一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物及其提取方法
【专利摘要】一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物，其提取方法为将楮实子置于烘箱中烘干，并将烘干后的楮实子研磨成粉末，以1∶10(g／g)的比例加入石油醚震荡5h，然后抽滤，再将滤渣置于通风橱内去除残余石油醚，收集脱脂后的楮实子，将脱脂楮实子以8倍、6倍量加水提取2次，再抽滤并收集滤液，真空抽滤5次，合并5次获得的滤液并减压浓缩至1g生药/mL，药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇，至终浓度为70%，密闭冷藏48h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液，再行离心沉淀获得提取物。通过体内外药理实验证实，本发明提取物对小鼠移植性肝癌H22具有抑制作用，能延长EAC腹水瘤小鼠生存期，对人肝癌细胞HepG2生长具有抑制作用。
【专利说明】一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物及其提取方法
一、【技术领域】
[0001]本发明涉及中草药【技术领域】，具体地说是涉及一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物及其提取方法，它是从楮实子中提取的一种有效物质，通过体内动物实验及体外细胞实验证实具有抗肝癌活性。
二、【背景技术】
[0002]原发性肝癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，年死亡率居恶性肿瘤第二位，国际癌症研究中心(IARC)估计2000年全球肝癌发病56.4万,肝癌死亡54.9万,其中中国肝癌发病30.6万，死亡30.0万。有资料显示，肝癌患者出现临床症状后生存期平均6月左右，单纯手术费用在2万元左右，还有术后的抗感染、并发症处理等，费用难以确定，化疗或者介入手术I次在I万元左右，若出现副反应、并发症、继发症等，则后续费用巨大。尽管费用高昂，疗效仍很低，5年生存率低于12%。中医药治疗肝癌有长期的临床实践基础，通过辨证施治，从整体上改善患者的临床症状，提高其生活质量，而且来自天然植物的中药，药源充足，相对价格低廉，毒副作用小，患者依从性好，具有良好的开发前景。
[0003]本发明人长期从事中医药抗肝癌研究，继承发扬名老中医抗肝癌的临床经验，已开展多项抗肝癌有效验方的临床与实验课题研究，并于2007年获得发明专利“一种利湿抗癌药物和制备方法及在制备抗癌药物中的应用”，证书号第358825号，专利号ZL200410041407.5。在前期研究的基础上，本发明人从中药楮实子中提取到一种具有抗肝癌活性的有效物质，并通过了初步的动物及细胞实验验证。
[0004]中药堵实子(FructusBroussonetiae)始载于汉代《名医别录》，又名为堵实、榖实、榖子、堵桃，为桑科植物构树Broussonetia papyrifera(L.) Vent.的干燥成熟果实,主产于河南、湖北、山西、甘肃等地。楮实子味甘性寒无毒，具有滋肾益阴、清肝明目、利水消肿等功效，常用于治疗肝肾阴虚，骨蒸潮热，盗汗梦遗，头昏目眩，目昏翳障，水肿胀满，小便不利等症。刘汉基《药性通考》中云:“楮实子，阴痿能强，水肿可退，充肌肤，助腰膝，益气力，补虚劳，悦颜色，壮筋骨，明目”。楮实子果实含生物碱、皂甙(0.51 %)、维生素B及油脂。种子含油31.7%，油中含非皂化物2.67%，饱和脂肪酸9.0%，油酸15.0%，亚油酸76.0%。楮实子中含有17种氨基酸，以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量最高。以100g干燥样品粉末计算，楮实子总氨基酸含量为12.44g，人体必需氨基酸总量为3.92g。药理研究显示，楮实子具有抗氧化、抗老年痴呆、延缓衰老的作用，楮实子油能显著降低血脂，防治心血管疾病。一些药理实验显示，楮实子的相关成分有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，楮实子总生物碱浓度50 μ g/L时，药物对肿瘤细胞生长的抑制作用较明显，MTT法测得抑制率在20%以上，集落形成法测得抑制率在30%以上。而当药物浓度达到100μ g/L时，楮实子总生物碱显示出较为显著的肿瘤细胞抑制作用，两种方法的细胞生长抑制率分别在50%和60%以上。三、
【发明内容】
[0005]1、发明目的:提供一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物及其提取方法。
[0006]2、本发明目的是通过以下的技术方案来实现的:
[0007]—种具有抗肝癌活性的楮实子提取物，其特征是由中药楮实子烘干粉碎后水提醇沉而得到的提取物；
[0008]楮实子提取物的提取方法如下:
[0009](I)将楮实子置于烘箱中烘干，并将烘干后的楮实子研磨成粉末；
[0010](2)将楮实子粉末以1: 10的重量比加入石油醚震荡5h，然后抽滤；
[0011](3)将滤渣置于通风橱内去除残余石油醚，收集脱脂后的楮实子；
[0012](4)将脱脂楮实子以8倍、6倍量加水提取2次，再抽滤并收集滤液，反复滤取5次，合并5次获得的滤液并减压浓缩至Ig生药/mL ；
[0013](5)药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇，至终浓度为70%，密闭冷藏48h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液，再行离心沉淀获得提取物。
[0014]所述一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物，其特征在于该提取物是一种多糖成分，可以测定其含量。
[0015]所述一种具 有抗肝癌活性的楮实子提取物在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0016]3、有益效果:
[0017]本发明为从中药楮实子中获得的提取物，用于小鼠移植性肝癌H22，其高、中、低剂量对肿瘤生长的抑制率分别为57.76%,48.45%,40.37%，用于艾氏腹水癌腹水型小鼠，与对照组相比能明显延长荷瘤小鼠的生存期。体外细胞实验研究显示，本提取物高、中、低剂量对人肝癌细胞株IfepG2的抑制率分别为76.2%、70.5%、74.5%。
四、【具体实施方式】
[0018]实施例1:楮实子提取物的提取方法
[0019](I)将楮实子2000g置于烘箱中烘干，并将烘干后的楮实子研磨成粉末；
[0020](2)将楮实子粉末2000g以1: 10的重量比加入石油醚20Kg震荡5h，然后真空抽滤；
[0021](3)将滤渣置于通风橱内去除残余石油醚，收集脱脂后的楮实子，测得重量为1800g ；
[0022](4)将1800g脱脂楮实子加水14.4L提取I次后抽滤并收集滤液，再加水10.8L提取I次并收集滤液，分别滤取5次，合并5次获得的滤液并减压浓缩至Ig生药/mL ；
[0023](5)药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇，至终浓度为70%，密闭冷藏48h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液，再行离心沉淀获得楮实子提取物。
[0024]实施例2:楮实子提取物中多糖含量测定
[0025]I配制葡萄糖标准储备液
[0026]精确称取1050C干燥恒重的无水葡萄糖，对照品15mg，置100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即得葡萄糖标准储备液，每1ml中含无水葡萄糖0.15mg。
[0027]2制备标准曲线
[0028]精密量取对照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5ml，分别置于IOml容量瓶中，加去离子水3.0ml，各精密加入5%甲苯酚溶液1ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5ml，摇匀，放置lOmin，置400C水浴中保温15min，取出后迅速冷却至室温，加入定容至刻度，摇匀，以相应的实际为空白，照紫外-可见分光光度法，在490nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，作图得标准曲线，计算回归方程。
[0029]3计算多糖含量
[0030]取提取物0.2mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加水振摇并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液。精密量取滤液1ml，置IOml容量瓶中，加水3.0ml，照前法测定吸光度，样品平行测定6次，代入回归议程，计算多糖含量。
[0031]实施例3:楮实子提取物对小鼠移植性肝癌H22生长的作用
[0032]昆明种健康成年小鼠60只，雄性，体重18_22g，空白组10只，以下法造模:将冻存的腹水型肝癌细胞株H印s复苏，体外培养传代至对数生长期后进行离心，PBS缓冲液冲洗后，生理盐水4倍稀释，充分混匀，于每只小鼠右前肢腋窝下皮下注射0.2ml,接种完成后正常饮食饲养，造模后24h将50只小鼠按照随机数字表法分为模型组、阳性药物组(5-Fu，20mg/kg)、楮实子提取物高、中、低剂量组。接种后第5天开始给药，各组小鼠以0.lmL/10g体重腹腔注射，隔天I次，共给药5次，模型组给予生理盐水，阳性药物组按小鼠体重20mg/kg给予5-Fu,堵实子提取物高、中、低剂量组剂量分别为100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg。第15d颈椎脱臼法处死小鼠，摘眼球取血。检测小鼠体重、瘤重、抑瘤率、血清ALT、AST、Urea、Crea、脾脏及胸腺指数。
[0033]表1小鼠用药前、用药中期、处死前体重变化(X 士SD,单位:g)
[0034]
【权利要求】
1.一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物，其特征是由中药楮实子烘干粉碎后水提醇沉而得到的提取物； 楮实子提取物的提取方法如下: (1)将楮实子置于烘箱中烘干，并将烘干后的楮实子研磨成粉末； (2)将楮实子粉末以1: 10的重量比加入石油醚震荡5 h，然后真空抽滤； (3)将滤渣置于通风橱内去除残余石油醚，收集脱脂后的楮实子； (4)将脱脂楮实子以8倍、6倍量加水提取2次，再抽滤并收集滤液，反复滤取5次，合并5次获得的滤液并减压浓缩至Ig生药/mL ； (5)药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇，至终浓度为70%，密闭冷藏48h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液，再行离心沉淀获得提取物。
2.根据权利要求1所述一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物，其特征在于该提取物是一种多糖成分，可以测定其含量。
3.如权利要求 1所述一种具有抗肝癌活性的楮实子提取物在制备治疗肝癌药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103989745SQ201410199454
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】彭海燕 申请人:南京中医药大学