO5细胞)，表明本发明的治疗性疫苗具有良好的免疫原性，能够有效激发T细胞分泌IFN- Y。
[0029]2,51Cr释放法检测治疗性疫苗激发T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效应 靶细胞的制备:将神经胶质瘤细胞U251用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的
RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次后，用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为I X IO6个/mL，取ImL置IOmL血清瓶中，加入100 μ Ci Na51CrO4，温度37°C孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的51Cr,再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为I X IO5个/mL，作为靶细胞；
在96孔U型板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100: 1、50: I和25: I加入效应细胞与靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞)；将96孔板500r/min离心30秒后，温度37°C孵育4小时，1000r/min离心10分钟，各孔取上清100 μ L，用Y计数器测定每分钟放射活性(cpm值)，按下述公式计算杀伤率:杀伤率(%) = [(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/ (最大释放组cpm均值-最小释放组 cpm 均值)]X 100%ο
[0030]结果见图5，实验组在各效靶比对U251细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为100: I时，杀伤率为54.7%，而对照组杀和空白组对U251细胞无特异性杀伤作用，表明本发明的治疗性疫苗能够有效激发T细胞产生对肿瘤细胞的特异性杀伤效应。
[0031]二、体内实验
将荷瘤小鼠随机分为三组:实验组、对照组和空白组，空白组尾根部皮下注射生理盐水；对照组尾根部皮下注射Tim-3基因溶液；实验组尾根部皮注射治疗性疫苗；观察60天内各组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
[0032]结果见图6和7:与对照组和空白组比较，实验组小鼠生存率高，肿瘤生长缓慢。表明本发明的治疗性疫苗能够有效抑制小鼠体内肿瘤的生长和延长荷瘤小鼠的平均生存期。
[0033]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
【权利要求】
1.一种神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗，其特征在于:该疫苗为？八110154_162表位肽、FATlO155.表位肽、FAT1049_57表位肽与Tim-3基因重组表达载体的复合物； 所述FATlO154.表位肽由表位FAT10154_162、穿膜序列HIV-Tat40-48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成； 所述FAT10155_163表位肽由表位FAT10155_163、穿膜序列HIV-Tat40-48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成； 所述FAT1049_57表位肽由表位FAT1049_57、穿膜序列HIV_Tat40_48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成； 在所述FAT10154_162表位肽、FATlO155^163表位肽和FAT1049_57表位肽中，穿膜序列均位于氨基端，内质网滞留信号序列均位于羧基端，表位与穿膜序列或内质网滞留信号序列之间均以接头序列连接。
2.根据权利要求1所述神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗，其特征在于:所述接头序列为AAY。
3.根据权利要求1所述神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗，其特征在于:所述FATlO154^162表位肽、FATlO15H63表位肽和FATlO49^57表位肽的摩尔比为1:1:1。
4.根据权利要求1所述神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗，其特征在于:所述Tim-3基因重组表达载体是在真核表达载体PC1-neo中插入Tim-3 cDNA全长序列而得到。
5.权利要求1所述神经胶质瘤的双向调节治疗性疫苗的制备方法，其特征在于:在搅拌条件下，向溶解有Tim-3基因重组表达载体的磷酸盐缓冲液中滴加溶解有FAT10154_162表位肽、FAT10155_163表位肽和FAT1049_57表位肽的水溶液，滴加完毕后继续搅拌60分钟，再静置60分钟，即得。
6.根据权利要求5所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗的制备方法，其特征在于:所述FATlO154.表位肽、FATlO15H63表位肽和FATlO49^57表位肽摩尔比为1:1:1。
【文档编号】A61P35/00GK103933557SQ201410177222
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】袁邦清, 杨曌, 沈汉超, 吴贤群, 陈羽建, 林立 申请人:中国人民解放军南京军区福州总医院四七六医院