一种间充质干细胞体外向黑素细胞定向分化诱导的方法

一种间充质干细胞体外向黑素细胞定向分化诱导的方法
【专利摘要】本发明涉及一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，具体涉及的是一种脐带来源的间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，属于生物【技术领域】。本发明通过采用植块法培养脐带来源的间充质干细胞，然后将获得的脐带来源的间充质干细胞的进行鉴定，确定其具有间充质干细胞的特性，确定之后用改良后的黑素诱导培养基体外诱导分化为黑素细胞，最近对培养后得到的黑素细胞进行鉴定。ES细胞来源及骨髓或脂肪间充质干细胞来源有限或不易获得，而本发明中脐带容易获得，免疫原性极低，不易产生个体差异，适合大批量规模化应用于临床；诱导的黑素细胞有可能应用到白癜风治疗。
【专利说明】一种间充质干细胞体外向黑素细胞定向分化诱导的方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，具体涉及的是一种脐带来源的间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，属于生物【技术领域】。

【背景技术】
[0002]白癜风(vitiligo)是一种常见的局部或全身色素脱失性皮肤病，该病发病率约为0.5-1%,与遗传因素、免疫因素、氧化应激失衡等均有关系，目前公认的观点是综合因素引起的黑素细胞被破坏，从而引起的色素脱失，及白斑形成。该病治疗方法很多，如药物，激光，手术等，但疗效均不确切，有的甚至出现同形反应。
[0003]近年来干细胞移植治疗疾病的方法受到了越来越多的关注，利用干细胞的高增殖和多向分化潜能，使之在患者体内分化成目标细胞并替代病变细胞的功能，从而改善和阻止病情的发展。
[0004]种子细胞的选择是细胞移植治疗疾病的关键，目前采用胚胎干细胞(ES)、骨髓来源的间充质干细胞及脂肪来源的间充质干细胞来诱导分化为黑素细胞。现有技术的客观缺点:ES细胞来源及骨髓或脂肪间充质干细胞来源有限或不易获得，人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)与其他来源的间充质干细胞相比，原始性及自我更新和增殖能力更强；免疫原性低，不会触发免疫反应；取材方便，纯度高且无病毒及肿瘤细胞的污染，鉴于这些其他来源的间充质干细胞无可比拟的优势，脐带间充质干细胞在科研及临床中有着广泛的应用前旦
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[0005]目前，hUC-MSCs从脐带的获取主要是从脐带华通氏胶，但其分离和培养方法没有标准的步骤，不同实验室有不同的方法，主要有酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法是利用胶原酶将脐带中的胶原纤维降解，从而分离出细胞。酶消化法可在较短时间内获得原代细胞，但该方法步骤多，极易对细胞产生化学污染和机械损伤；酶的浓度及消化时间不好掌握，且使用的胶原酶价格昂贵，因此不适合规模化生产。
[0006]组织块贴壁法主要是利用小块脐带组织中间充质干细胞对塑料培养瓶具有较强的粘附能力，可以在组织块贴壁培养过程中逐步迁移出，而组织块中内皮细胞及造血系细胞等不贴壁，可以在培养换液过程中被逐渐弃去。该方法步骤简单快捷，减少了细胞机械损伤和化学污染的概率，能更好地保持细胞的活力，同时省去了酶的使用，减少了经济成本，也适合规模化生产，因此植块法比酶消化法有更多的优点。而文献报道未见将hUC-MSCs诱导分化为黑素细胞。
[0007]


【发明内容】

[0008]本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，本发明通过采用植块法培养脐带来源的间充质干细胞，采用改良后的黑素诱导液，诱导其体外定向分化为黑素细胞。
[0009]本发明的间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，包括如下步骤:脐带组织块的获取；原代脐带来源的间充质干细胞的培养、细胞的传代培养；获得的脐带来源的间充质干细胞的鉴定；体外诱导分化为黑素细胞，黑素细胞的培养及鉴定。
[0010](I)其中所述的脐带组织块的获取的步骤包括:
A.手术台获取人脐带后，将其浸没于0.9%灭菌生理盐水中，无菌运输至实验室。
[0011]B.在超净台取出，含1%双抗(青霉素和链霉素)PBS缓冲液洗涤3次，以除去血溃和充分清洗脐静脉管腔，剥离掉动静脉，取脐带结缔组织，剪为4-5mm3大小的组织块。
[0012](2)所述的原代脐带来源的间充质干细胞的培养、细胞的传代培养步骤包括:
A.接种组织块于6孔细胞培养板内板内预先加0.5-lmL的DMEM/F12 (1:1)
培养基(含10%胎牛血清(FBS))，置培养板于细胞培养箱内培养(37 °C、5%体积C02饱和湿度)。
[0013]B.细胞培养24h后首次换液，以后每2-3d换液一次，培养12_14 d后原代细胞长出并长满60%后去除组织块。
[0014]C.hUC-MSCs的传代培养:置培养板于细胞培养箱内培养，条件温度37 V，
5%C02饱和湿度，24h后首次换液，以后每2-3d更换培养基，显微镜观察细胞形态并拍照。
[0015](3)获取的hUC-MSCs分别进行免疫表型和成脂成骨等检测，以证实其具有间充质干细胞的特性。
[0016](4)所述体外诱导分化为黑素细胞，黑素细胞的培养步骤包括:
将hUC-MSCs细胞传代后接种于24孔板，使用DMEM/12培养基(含10%FBS)培养细胞至70%融合后，更换黑素诱导培养基诱导培养，2天换液一次，细胞达60%融合时传代，连续诱导培养9周。
[0017]其中改良的黑素诱导液，包括50ng/mL SCF、20%MCDB201、4ng/mL bFGFUOOnMEDN3、50% L-Wnt3a 上清、20pM cholera toxin,0.05 μ M 地塞米松、50nM TPA、20% 低糖DMEM、1X胰岛素铁硒传递蛋白、104M L-抗坏血酸、I mg/mL亚油酸-牛血清白蛋白。
[0018](4)鉴定由hUC-MSCs体外向黑素细胞分化后的细胞，以确定诱导分化后得到的细胞具有黑素细胞的特性。
[0019]本发明的技术优点
(1)ES细胞来源及骨髓或脂肪间充质干细胞来源有限或不易获得，而脐带容易获得，免疫原性极低，不易产生个体差异，适合大批量规模化应用于临床；
(2)诱导的黑素细胞有可能应用到白癜风治疗。

【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1.植块法培养原代hUC-MSCs形态学观察图；图中，(a)为脐带组织块贴壁培养图示；(b)为原代hUC-MSCs长出后的形态观察(x40); (c)为原代细胞集落流水状生长状态(x40);⑷为P3代细胞长满培养基的50% (x40)。
[0021]图2.人脐带间充质干细胞成脂诱导后的形态(油红O染色’40) ； Ca)为对照组；(b)为诱导组。
[0022]图3.人脐带间充质干细胞成骨诱导后的形态(茜素红染色’40) ； Ca)为对照组；(b)为诱导组。
[0023]图4.hUC-MSCs向黑素细胞诱导过程中光镜下细胞形态变化图示；(a)为诱导前；(b)为诱导3周后；(C)为诱导5周后；(d)为诱导9周后。
[0024]图5.hUC-MSCs在向黑素细胞分化过程中黑素相关基因的相对表达图(*:P<Q.05)；
图6.hUC-MSCs来源的黑素细胞抗S-100，HMB45免疫细胞化学染色结果(X200);图中，(a)为对照组S-100的表达，呈阴性；(b)为诱导组S-100的表达，呈阳性；(c)为对照组HMB45的表达，呈阴性；(d)为诱导组HMB45的表达，呈阳性。
[0025]图7.hUC-MSCs来源的黑素细胞抗MITF，S0X10免疫荧光图(X 200);图中，(a)为MITF免疫荧光；(b)为S0X10免疫荧光。

【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。
[0027]脐带来源的间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，按照以下步骤完成:
(I)植块法培养原代hUC-MSCs (传代培养及形态学观察)
A.手术台获取人脐带后，将其浸没于0.9%灭菌生理盐水中，无菌运输至实验室。
[0028]B.在超净台取出，含1%双抗(青霉素和链霉素)PBS缓冲液洗涤3次，
以除去血溃和充分清洗脐静脉管腔，剥离掉动静脉，取脐带结缔组织，剪为4-5mm3大小的组织块。
[0029]C.接种组织块于6孔细胞培养板内，板内预先加0.5-lmL的DMEM/F12 (I:
I)培养基(含10%FBS)，置培养板于细胞培养箱内培养(37°C、5%体积C02饱和湿度)。
[0030]D.细胞培养24h后首次换液，以后每2-3d换液一次，培养12_14 d后原代细胞长出并长满60%后去除组织块。
[0031]原代hUC-MSCs传代培养的形态学观察如图1所不。
[0032](2) hUC-MSCs多向分化潜能检测(成骨细胞及成脂细胞诱导分化):检测获得的细胞具有干细胞特性。
[0033]A.hUC-MSCs向脂肪细胞诱导分化:
第3代hUC-MSCs胰酶消化后接种于6孔细胞培养板中，细胞密度适中，设成脂诱导组3孔，对照组3孔。
[0034]细胞培养生长到80%融合时换成脂诱导液:含10%FBS的高糖DMEM 100 mg/L的IBMX，ImM地塞米松，50mM吲哚美辛，1mM胰岛素，对照组加常规细胞培养液。
[0035]诱导期间每隔2-3天换液一次，诱导周期为2周，诱导结束后镜下观察细胞形态变化及脂滴形成情况并进行油红染色法鉴定，显微镜下观察并照相，结果如图2所示。
[0036]B.hUC-MSCs向成骨细胞诱导分化
第3代hUC-MSCs胰酶消化后接种于6孔细胞培养板中，细胞密度适中(以105/mL为宜)，设成骨诱导组3孔，对照组3孔。
[0037]细胞培养贴壁生长到80%融合后换成骨诱导液:含10%FBS高糖DMEM，1mmol/Lb-磷酸甘油，200mmol/L抗坏血酸,1.0mmol/L地塞米松，对照组加常规细胞培养液。
[0038]成骨诱导时间为2周，诱导期间每2-3天换液一次，2周后茜素红染色鉴定，倒置相差显微镜观察照相，结果如图3所示。
[0039](3) hUC-MSCs向黑素细胞诱导分化
第3代hUC-MSCs细胞传代后接种于24孔板，使用DMEM/12培养基(含10%FBS)培养细胞至70%融合后，对照组继续培养，诱导组更换黑素诱导培养基:50ng/mL SCF,20%MCDB201,4ng/mL bFGF, 10nM EDN3,50% L_Wnt3a 上清，20pM cholera toxin, 0.05 μ M地塞米松，50nM TPA, 20%低糖DMEM，I X胰岛素铁硒传递蛋白，104M L-抗坏血酸，I mg/mL亚油酸-牛血清白蛋白，2天换液一次，细胞达60%融合时传代，连续诱导培养9周。
[0040](4)从以下几方面证明诱导分化后得到的细胞具有黑素细胞的特性:
A.诱导期间hUC-MSCs生长及形态观察
在hUC-MSCs向黑素细胞诱导分化过程中，细胞形态3周后逐渐变为更细长的梭形，胞质丰富，透明度下降，5周后，部分细胞逐渐伸展并出现双极化及多极化，9周后，贴壁细胞形态多样化，以多极化形态为多见，类似黑素细胞的树突状结构，结果如图4所示。
[0041]B.RT-PCR检测相关基因表达
hUC-MSCs在向黑素细胞诱导的第3，5，7，9周后，与对照组比较，诱导组黑素细胞相关基因MITF，TYRPI, S0X10, MClRmRNA的表达随时间的增加均显著提高，0°〈0.05)，结果如图5所示
C.免疫化学染色
诱导组细胞形态呈双极化及多极化的类黑素细胞树突状结构，HMB45及S-100染色后胞体及树突被染成棕褐色，呈阳性，对照组细胞形态为长梭形，与诱导组有明显差异，s-100, HMB45染色呈阴性，结果如图6所示。
[0042]D.免疫荧光染色
诱导组细胞经FITC标记的二抗孵育后，MITF, S0X10均显示绿色荧光，阳性表达，对照组则阴性表达，结果如图7所示。
【权利要求】
1.一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，其特征在于，包括如下步骤:脐带组织块的获取；原代脐带来源的间充质干细胞的培养、细胞的传代培养；获得的脐带来源的间充质干细胞的鉴定；体外诱导分化为黑素细胞，黑素细胞的培养及鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，其特征在于，所述的间充质干细胞来源于脐带。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，其特征在于，所述的脐带组织块的获取的步骤包括:手术台获取人脐带后，将其浸没于0.9%灭菌生理盐水中，无菌运输至实验室；在超净台取出，含1%双抗(青霉素和链霉素)PBS缓冲液洗涤3次，以除去血溃和充分清洗脐静脉管腔，剥离掉动静脉，取脐带结缔组织，剪为4-5mm3大小的组织块。
4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，其特征在于，所述的原代脐带来源的间充质干细胞的培养、细胞的传代培养步骤包括:接种组织块于6孔细胞培养板内板内预先加0.5-lmL的DMEM/F12培养基，置培养板于细胞培养箱内培养，培养条件为37 °C、5%体积C02饱和湿度；细胞培养24h后首次换液，以后每2-3d换液一次，培养12-14 d后原代细胞长出并长满60%后去除组织块；hUC-MSCs的传代培养:置培养板于细胞培养箱内培养，条件温度37 V,5%C02饱和湿度，24h后首次换液，以后每2-3d更换培养基，显微镜观察细胞形态并拍照。
5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，其特征在于，所述体外诱导分化为黑素细胞，黑素细胞的培养步骤包括:将hUC-MSCs细胞传代后接种于24孔板，使用DMEM/12培养基培养细胞至70%融合后，更换黑素诱导培养基诱导培养，2天换液一次，细胞达60%融合时传代，连续诱导培养9周。
6.根据权利要求4或5所述的一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，其特征在于，所述DMEM/F12培养基中DMEM和F12的比例为1:1;所述DMEM/F12培养基中含10%胎牛血清。
7.根据权利要求5所述的一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，其特征在于，所述黑素诱导培养基成分包括50ng/mL SCF、20%MCDB201、4ng/mL bFGFUOOnM EDN3、50% L_Wnt3a 上清、20pM cholera toxin,0.05 μ M 地塞米松、50nMTPA、20%低糖DMEM、1X胰岛素铁硒传递蛋白、104M L-抗坏血酸、I mg/mL亚油酸-牛血清白蛋白。
8.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞体外向黑色素细胞定向分化诱导的方法，其特征在于，所得到的黑素细胞用于白癜风的治疗。
【文档编号】A61K35/12GK104232574SQ201410467521
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】李遇梅, 李小战, 李兴天, 刘莉萍 申请人:江苏大学附属医院