重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的用途及用其制备的亚单位疫苗的制造方法与工艺

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的用途及用其制备的亚单位疫苗。

背景技术：
副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)属于巴斯德菌(Pasteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)，为革兰阴性细小杆菌，具有多种形态，定植于健康猪上呼吸道，属于正常菌群，在免疫抑制等特定条件下会引起猪格氏病(Glasser’sdis-ease，以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎为主要特征。近些年来由于猪场规模化养殖的快速发展，尤其是工厂集约化养殖，猪格氏病已经呈世界性流行和暴发，表现出突然死亡率、发病率和病死率较高，严重危害养猪业发展，并造成巨大经济损失。我国近年来才开始逐渐重视对副猪嗜血杆菌病的研究。副猪嗜血杆菌的血清型众多，目前已鉴别十五种血清型，还有15％-41％的未鉴定血清型，其中1，5，10，12，13和14为强毒株，而我国流行的血清型为4型和5。不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大，我们对其毒力因子及致病机理知之甚少，至今尚无有效的通用商品苗和敏感的诊断方法，该病尚未得到有效控制，给全球养猪业带来巨大的经济损失。我国至今没有像猪瘟兔化弱毒疫苗、伪狂犬基因缺失疫苗那样的成熟疫苗来针对副猪嗜血杆菌病，目前大多都是传统型灭活苗和弱毒苗，缺乏良好的保护力，导致临床病例多见。而灭活疫苗只能对同种血清型的菌株具有保护作用，缺乏交叉保护力。副猪嗜血杆菌血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了对具有高效交叉保护力疫苗的研制。亚单位疫苗同时具有活疫苗免疫效力高、交叉保护力强以及灭活苗的安全性好等优点，具有十分广阔的应用前景。大部分不能分型菌株副猪嗜血杆菌及其血清型的多样性影响了人们对于具有高效交叉保护力疫苗的研制。血红素结合蛋白(heme-bindingprotein，HbpA)是一种球蛋白，广泛存在于致病菌中。有研究发现HbpA蛋白分子中有一个或多个与血红素结合区域，具有结合、运输和传递血红素，参与机体代谢等生理功能，HbpA蛋白是一种重要的毒力因子，与细菌的致病性密不可分。在巴斯德菌科嗜血杆菌属的流感嗜血杆菌上的研究表明，HbpA蛋白是流感嗜血杆菌的一种重要的毒力因子，HbpA蛋白与血红素的利用有关。目前关于副猪嗜血杆菌HbpA蛋白的功能的研究报道较少，在已进行基因组测序的副猪嗜血杆菌SH0165中发现有两个HbpA基因，两个基因的大小均为1595bp。公开号为CN103288934A的专利申请公开了一种采用基因工程的方式重组表达HbpA基因(GeneID:7276898)的方法，但是，其制备的重组HbpA蛋白作为亚单位疫苗，对感染副猪嗜血杆菌的保护力不佳，其免疫保护效果仅50％。

技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的由重组HbpA蛋制备而成的亚单位疫苗。本发明首先提供了氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的重组HbpA2蛋白在制备预防副猪嗜血杆菌病的药物中的用途。优选地，所述药物包含致免疫有效量的重组HbpA2蛋白。本发明亚单位疫苗，它是由氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的重组HbpA2蛋白和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。优选地，所述疫苗包含致免疫有效量的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的重组HbpA2蛋白以及药学上可接受的辅料或者载体。优选地，所述的致免疫有效量为不低于0.1μg/ml。优选地，所述的辅料或者载体为免疫佐剂和/或防腐剂。所述佐剂为完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。所述防腐剂为硫柳汞。本发明还提供了前述的疫苗在制备副猪嗜血杆菌病的药物中的用途。其中，所述的预防副猪嗜血杆菌病的药物是通过注射的方式给药。本发明采用基因工程的方式重组表达得到的重组蛋白HbpA2具有良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，制成疫苗后，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，保护率高达70％，可以有效预防副猪嗜血杆菌病，临床应用前景良好。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1HbpA2基因的PCR扩增结果图。M:DNAmaker；1、2、3：PCR扩增产物；图2诱导时间优化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：诱导时间为：0、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h；图3IPTG诱导浓度优化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：IPTG:终浓度为：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L；图4诱导温度优化。M：蛋白maker；1、3、5、7：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导前；2：诱导温度为25℃；4：诱导温度为30℃；6：诱导温度为37℃；7：诱导温度为42℃；图5HbpA2蛋白在pET-39b-HbpA2(BL21)中表达的形式检测。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2：pET-39b-HbpA2(BL21)超声波破碎后；3：上清；4：沉淀；图6重组HbpA2表达的SDS-PAGE。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)诱导前；2：pET-39b(BL21)诱导后；3：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导前；4：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导后；5：HbpA2蛋白纯化后(100mmol/L咪唑洗脱)；图7重组蛋白Westernblotting；图8小鼠存活率与时间的关系。具体实施方式实验材料和试剂：副猪嗜血杆菌CVCC3361，来源于国家兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号：CVCC3361。大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。限制性内切酶、Ex-TaqDNA聚合酶、DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNAMarker、pMD19-Tsimple载体等均购自宝生物(大连)工程有限公司。细菌基因组提取试剂盒为Omega公司产品。预染蛋白Ladder为NEB公司产品。小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.2-7.4，高压蒸汽灭菌30min。上样缓冲液配方：50mMNaH2PO4,300mMNaCl,5mMimidazole,pH8.0。100mM咪唑洗脱液：50mMNaH2PO4,300mMNaCl,100mMimidazole,pH8.0。实施例1本发明副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的制备1、重组表达1.1HbpA2基因的克隆及表达载体的构建1.1.1...