云南松松塔提取物用于制备抗肿瘤药物的用途
【专利摘要】本发明“云南松松塔提取物用于制备抗肿瘤药物的用途”涉及云南松松塔提取物用于制备防治肿瘤疾病的药物的用途。具体而言，本发明涉及松科松属植物云南松Pinus yunnanensis Fr.的球果以乙醇溶液浸泡、热水提取、碱水室温提取后的滤液再醇沉提取而得的有效部位及其用于制备抗肿瘤药物的医药用途。该有效部位提取物具有明显的抑制人肝癌细胞增殖的功能，且对人正常肝细胞的毒性非常小，可以预期发展成为防治肿瘤疾病的药物。
【专利说明】云南松松塔提取物用于制备抗肿瘤药物的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药【技术领域】，具体而言，本发明涉及云南松属植物的松塔提取物用 于制备抗肿瘤药物的医药用途。该松塔提取物由松科松属植物云南松Pinusyunnanensis Fr.的球果以乙醇溶液浸泡、热水提取、碱水室温提取后的滤液再醇沉提取而得，其具有细 胞毒活性和抗肿瘤功能，可以预期发展成为防治肿瘤疾病的药物。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着生活水平的提高、生态环境的改变及生活压力增大，癌症已成上升趋 势。其中肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症的第三大死亡原因，其恶性度极高、 进展迅速、预后差，严重危害人类生命和健康。肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，全世界每 年新发肝癌患者约60万，而我国是肝癌发病大国，发病人数占全球的55% ;中国每年大约 有13万人死于肝癌，占全球肝癌死亡总数的40%。
[0003]肝脏只有表面包膜具有神经，癌细胞侵入包膜内才会引起痛感，而且肝脏只要剩 下1/5仍可维持正常功能，因此肝脏破坏了 80%时，才会产生肝功能失调症状，故肝癌确诊 时基本属于中晚期，而且肝脏的血液供应丰富，容易在器官内外作血源性转移，导致治疗上 的困难。目前临床上治疗肝癌常用手术、化疗和放疗的方式，但是由于肝癌被发现时多为晚 期且术后复发率较高，因此手术切除的比例并不高，而放疗与化疗效果不太理想并且在杀 灭癌细胞的同时对患者机体也会造成损害，毒副反应大且预后较差，疗效不佳。因此寻找新 型治疗肝癌的药物，延长患者生存期、降低复发率、提高生命质量有重要的意义；而加强对 抗肝癌药物的研究显得尤为迫切。
[0004] 中药具有多靶点、多途径的协同作用，在癌症放化疗的减毒增效及术后防复发转 移等方面独具优势。因此，从中草药中寻找高效低毒的抗癌药物具有极其重要的现实意 义。松属植物全世界约有100种，分布于北半球直达极圈，在热带和亚热带地区只生于山 地。我国有50余种松属植物，分布极广。云南产松树主要有六种，包括：①华山松（Pinus armandiiFranch)，山西、陕西、贵州、四川、甘肃等省亦有分布；②乔松（P.griffithii M'delland);③毛枝五叶松（P.wangiiHu);④马尾松（P.massoniaLamb·),四川也产；⑤ 云南松（P.yunnanensisFr.)，四川、广西也有分布；⑥思茅松（P.szemaoensisChenget Lau)，特产于云南思茅。松树松塔、松子壳与松子仁中的成分包括廠类、木质素、黄酮、苗类、 挥发油、维生素类、棕榈碱、矿物质、多糖、蛋白质与脂肪等。长期以来，松子仁作为营养食 品，或称长寿食品、仙人食品，而松塔、松子壳则仅作农家燃料。
[0005] 日本南部九州地区民间长期用日本白松（PinusparifloraSieb.etZucc)松塔 煎水喝治疗胃癌；在我国，仅白皮松（Pinusbungeana)松塔为药典用药。白皮松松塔性 温味苦，祛痰、止咳、平喘，主治慢性气管炎、哮喘、咳嗽痰多。日本学者SakagamiH.等对 日本白松松塔的抗肿瘤活性研究中发现，其热水提取物可以对移植到小鼠体内的各种实体 瘤和腹水肿瘤细胞产生抑制作用；同时发现日本白松松塔热水提取物能够激活小鼠巨嗜 细胞；Sakagami等学者还发现日本白松松塔的提取物有抗HIV的功效（发明专利申请号： EP88110142A)。我国吕永俊教授等在对国内的油松、红松等松树的活性成分研究中发现， 松塔和松子壳的水提取物对S180 (实体瘤）、U14 (宫颈癌）有一定的抑瘤作用，但其对H印 A(肝癌腹水型）细胞则无抑制作用，且其活性强度具有种的差异。根据中外文献检索查询， 除上述对日本白松松塔、中国油松和东北红松的水提物抗肿瘤活性研究外，未见对上述各 种松塔的抗肝癌药理活性及毒性方面的研究，也未见来源于其它树种的松塔具有抗肿瘤活 性的相关报导。此外，上述公开资料显示该类抗肿瘤活性的松塔提取物为热水提取的大分 子酸性多糖，其提取工艺中未涉及乙醇。
[0006] 发明人所在研究团队在对松塔的系列研究中发现：用乙醇溶液浸泡、热水提取、碱 水室温提取后的滤液再醇沉提取云南松属植物的松塔，可以得到具有抗艾滋病毒活性的有 效部位（刘光明，赵昱，李冬梅，李春艳等，国家发明专利ZL201010117327.9)。在发明人 对天然产物抗肿瘤活性的系统研究中发现，以该专利公开的制备方法得到的云南松松塔提 取物具有明显的抗肿瘤活性。我们以两株人肝癌细胞（HepG2、Huh-7)和一株正常肝细胞 (人肝细胞L-02)对云南松松塔的粗粉、云南松松塔总提取物、云南松松塔碱提醇沉提取物 的细胞生长抑制活性进行检测，寻找到具有细胞毒活性的云南松松塔抗肿瘤有效部位。实 验结果显示：本发明涉及的云南松松塔提取物具有显著的抑制肝癌细胞增殖的活性，可以 预期发展为抗肿瘤药物。查新结果显示，以往均无以云南松松塔碱水提取后醇沉的提取物 作为主药进行配制的抗肿瘤药物的相关报道。云南省具有丰富的云南松资源，云南农民在 采收松子后一般将松塔废弃或当做燃料烧掉，若能从中提取活性成分，变废为宝，不仅能为 山区农民致富提供良机，更能为肿瘤疾病的防治提供新的选择。因此，将云南松的松塔按现 代工艺进行提取分离并寻找其有效抑制肿瘤生长的有效部位既有巨大的社会效益又有显 著的经济效益。在进行了一系列相关研究后，我们发现了一种十分经济有效的具有抗肝癌 活性的云南松松塔提取物，从而构成本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供云南松松塔提取物用于制备防治肿瘤疾病的药物的用途， 并公开了该提取物的制备方法。
[0008]具体而言，本发明中云南松松塔具抑制肿瘤细胞增殖活性的有效部位提取物的制 备方法参照国家发明专利ZL201010117327. 9公开的松塔有效部位提取物的制备，如下： 用乙醇溶液浸泡经粉碎的云南松松塔、热水提取、碱水室温提取后的滤液再醇沉提取，得到 的有效部位经减压浓缩至无醇味、干燥得产品。
[0009] 本发明中的云南松松塔是指松科松属植物云南松PinusyunnanensisFr.的成熟 球果。
[0010] 经药效学研究证明，本发明的云南松松塔提取物对人肝癌细胞0fepG2、Huh-7)均 有增殖抑制作用（P< 0.05)，且随着浓度增加，抑制作用增强，具有剂量效应关系。高浓度 下，云南松松塔提取物对人肝正常细胞（L-02)的存活率分别为73. 19^^71.91%,其余浓 度下对L-02细胞无毒性作用。通过实验结果得出，云南松松塔提取物有抗肝癌活性，且在 高浓度下对正常人肝细胞毒性小。
[0011] 本发明的云南松松塔具有细胞毒性的有效部位提取物可以与现已上市的抗肿瘤 药物如钼类药物顺钼（DDP)、喜树碱类药物伊立替康（Irinatecan，CPT-11)、长春花碱类 药物失碳长春花碱（Vinorebine，NVB诺维本）、脱氧胞昔类药物吉西他滨（Gemcitabine，Gemzar，健择）、足叶乙式（Etoposide)、紫杉醇（Paclitaxel)等联合使用，制备得到具有抑 制肿瘤生长活性的细胞毒性药物组合物，可用于治疗肿瘤疾病。该类药物组合物可以采用 注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，还可以采 用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用于治疗肿瘤疾 病、延缓肿瘤恶化、延长肿瘤病人生存时间等用途。本发明所述的药物组合物是由云南松松 塔碱提醇沉提取物、现已上市的抗肿瘤药物和药学上应用的各种制剂辅料，通过合理组合 制成的用于医疗目的的制剂。
[0012] 至今为止，以往文献中并未发现针对云南主产的云南松松塔碱提醇沉提取物用于 制备抗肿瘤药物的研究及相关报道，本针对性的研究尚属首次，其具有显著的抑制体外培 养人体肿瘤细胞生长的活性也属于意想不到的结果，因而可以预期进一步开发成为治疗肿 瘤疾病的药物或药物组合物。据此完成本发明。
[0013] 本发明的有益之处是：云南松松塔提取物具有强效抑制人肝癌细胞株（HepG2、 Huh-7)生长的活性，该提取物可以预期应用于制备新的抗肿瘤药物，为开发新的创新型抗 癌药物提供了新的物质基础。云南松属植物自然资源丰富，本发明提取物原料云南松松塔 资源丰富易得，提取工艺简单、成分及药效稳定，容易实现产业化。此外，对松塔的开发应用 属于变废为宝，产业化的成本低廉，且有希望研发出一种对边疆经济发展有重大推动作用 并对癌症，尤其是肝癌，防治提供有效策略的抗肿瘤新药。 具体实施方案
[0014] 为了更好地理解本发明的实质，下面分别用云南松松塔提取物对两株肿瘤细胞株 和一株正常细胞株细胞生长的抑制作用实验结果，说明其在抗肿瘤药物研究领域中的新 用途。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。除非另有说明，本发明中的百分 数是重量百分数。
[0015] 必须说明的是：本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据 本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0016] 实施例1:云南松松塔提取物对人肝癌细胞（HepG-2细胞株）的细胞毒活性试验
[0017] I. 1云南松松塔提取物的制备：
[0018] 云南松松塔采自云南省大理白族自治州漾濞县，经大理学院生药教研室夏从龙教 授鉴定为松科松属植物云南松PinusyunnanensisFr.的球果，取云南松松塔晒干备用。
[0019] 云南松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95%的乙醇溶液浸泡24小时，重复3 次，过滤。残渣用沸水提取2小时，重复3次；再用1 %氢氧化钠溶液室温提取，过滤。滤液 用10 %醋酸溶液调pH值至5,过滤。滤液用1倍量95%的乙醇溶液沉淀，过滤，得沉淀物 D。滤液再用2倍量95 %的乙醇溶液沉淀，过滤，得沉淀物E。滤液再用5倍量95 %的乙醇 溶液沉淀，过滤，得沉淀物F。合并沉淀物D、E、F，并用无水乙醇、乙醚依次洗涤，在40°C减 压干燥，得云南松的松塔提取物15. 21克（样品编号：YNS)。
[0020] 1. 2细胞毒性试验：
[0021] 1.2.1仪器与材料
[0022] (1)仪器：无菌操作台（Yj-1450型）购自苏州安泰空气技术有限公司；倒置相 差显微镜（OlympusIX-7型）；水套式CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司；高压灭菌器(Es-315型）购自日本Tomykogyo公司；连续波长酶标仪购自BIO-Tek公司。
[0023] ⑵材料：云南松松塔提取物（样品编号：YNS);顺钼（DDP)，粉针剂（山东罗欣药 业股份有限公司）；DMEM培养基及胎牛血清（FBS)购自Gibco公司；0. 25%胰蛋白酶购自Thermo公司；噻唑蓝（MTT)、Hepes和二甲基亚砜（DMSO)购自Sigma公司；0. 22μm微孔滤 膜购自Millipore公司。
[0024] (3)细胞株：人肝癌细胞!fepG-2细胞株，购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。
[0025]L2. 2 方法
[0026] (1)细胞接种：取H印G-2细胞，用含10%灭活FBS的DMEM培养基在37°C、5%二 氧化碳培养箱中培养，取对数生长期的上述细胞，用〇. 25%胰酶消化后，离心，弃去上清液； 用完全培养基将细胞浓度调至IXIO4个/毫升，接种于96孔板，每孔150微升，置于37°C、 5 %二氧化碳培养箱中培养。
[0027] (2)测试样品YNS对H印G-2细胞增殖的抑制作用：分别在每个实验孔中加入不同 浓度的YNS样品和阳性对照DDP溶液，每个浓度设4个复孔，同时设置阴性对照组和空白 对照组。放入37°C，5%二氧化碳培养箱中培养72小时后，弃去上清液，加入5毫克/毫升 的MTT溶液，继续培养4小时后，分别加入DMSO溶液150微升/孔，待紫色结晶溶解后，在 570nm波长处检测各孔OD值，按下式计算抑制率。
[0028] 抑制率（％) = 100X[1_(0D实验-OD空白V(0D阴性-OD空白）]
[0029] (3)统计学处理：实验数据均采用SPSS(17. 0)统计软件进行处理，各组数据进行 ANOVA或t检验。
[0030] 1. 3 结果：
[0031] 实验结果见表1。从表中可知：与阴性对照组比较，阳性药物顺钼各浓度组对 !fepG2细胞均有显著的细胞生长抑制作用（P< 0. 01或0. 05)，且抑制作用表现出浓度依 赖性，说明本细胞毒活性试验有效可靠。与阴性对照组比较，YNS高剂量组（1000微克/毫 升），能有效抑制H印G2细胞的增殖（P< 0. 01);随着YNS浓度的降低，对人肝癌细胞株的 细胞生长抑制作用减弱，即抑制作用表现出浓度依赖性。结果表明，云南松松塔提取物对人 肝癌具有H印G2确切的细胞毒活性。
[0032] 表1作用72小时时YNS对HepG2增殖作用的影响
[0033]
【权利要求】
1. 云南松松塔提取物用于制备防治肿瘤疾病的药物的用途，其特征是：所述云南松松 塔提取物由下列方法制备得到； 取粉碎的云南松干燥松塔，以95%的乙醇溶液浸泡24小时，重复3次，过滤；残渣用沸 水提取2小时，重复3次；再用1 %氢氧化钠溶液室温提取，过滤；滤液用10%醋酸溶液调pH 值至5,过滤；滤液用1倍量95%的乙醇溶液沉淀，过滤，得沉淀物D ;滤液再用2倍量95% 的乙醇溶液沉淀，过滤，得沉淀物E ;滤液再用5倍量95%的乙醇溶液沉淀，过滤，得沉淀物 F ;合并沉淀物D、E、F，并用无水乙醇、乙醚依次洗涤，在40°C减压干燥，即得云南松松塔提 取物。
2. 根据权利要求1的用途，其特征是：所述肿瘤疾病是指肝癌。
3. 根据权利要求1的用途，其特征是：所述云南松松塔是指松科松属植物云南松Pinus yunnanensis Fr.的球果。
【文档编号】A61K36/15GK104398540SQ201410604593
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】李春艳, 刘熙, 李冬梅, 于冬梅, 彭友伦, 施贵荣, 杨敏, 张兰胜, 巫秀美 申请人:大理学院