免疫原性的脂质体制剂的制作方法

本发明的方面根据NIH合同号HHSN272200900008C在美国政府支持下完成，美国政府可以具有本发明的某些权利。
背景技术：
：Toll-样受体4(TLR4)激动剂是免疫原性的化合物。已经将TLR-4激动剂配制在脂质体中用于递送。单磷酰脂质A是一种已知的TLR4激动剂。将3-O-去酰化的单磷酰脂质A(MPL)配制在疫苗内的脂质体组合物中。在此需要一般的改进的脂质体组合物，特别是用于施用给人受试者的TLR4激动剂的改进的脂质体组合物。具有高掺入效率的有效TLR4激动剂的脂质体组合物是合乎需要的。发明概述本发明涉及用于在药物组合物中使用的改进的脂质体。在一个实施方案中，本发明提供了一种脂质体组合物，其包含脂质（适当地是磷脂）和氨基烷烃磺酸（amninoalkanesulfonic）缓冲剂诸如HEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS和PIPES。在另一个合适实施方案中，本发明提供了一种脂质体组合物，其包含脂质（诸如磷脂）和氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)（适当地是CRX-601）。在另一个合适实施方案中，本发明提供了一种脂质体组合物，其包含脂质、AGP和氨基烷烃磺酸缓冲剂，其中所述脂质适当地是磷脂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种改进的脂质体组合物生产方法，所述方法包括下述步骤：将脂质诸如二油酰基磷脂酰胆碱(通常，“DOPC”)(任选地与胆固醇和/或药学活性成分诸如AGP一起)溶解在有机溶剂中，除去所述溶剂以产生磷脂膜，将所述膜加入HEPES缓冲剂中，将所述膜分散在所述溶液中，和将所述溶液接连地穿过聚碳酸酯过滤器挤出以形成单层脂质体。可以将所述脂质体组合物另外无菌过滤。这些新颖的脂质体组合物具有非常高的AGP掺入效率，所述AGP已知是有效的和潜在反应原性的。与所述激动剂的其它制剂相比，如本文中所述配制用于药用的AGP的脂质体组合物可以导致所述组合物的改善的治疗指数。在一个合适实施方案中，当用胆固醇形成脂质体时，脂质体组合物表现出TLR4激动剂的高掺入，但是当不用胆固醇形成脂质体时也如此，从而提供生产和配制这样的脂质体组合物的优点。本发明的脂质体在药物组合物的生产和应用中都是有益的。在本文提供的说明书、附图和权利要求书中公开了另外的实施方案。附图简述图1的LAL数据显示了通过相对于CRX-601IN参照(0%掺入)来对比样品的斜率和开始时间而确定的掺入效率。图2的LAL数据显示了通过相对于CRX-601IN参照(0%掺入)来对比样品的斜率和开始时间而确定的掺入效率。图3的LAL数据显示了通过相对于CRX-527IN参照(0%掺入)来对比样品的斜率和开始时间而确定的掺入效率。发明详述脂质体术语“脂质体”通常表示包封水性内部的单层或多层(特别是2、3、4、5、6、7、8、9或10层，取决于形成的脂质膜的数目)的脂质结构。脂质体和脂质体制剂是本领域众所周知的。能够形成脂质体的脂质包括具有脂肪或脂肪样性质的所有物质。可以构成脂质体中的脂质的脂质可以选自甘油酯、甘油磷脂、甘油膦脂、甘油膦酰脂、硫脂、鞘脂、磷脂、isoprenolides、类固醇、硬脂、甾醇、archeolipids、合成阳离子脂质和含碳水化合物的脂质。在本发明的一个特别的实施方案中，所述脂质体包含磷脂。合适的磷脂包括(但不限于)：作为磷脂酰胆碱合成中的中间体的磷酸胆碱(PC)；天然磷脂衍生物：蛋磷酸胆碱、蛋磷酸胆碱、大豆磷酸胆碱、氢化大豆磷酸胆碱、作为天然磷脂的鞘磷脂；和合成磷脂衍生物：磷酸胆碱(二癸酰基-L-α-磷脂酰胆碱[DDPC]、二月桂酰基磷脂酰胆碱[DLPC]、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱[DMPC]、二棕榈酰基磷脂酰胆碱[DPPC]、二硬脂酰基磷脂酰胆碱[DSPC]、二油酰基磷脂酰胆碱[DOPC]、1-棕榈酰基、2-油酰基磷脂酰胆碱[POPC]、二反油酰基磷脂酰胆碱[DEPC])、磷酸甘油(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油[POPG])、磷脂酸(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕榈酰基磷脂酸[DPPA]、二硬脂酰基-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸丝氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂(mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化的磷脂、末端活化的磷脂)、1,2-二油酰基-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)。在一个实施方案中，所述脂质体包含1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸乙醇胺。在一个实施方案中，使用高度纯化的磷脂酰胆碱，并且其可以选自磷脂酰胆碱(蛋)、氢化磷脂酰胆碱(蛋)、磷脂酰胆碱(大豆)、氢化磷脂酰胆碱(大豆)。在另一个实施方案中，所述脂质体包含磷脂酰乙醇胺[POPE]或其衍生物，或可以包含鞘磷脂(SPNG)。取决于磷脂组成和用于其制备的方法，脂质体大小可以从30nm到数个5µm变化。在本发明的特别的实施方案中，脂质体大小将在30nm至500nm的范围中，并且在进一步实施方案中，50nm至200nm，适当地小于200nm。动态激光散射是本领域技术人员众所周知的用于测量脂质体大小的方法。具体地，本发明的脂质体可以包含二油酰基磷脂酰胆碱[DOPC]和甾醇，特别是胆固醇。脂质体组合物“脂质体组合物”是制备的组合物，其包含脂质体和在所述脂质体内的内容物，具体地包括形成脂质体双层的脂质、在所述脂质体双层内除了所述脂质以外的化合物、在所述脂质体的水性内部中且与其缔合的化合物、以及与所述脂质体的外层结合或缔合的化合物。因而，除了所述脂质体的脂质以外，本发明的脂质体组合物适当地可以包括、但不限于药学活性成分、疫苗抗原和佐剂、赋形剂、载体和缓冲剂。在一个优选的实施方案中，这样的化合物会补充所述脂质体组合物的稳定性或AGP-掺入效率和/或对所述脂质体组合物的稳定性或AGP-掺入效率没有显著损害。“脂质体制剂”是指为了贮存和/或施用给受试者而适当地用其它化合物配制的脂质体组合物，诸如本文描述的那些。因而，本发明的脂质体制剂包括本发明的脂质体组合物，且可以另外包括、但不限于在本发明的范围之外的脂质体组合物，以及药学活性成分、疫苗抗原和佐剂、赋形剂、载体和缓冲剂。在一个优选的实施方案中，这样的化合物会补充本发明的脂质体组合物的稳定性或AGP-掺入效率和/或对本发明的脂质体组合物的稳定性或AGP-掺入效率没有显著损害。氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯化合物.AGP是Toll-样受体4(TLR4)调节剂。Toll-样受体4识别细菌LPS(脂多糖)，且当被活化时会启动先天性免疫应答。AGP是细菌LPS的脂质A蛋白的单糖模拟物，并且已经用所述化合物的“酰基链”上的醚和酯键开发。用于制备这些化合物的方法是已知的，且公开在例如WO2006/016997、美国专利号7,288,640和6,113,918和WO01/90129中，它们在特此通过引用以其整体并入。其它AGP和有关的方法公开在美国专利号7,129,219、美国专利号6,525,028和美国专利号6,911,434中。在本发明的组合物中采用的、具有在酰基链上的醚键的AGP是已知的且公开在WO2006/016997中，其特此通过引用整体并入。特别重要的是在WO2006/016997中的段落处根据式(III)阐述和描述的氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯化合物。在本发明中采用的氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯化合物具有如下式1所示的结构:(式1)其中m是0-6n是0-4；X是O或S，优选地O；Y是O或NH；Z是O或H；每个R1、R2、R3独立地选自C1-20酰基和C1-20烷基；R4是H或Me；R5独立地选自-H、-OH、-(Cl-C4)烷氧基、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8和-CONR8R9，其中R8和R9各自独立地选自H和(Cl-C4)烷基；且每个R6和R7独立地是H或PO3H2。在式1中，正脂肪酰基残基(也就是说，仲酰氧基或烷氧基残基，例如，R1O、R2O和R3O)所连接的3’立体中心的构型是R或S，优选地是R(如通过Cahn-Ingold-Prelog优先规则命名的)。R4和R5所连接的糖苷配基立体中心的构型可以是R或S。认为所有立体异构体、对映异构体和非对映异构体及其混合物落在本发明范围内。通过变量“n”确定杂原子X和糖苷配基氮原子之间的碳原子的数目，所述“n”可以是0-4的整数，优选地是0-2的整数。正脂肪酸R1、R2和R3的链长度可以是约6至约16个碳，优选约9至约14个碳。所述链长度可以相同或不同。一些优选的实施方案包括其中R1、R2和R3是6或10或12或14的链长度。式1包括L/D-丝氨酰基、-苏氨酰基、-半胱氨酰基醚和酯脂质AGP、激动剂和拮抗剂和它们的同系物(n=1-4)、以及各种羧酸生物电子等排体(即，R5是能够形成盐的酸性基团；所述磷酸酯可以是在葡糖胺单元的4-或6-位上，但是优选地是在4-位)。在采用式1的AGP化合物的本发明的一个优选实施方案中，n是0，R5是CO2H，R6是PO3H2，且R7是H。该优选的AGP化合物被阐述为如下式1a的结构：(式1a)其中X是O或S；Y是O或NH；Z是O或H；每个R1、R2、R3独立地选自C1-20酰基和C1-20烷基；且R4是H或甲基。在式1a中，正脂肪酰基残基(也就是说，叔酰氧基或烷氧基残基，例如，R1O、R2O和R3O)所连接的3’立体中心的构型是R或S，优选地是R(如通过Cahn-Ingold-Prelog优先规则命名的)。R4和CO2H所连接的糖苷配基立体中心的构型可以是R或S。认为所有立体异构体、对映异构体和非对映异构体及其混合物落在本发明范围内。式1a包括L/D-丝氨酰基、-苏氨酰基、-半胱氨酰基醚或酯脂质AGP、激动剂和拮抗剂。在式1和式1a中，Z是通过双键连接的O或各自通过一个单键连接的2个氢原子。也就是说，所述化合物是酯连接的（当Z=Y=O时）；酰胺连接的（当Z=O和Y=NH时）；和醚连接的（当Z=H/H和Y=O时）。特别优选的式1的化合物被称作CRX-601和CRX-527。它们的结构如下所示：。另外，另一个优选的实施方案采用具有所示结构的CRX547。CRX547。再其它的实施方案包括AGP诸如CRX602或CRX526，其给具有较短仲酰基或烷基链的AGP提供增加的稳定性。适合用于在本发明中使用的其它AGP包括CRX524和CRX529。缓冲剂.在本发明的一个实施方案中，使用两性离子缓冲剂缓冲脂质体组合物。适当地，所述两性离子缓冲剂是氨基烷烃磺酸或合适的盐。氨基烷烃磺酸缓冲剂的例子包括、但不限于HEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS和PIPES。优选地，所述缓冲剂是适合用于在人类中使用（诸如用于在市售注射产品中使用）的药学上可接受的缓冲剂。最优选地，所述缓冲剂是HEPES。所述脂质体组合物可以合适地包括AGP。在本发明的合适实施方案中，使用具有约7的pH的HEPES缓冲所述脂质体。在本发明的一个优选实施方案中，在使用具有约7的pH的HEPES缓冲的脂质体组合物中包括AGPCRX-601、CRX-527和CRX-547。所述缓冲剂可以与适当量的盐水或其它赋形剂一起使用以达到期望的等渗性。在一个优选实施方案中，使用0.9%盐水。HEPES：CAS登记号：7365-45-9C8H18N2O4S4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸HEPES是一种两性离子缓冲剂，其被设计成在约6至约8(例如6.15-8.35)的生理pH范围中和更具体地在约6.8至约8.2的更有用范围（如在本发明中，约7至约8之间，或7-8之间，和优选地约7至小于8之间）中缓冲。HEPES通常是白色结晶性粉末且具有下述结构的分子式C8H18N2O4S:HEPES是众所周知的和商购可得的(参见，例如，Good等人,Biochemistry1966)。脂质体制备用于制备脂质体的标准方法包括、但不限于在Liposomes:APracticalApproach,V.P.Torchilin,VolkmarWeissigOxfordUniversityPress,2003中报道的方法，且是本领域众所周知的。在一种合适的制备本发明的脂质体组合物的方法中，在圆底烧瓶中将AGP(例如CRX-601(20mg))和DOPC(具体地，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)(400mg))和任选的甾醇(例如胆固醇(100mg))溶解在氯仿或四氢呋喃的有机相中。通过在旋转蒸发器上并进一步在高压真空下蒸发12小时，除去有机溶剂。向如此得到的混合磷脂膜中加入10ml氨基烷烃磺酸缓冲液诸如10mMHEPES或10mMHEPES-盐水缓冲液pH7.2。将混合物在间歇涡旋下在水浴(20-30℃)上声处理，直到所有膜沿着烧瓶壁分散在溶液中(30min-1.5小时)。然后将溶液借助于脂质微型挤出机(Lipex™挤出机(NorthernLipidsInc.,Canada))穿过聚碳酸酯过滤器接连地挤出以形成单层脂质体。然后将脂质体组合物使用0.22µm过滤器无菌过滤进无菌的去热原的容器中。通过动态光散射测量的得到的制剂的平均颗粒尺寸是80-120nm，具有净负ζ电位。所述制剂代表2mg/mLCRX-601、10mg/mL胆固醇和40mg/mL总磷脂的最终靶浓度。在该工作中使用的氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯(AGP)CRX-601可以如以前所述合成{Bazin,200832447/id}，并通过层析进行纯化(至>95%纯度)。可以通过标准反相HPLC分析方法定量在起始原料中或在终产物中的CRX-601。与脂质体水合缓冲液(“LHB”，基于磷酸盐，pH=6.1)相比，在HEPES缓冲液(pH=7.0)中配制的CRX-601以快5倍的速度得到期望的颗粒尺寸减小。与LHB磷酸盐缓冲液相比，CRX-601脂质膜在HEPES缓冲液中的再水合要求少4倍的总压力和时间来配制脂质体。这是一个显著的改善，因为它节省能量和时间并在脂质体的加工过程中对AGP产生更少的应力。在一个实施方案中，脂质体组合物的组分的合适范围包含在约3-4%w/v范围内的脂质、1%w/v的甾醇、在0.1-1%w/v范围内的活性剂（诸如AGP）和10mM的氨基烷烃磺酸缓冲液。在一个实施方案中，甾醇适当地以0.5-4%w/v的范围存在。另外，在一个实施方案中，所述脂质:甾醇:活性剂比率是约3-4:1:0.1-1。实施例实施例1：CRX-601制剂脂质相容性研究.在使用CRX-601的研究中筛选了8种脂质以发现CRX-601的最佳脂质体制剂，其导致API(CRX-601)的最大稳定性和可接受的可能与佐剂有关的致热原性和/或毒性。使用LipexExtruder™来制备制剂。选择10mMHEPES（在pH=7.0）作为水合缓冲液。在HEPES缓冲液（在pH=7.0）中以2mg/mL的靶浓度制备脂质体制剂。将这些脂质制剂置于在2-8℃的实时稳定性6个月和在40℃的加速稳定性14天以监测CRX-601随时间的降解（通过RP-HPLC）、以及外观、颗粒尺寸和ζ电位的任何变化（以解释聚集）、和产色鲎阿米巴样细胞溶解物（LAL）（以解释CRX-601的掺入百分比的变化）。表1显示了所有制备的脂质体的t=0(过程数据)。从LAL数据通过相对于CRX-601IN参照(0%掺入)来对比样品的斜率和开始时间而确定掺入效率。下面显示的在t=0的LAL数据表明了CRX-601在DOPC、DOPCChol、DOPCDC-Chol、DOTAP和DOTAPChol中的良好掺入，图1和3。剩余制剂表明差掺入，如在下面图2中所见。实施例2掺入效率测试为了确定胆固醇对CRX-601在脂质体中的掺入的影响，对含有和不含胆固醇的各种脂质体组合物执行LAL测定。得到的数据(未显示)证实了早前的LAL工作，其显示DOPC和DOPC-胆固醇组合物具有惊人高的CRX601掺入水平。但是，这些LAL测定的结果的灵敏度或一致性不足以得出关于胆固醇对掺入的影响的结论。使用兔致热原性测试作为CRX-601在脂质体中的掺入的替代量度和作为它们在生物环境中的稳定性的量度。在PacificBiolabs(Hercules,CA)按照它们的SOP16E-02执行测试。在下表中指出了来自每个测试的三只兔子的各个温度增加。来自表2的数据指示，用或不用胆固醇制备的、含有高达4mgCRX-601/ml的DOPC脂质体制剂直到1000ng/kg的剂量是无热原的。这种致热原性缺乏对应于相对于游离CRX-601(最大无热原剂量为2.5ng/kg)的400倍改善，并指示>99%的CRX-601在脂质体双层中的掺入。表2:用或不用胆固醇制备的DOPC脂质体制剂的代表性兔热原测试测量结果.在括号中的值是三只动物在测试阶段中的最大温度变化。0.5℃或更大的温度升高被认为是热原性应答。符号P和F分别指示‘通过（Pass）’或‘失败（Fail）’应答。制剂在500ng/kg的剂量在任何时间区间观察到的最大温度升高(相对于对照)在1000ng/kg的剂量在任何时间区间观察到的最大温度升高(相对于对照)在2mg/mL的靶浓度制备的CRX-601DOPC脂质体P(0.3℃,0.0℃,0.0℃)P(0.0℃,0.0℃,0.0℃)在2mg/mL的靶浓度制备的CRX-601DOPC-胆固醇脂质体P(0.3℃,0.0℃,0.4℃)P(0.1℃,0.4℃,0.4℃)在4mg/mL的靶浓度制备的CRX-601DOPC脂质体P(0.1℃,0.0℃,0.2℃)P(0.0℃,0.0℃,0.4℃)在4mg/mL的靶浓度制备的CRX-601DOPC-胆固醇脂质体P(0.0℃,0.0℃,0.0℃)P(0.3℃,0.4℃,0.2℃)来自表3的数据指示，含有高达8mgCRX-601/ml的DOPC胆固醇脂质体制剂直到500ng/kg的剂量是无热原的。这种致热原性缺乏对应于相对于游离CRX-601(最大无热原剂量为2.5ng/kg)的200倍改善，并指示>99%的CRX-601在脂质体双层中的掺入。表3：用胆固醇制备的DOPC脂质体制剂的代表性兔热原测试测量结果。在括号中的值是三只动物在测试阶段中的最大温度变化。0.5℃或更大的温度升高被认为是热原性应答。符号P和F分别指示‘通过（Pass）’或‘失败（Fail）’应答。表3制剂在500ng/kg的剂量在任何时间区间观察到的最大温度升高(相对于对照)在1000ng/kg的剂量在任何时间区间观察到的最大温度升高(相对于对照)在8mg/mL的靶浓度制备的CRX-601DOPC胆固醇脂质体P(0.1℃,0.1℃,0.3℃)P(0.4℃,0.3℃,03℃)在8mg/mL的靶浓度制备的CRX-601DOPC-胆固醇脂质体P(0.2℃,0.4℃,0.3℃)F(0.6℃,1.0℃,0.4℃)CRX-527是CRX601的酯类似物。来自表4的数据指示，含有高达2mgCRX-527/ml的DOPC胆固醇脂质体制剂直到500ng/kg的剂量是无热原的。这种致热原性缺乏提示非常高(可能>99%)的CRX-601在脂质体双层中的掺入。令人感兴趣的是，不同于CRX-601，在DOPC脂质体制剂(即在没有胆固醇存在下)中的CRX-527被证实在500ng/kg是热原性的。表4制剂在500ng/kg的剂量在任何时间区间观察到的最大温度升高(相对于对照)在1000ng/kg的剂量在任何时间区间观察到的最大温度升高(相对于对照)在2mg/mL的靶浓度制备的527DOPC脂质体F(0.9C,1.2C,1.0C)F(0.7C,1.0C,1.3C)在2mg/mL的靶浓度制备的527DOPCCHOL脂质体P(0.4,0.3,0.2C)P(0.1,0.0,0.1C)在表5中也显示了含有CRX-601的阳离子DOTAP和DOTAP-胆固醇脂质体的良好掺入结果。表5制剂在500ng/kg的剂量在任何时间区间观察到的最大温度升高(相对于对照)在1000ng/kg的剂量在任何时间区间观察到的最大温度升高(相对于对照)在2mg/mL的靶浓度制备的601DOTAP脂质体P(0.3C,0.3C,0.1C)F(0.6C,0.6C,0.7C)在2mg/mL的靶浓度制备的601DOTAPCHOL脂质体P(0.2C,0.4C,0.4C)F(0.6C,0.5C,0.4C)当前第1页1 2 3