一种杂合抗菌肽ce-pr及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新型杂合抗菌肽CE-PR及其制备方法和应用。本发明通过对猪源抗菌肽PR-39与cecropin P1的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽cecropin P1的N端19个氨基酸与抗菌肽PR-39的N端26个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker(GPG)，并对抗菌肽cecropin P1的N端中的1处氨基酸进行突变(K12N)，获得一种新型杂合抗菌肽CE-PR，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型杂合抗菌肽CE-PR基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。
【专利说明】-种杂合抗菌化CE-PR及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肤筛选【技术领域】，具体设及一种杂合抗菌肤及其应用。
【背景技术】
[000引抗菌肤（antibacterial P巧tides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的多肤， 是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止，已在许多生物包括动物、植物及原核生物中发 现600多种内源性抗菌活性肤。猪源抗菌肤PR-39佑enBank登录号；NM_214450. 1)由39个 氨基酸组成，是Agerbedh B等于1991年首先从猪肠道分离得到的。其富含精氨酸（Arg) 和脯氨酸（Pro)两种氨基酸残基，形成一种Pro-Arg-Pro结构，可能与细菌磯脂膜相互作用 有关。其N端26个氨基酸的合成肤相对抗菌肤PR-39本身来说对多种革兰氏阴性菌、阳性 菌的抑制作用更强。抗菌肤cecropin P1是从猪小肠分离出得到的，其含有31个氨基酸残 基，分子量是333抓a,不含半脱氨酸，不能形成分子内二硫键，有强碱性的N端和强疏水性 的C端，其中酷胺化的C端对其广谱抗菌作用极为重要。cecropin P1氨基酸序列与昆虫 cecropin A有64%相似性，与cecropin B有75%的相似性。对其二级结构的理论预测及 CD谱和二维核磁共振数据表明，其分子内含有两亲水性a -螺旋和疏水性a -螺旋，中间是 形成柔性弯曲的谷氨酸-甘氨酸佑lu-Gly)卷曲序列。研究表明，其螺旋-卷曲-螺旋结 构对保持高抗菌活性具有特殊的重要性。
[0003] 天然的抗菌肤在临床应用存在各种缺点，有的在对病原微生物高杀灭活性的同时 往往伴随着溶血作用，有的本身就对真核细胞有毒性（例如天然抗菌肤蛙皮素、防御素和 蜂毒素等）。随着对抗菌肤结构功能与杀菌机理研究的深入，人们开始尝试设计杀菌活力更 强、抗菌谱更广的新型杂合抗菌肤。杂合抗菌肤设计通常采用的方法是将不同来源抗菌肤 保守序列拼接，而后通过氨基酸替换等生物学修饰，W期抗菌活性高且溶血性低的新型抗 菌肤。目前，国内外已设计合成了许多种杂合肤，抑菌效果明显优于天然肤，且大大降低了 毒性和溶血性。总之，杂合肤的成功设计和应用对解决当前抗菌肤存在的问题有着重要意 义和实用价值
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种杂合抗菌肤CE-PR，从而弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明首先提供一种杂合抗菌肤CE-PR，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ；
[0006] 本发明的杂合抗菌肤CE斗R可用做畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制 剂。
[0007] 本发明还提供一种杂合抗菌肤CE-PR的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如 下：
[000引 1)根据杂合抗菌肤CE斗R的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肤 基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；
[0009] 2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达杂合抗菌肤CE斗R的重 组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出杂合抗菌肤CE-PR ;
[0010] 3)对重组表达的杂合抗菌肤CE斗R进一步浓缩、纯化后，测定效价。稀释分装，即 为抗菌肤制剂。
[0011] 本发明在对猪源抗菌肤PR-39与cecropin P1的氨基酸序列进行空间结构分析的 基础上，将抗菌肤cecropin P1的N端19个氨基酸与抗菌肤PR-39的N端26个氨基酸进 行拼接，中间加入蛋白Lingker(GPG)，并对抗菌肤cecropin P1的N端中的1处氨基酸进行 突变化12脚，获得一种新型杂合抗菌肤CE-PR，使其抗菌效力获得显著提高。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可W对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，该些修改和替换均落入本发明保护范围内。
[0013] 实施例1杂合抗菌肤CE-PR及其基因的获得
[0014] 1、利用生物软件对猪源抗菌肤cecropin P1 (GenBank登录号；AB186032)和抗菌 肤PR-39佑enBank登录号；NM_214450. 1)的氨基酸序列进行空间结构分析，选取抗菌肤 cecropin P1的N端具有a -螺旋结构的19个氨基酸为基础，并将其第12位疏水性氨基酸 替换成亲水性氨基酸赖氨酸化12脚，然后将其与抗菌肤PR-39抑菌活性较强的N端26个氨 基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker KPG)，获得一种新型杂合抗菌肤CE-PR，其氨基酸序 列为 SEQ ID N0:1。
[0015] 2、根据获得的新型杂合抗菌肤CE-PR的氨基酸序列SEQ ID NO: 1，按照毕赤酵母 基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型杂合抗菌肤CE-PR的核巧酸序列。并在其 N端引入Kex2酶切位点。两端引入化〇1和甜al酶切位点，W便于克隆入毕赤酵母表达载 体中。
[0016] 实施例2基因工程杂合抗菌肤CE斗R表达载体的构建与工程菌的获得
[0017] 1、将含抗菌肤基因的载体和酵母表达载体均用化〇1和甜al双酶切，酶切产物回 收并连接，进行PCR鉴定、测序。
[0018] 2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后 均匀涂布于含100 y g/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30°C解育3-5天。待YPDS平板上的 阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 y g/mL、500 y g/mL、1000 y g/ mL的YPDS选择平板，W在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
[0019] 3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 y g/mL Zeocin的YTO培养液中， 28 °C振摇培养18个小时。取此菌液按4 %体积比转接于5ml BMGY培养基中，28 °C摇振培养 18-2化左右，0D600值约为5-6。培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28°C继续摇振培 养。为了维持诱导表达，每隔2化补加100%甲醇使终浓度达1%。4她后，4°C 50(K)r/min 离屯、lOmin，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新 型杂合抗菌肤CE-PR的阳性菌株。
[0020] 实施例3发酵、纯化新型杂合抗菌肤CE-PR的制备
[0021] 1、发酵工艺
[0022] 1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1% -10%接种量接种于S角瓶，28-30°C， 20化/111111摇床培养16-2化后^5%-20%接种量接入1化发酵罐（实装培养基化)，温度 28-30°C，转速 500-1500r/min，培养基抑值 5. 0-6. 0,通气量 0. 1-1. 0VVM(1L 发酵液 Imin 通入的氧气量），溶氧>20 %情况下进行发酵，在培养18-2化后流加50 %甘油化，待溶氧突 然升至100 %时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-7化。
[002引 2)发酵结束后原罐蒸汽100°C灭菌10-20min，放料，5000r/min离屯、lOmin，收集发 酵上清即为抗菌肤半成品。
[0024] 如新型抗菌肤制剂
[0025] 抗菌肤半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和W生化方法精制、纯 化后得到液体制剂。
[0026] 上述基因工程抗菌肤可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
[0027] 实施例4新型杂合抗菌肤CE-PR的最小抑菌浓度测定（MIC)
[002引 1、试验菌株
[0029] 金黄色葡萄球菌（Cowan I)、猪金黄色葡萄球菌肠毒素75-1、大肠杆菌K12D31、猪 大肠杆菌078、猪大肠杆菌0157-H71和猪副伤寒沙口氏菌口82
[0030] 2、菌株处理；将菌种复苏，在固体LB培养基中划线，在培养箱中37°C过夜培养。将 过夜培养的细菌挑单菌落于含有25ml液体M皿培养基的=角瓶中，将=角瓶放于摇床37°C 培养12-1她。将培养后的菌液在0D600的条件下测其吸光度值，用M皿培养基调节菌液浓 度，使其处于0. 6-0. 8之间。之后将菌液稀释成浓度为5 X 105CFU/mU依次取90 y 1加入到 96孔板的各孔内。
[0031] 3、抗菌肤定量后用M皿培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肤各取10 y 1依 次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100 y 1。96孔板盖盖后，37°C振 荡培养2化后，观察并用酶标仪在600nm处测量并记录实验结果。抗菌肤样品经过二倍稀 释后，成一系列浓度，W抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度（MIC)。利用菌液和 M皿培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100%。同时分别设立猪源 抗菌肤PR-39与cecropin P1标准品试验组作为对照，用于观察抗菌肤改造前后的抑菌活 性变化。
[0032] 4、用微量稀释法测定重组新型杂合抗菌肤CE-ra对多种细菌的最低抑菌浓度，结 果表明新型杂合抗菌肤CE斗R与猪源抗菌肤PR-39、cecropin P1标准品相比，其大大增加 抗菌肤对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌能力，更具市场应用价值。
[0033] 表1 ;抗菌肤对多种细菌的最低抑菌浓度
[0034]
【权利要求】
1. 一种杂合抗菌肽CE-PR，其特征在于，所述的杂合抗菌肽CE-PR的氨基酸序列为SEQ ID NO:1〇
2. 权利要求1所述的杂合抗菌肽CE-PR的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下 步骤： 1) 根据新型杂合抗菌肽CE-PR的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽 基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入Xhol和Xbal酶切位点，以便于克隆入 毕赤酵母表达载体中； 2) 将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用Xhol和Xbal双酶切，酶切产物回收并连接， 进行PCR鉴定、测序； 3) 阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀 涂布于含100 y g/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30°C孵育3-5天；待YPDS平板上的阳性 转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin200 y g/mL、500 y g/mL、1000 y g/mL的 YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株； 4) 将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 y g/mL Zeocin的YH)培养液中，28°C振 摇培养18个小时；取此菌液按4%体积比转接于5ml BMGY培养基中，28°C摇振培养18-24h 左右，0D600值约为5-6 ;培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28°C继续摇振培养；为了 维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1 % ;48h后，4°C 5000r/min离心lOmin， 收集上清，进行抑菌活性测定；能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型杂合抗菌 肽CE-PR的阳性菌株； 5) 重组酵母菌株的发酵工艺：将筛选得到的阳性重组子活化后按1% -10%接种量 接种于三角瓶，28-30°C，200r/min摇床培养16-24h后以5% -20%接种量接入发酵罐，在 28-301：，500-15001'/111111，口11值5.0-6.0，通气量0.1-1.0"]\1，溶氧>20%情况下进行发酵， 在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发 酵持续48-72h ; 发酵结束后原罐蒸汽l〇〇°C灭菌10_20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清 即为抗菌肽半成品。
3. 权利要求1所述的杂合抗菌肽CE-PR在制备畜禽饲料添加剂或免疫增强剂中的应 用。
【文档编号】A61P37/04GK104448006SQ201410771788
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月13日 优先权日:2014年12月13日
【发明者】王宏华 申请人:青岛宏昊生物科技有限公司