用于非细胞毒性干细胞移植的方法和组合物与流程

文档序号：12163956阅读：479来源：国知局

关于联邦政府资助研究的声明

本发明的某些实施方案是在国立卫生研究院授予的NS046004政府资助下完成的。政府拥有本发明的一定权利。

背景技术：

造血干细胞移植(HCST)用于治疗各种血液疾病、自身免疫病变、恶性疾病，且正在开发用于治疗各种其他疾病。在HCST期间，将受试者中的造血干细胞(HSC)清除，然后使新HCS融合到受试者中。目前，受试者在HSCT之前经受称为清髓的由细胞毒性化疗和/或放疗组成的苛刻预处理方案，以根除目标细胞和消除HSC。这种处理严重损害免疫系统功能，可能增加受试者获得机会性感染的风险。

当细胞来自于非自体供体时，清髓有助于防止受试者免疫系统的移植排斥反应。类似的预处理方案还用于自体移植，其中受试者是供体，将来自受试者的细胞取出然后返回到同一受试者。存在一些可用的非清髓预处理方案(尽管不太有效)，其中使用不会根除全部造血干细胞的较低剂量的化疗和/或放疗，但是受试者会遭受清髓方案所遇到的同样副作用。用于HCST的其他方法仍有必要。

发明概述

本发明的某些实施方案提供用于非细胞毒性HSCT的方法。非细胞毒性HSCT包括在施用移植或替代细胞前不使用化疗或放疗处理受试者的方法。在某些方面，本文所描述的HCST法包括施用干细胞动员剂以刺激目标干细胞移出干细胞巢，然后施用外源(例如移植或替代)干细胞，其随后移至适当的干细胞巢。本文所使用的外源干细胞指除了在动员时占据干细胞巢的那些干细胞之外的干细胞。因此，外源干细胞包括预先从同一患者分离并且后来返回到同一患者的干细胞。在某些方面，该动员和移植循环被进行若干个循环。在其他方面，动员/移植循环进行至少4次。

当前多个循环的干细胞移植不是人临床使用的理想方法。在某些方面，例如在源于纯合子缺乏的情况下，会需要替代大比例的细胞以使得该缺乏得到足够补偿，需要干细胞巢的50％、60％、70％、80％、90％或更多被替代细胞占据。在另一个方面，例如导致异常基因剂量的情况例如源于杂合子症状的情况下，可能需要替代干细胞较小比例的移植，例如干细胞巢的20％、30％、40％、最高50％被替代干细胞占据。在第三情况例如治疗情况下，由于分泌性蛋白质或其他生物分子的治疗作用，有效量的替代细胞可能需要为较小百分比，例如干细胞巢的0.1％、1％、5％、10％、15％、最高20％被替代干细胞占据。因此，各种情况会需要多个循环以实现预期效果。

如本文所使用的，干细胞巢是发现干细胞的组织微环境，所述微环境与干细胞相互作用以调节干细胞命运。词语“巢”可以指体内干细胞微环境。在体内，干细胞巢将干细胞维持在静止状态，但在活化后，周围微环境向干细胞积极发信号以促进其或者自我更新或者分化以形成新细胞或组织。在特定巢内几个因素促成这些特征：(i)干细胞之间以及干细胞和邻近细胞之间的细胞-细胞相互作用；(ii)干细胞和粘附分子、细胞外基质成分、生长因子和细胞因子之间的相互作用；(iii)微环境的物理化学性质，包括氧分压、pH、离子强度(如Ca²⁺浓度)和各种代谢物的存在。目标干细胞的动员(从巢移出或巢排空)增加移植或替代干细胞占据干细胞巢的可能性。

“目标干细胞”定义为从受试者动员、收集和/或消除的内源干细胞。“移植或替代干细胞”是正引入受试者的干细胞。移植或替代干细胞可以是治疗性干细胞，其中已被基因工程化、处理或在其他方面修饰以对受试者是治疗性的。基因工程指直接操纵细胞的基因组或其它核酸用于各种效果，包括但不限于减少基因表达，其中减少或阻止目标蛋白表达；改变蛋白表达水平(正或负)，例如在通常不表达目标蛋白的细胞类型中表达内源蛋白或提高以一定基线水平表达的蛋白质表达；和/或表达新蛋白或非内源蛋白、表达RNA分子等。在某些方面，可以将细胞工程化以产生治疗性蛋白，例如生长因子、单克隆抗体、酶等。基因工程可以包括将核酸插入到基因组(染色体操作)或将附加型表达载体引入到细胞中(染色体外操作)。

某些实施方案针对非细胞毒性干细胞移植或替代的方法，其包括：(a)向受试者施用至少一种干细胞动员剂，其中目标干细胞群从宿主干细胞巢移至受试者循环血室；(b)从受试者去除经动员的目标干细胞(例如清血法(apheresis))；(c)向受试者施用移植或替代干细胞，其中移植或替代干细胞移至并占据宿主干细胞巢；(d)重复步骤(a)至(c)2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或更多次。

在某些方面，移植或替代干细胞是治疗性干细胞。在其他方面，治疗性干细胞是已体外操作的经分离的目标干细胞。在某些方面，移植、替代和/或治疗性干细胞是从待治疗受试者中分离的。在其他方面，移植、替代和/或治疗性干细胞是从异源即不是待治疗受试者的来源或供体中分离的。术语“经分离的”指基本没有异源细胞或其原始来源的细胞材料、细菌材料、病毒材料和/或培养基的细胞、核酸或多肽；或者化学合成时基本没有化学前体或其他化学品。供体可以是自体、同体或异种(其他物种的非相同基因供体)的供体。在某些方面，治疗性干细胞是基因工程化的。在某些方面，移植或替代干细胞来自自体供体。在另一方面，移植或替代干细胞来自同体供体。在再一方面，移植或替代干细胞来自异种供体。在某些方面，目标干细胞是造血干细胞。在某些方面，移植或替代干细胞是造血干细胞或造血干细胞前体细胞。

在某些方面，动员剂可以选自白介素-17(IL-17)、AMD3100、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、反义VLA-4受体(如ATL1102(Antisense Therapeutics Limited))和/或已知用于动员干细胞的其它试剂。在某些方面，动员剂是粒细胞集落刺激因子。在某些方面，动员剂包括AMD3100。在另一实施方案中，受试者施用G-CSF和AMD3100两者。在另一方面，可以在向受试者施用移植或替代干细胞前或期间施用动员剂。

在某些方面，通过基因修饰和/或体外处理从受试者分离的细胞以操作分离的目标干细胞。

某些实施方案针对治疗HIV感染的方法，其包括(a)向感染HIV的受试者施用至少一种造血干细胞动员剂，其中受试者的造血干细胞从造血干细胞巢移至血液；(b)从受试者血液去除造血干细胞；(c)施用抗HIV造血干细胞；(d)重复步骤(a)至(c)4次或更多次。在某些方面，抗HIV干细胞是工程化的自体干细胞。该方法还可以包括从受试者分离经动员的造血干细胞，通过基因工程化造血干细胞操作分离的造血干细胞以抗HIV感染。在某些方面，细胞选择为非感染细胞。抗HIV干细胞可以选择为或工程化为CCR5缺陷型干细胞。CCR5缺陷型干细胞工程化为或者不表达CCR5或者表达不促进干细胞或其后代HIV感染的CCR5细胞。在某些方面，CCR5缺陷干细胞是似CCR5Δ32的干细胞，即如CCR5Δ32细胞的抗HIV感染的干细胞。

某些实施方案针对治疗帕金森症的方法，其包括：(a)向患有帕金森症的受试者施用至少一种造血干细胞动员剂，其中受试者的造血干细胞从造血干细胞巢移至血液；(b)从受试者的血液去除造血干细胞；(c)施用治疗性造血干细胞，其包含配置为特别当分化为巨噬细胞时在受试者中表达神经生长因子的表达盒；(d)重复步骤(a)至(c)5次或更多次。在某些方面，治疗性干细胞是自体干细胞。该方法还可以包括从受试者分离经动员的造血干细胞；通过基因工程化造血干细胞操纵分离的造血干细胞以包含神经生长因子，其中使神经生长因子在由工程化造血干细胞分化的巨噬细胞中表达。在某些方面，神经生长因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)或neurturin(NTN)。

其他实施方案针对用于治疗阿尔茨海默症的方法，其包括：(a)向患有阿尔茨海默症的受试者施用至少一种造血干细胞动员剂，其中受试者的造血干细胞从造血干细胞巢移至血液；(b)从受试者的血液去除造血干细胞；(c)施用治疗性造血干细胞，其包含配置为特别当分化为巨噬细胞时在受试者中表达脑源性神经营养因子(BDNF)的表达盒；(d)重复步骤(a)至(c)4次、5次或更多次。治疗性干细胞可以是自体干细胞。该方法还可以包括从受试者分离经动员的造血干细胞；通过基因工程化造血干细胞操纵分离的造血干细胞以包含脑源性神经营养因子，其中使脑源性神经营养因子在由工程化造血干细胞分化的巨噬细胞中表达。

其他的实施方案针对用于治疗动脉粥样硬化的方法，其包括：(a)向患有动脉粥样硬化的受试者施用至少一种造血干细胞动员剂，其中受试者的造血干细胞从造血干细胞巢移至血液；(b)从受试者的血液去除造血干细胞；(c)施用治疗性造血干细胞，其包含配置为特别当分化为巨噬细胞时在受试者中表达核受体的表达盒；(d)重复步骤(a)至(c)4次、5次或更多次。治疗性干细胞可以是自体干细胞。该方法还可以包括从受试者分离经动员的造血干细胞；通过基因工程化造血干细胞操纵分离的造血干细胞以包含apoE或LXRa，其中使apoE或LXRa在由工程化造血干细胞分化的巨噬细胞中表达。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用以指作为治疗、观察和/或实验对象的动物。“动物”包括脊椎动物，如哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类如猴子、黑猩猩和猿以及人类。在某些实施方案中，受试者是人受试者。

术语“改善”、“治疗”、“治疗性的”或“疗法”并不一定意味着疾病或病状完全治愈或消除。在任何程度上，疾病或病状任何非所需的迹象或症状的任何缓解都可以视为改善和在一些方面治疗和/或疗法。

如本文所使用的，术语“祖细胞”指应答某些刺激可以形成分化细胞如造血细胞或骨髓细胞的细胞。如本文所使用的，“干”细胞是祖细胞的低分化形式。通常，这种细胞对人中的CD34通常是阳性。

术语“提供”根据其普通含义“供给或供应以使用”使用。在一些实施方案中，通过施用蛋白质提供蛋白质，而在其他实施方案中，通过施用编码蛋白质的核酸或施用合成蛋白质的细胞有效提供该蛋白质。

在本申请全文讨论本发明的其他实施方案。关于本发明一方面所讨论的任何实施方案也可以应用于本发明的其他方面，反之亦然。本文所讨论的每个实施方案理解为适用于本发明所有方面的本发明实施方案。预期的是本文所讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可以用于实现本发明的方法。

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，要素前面不使用数量词可以表示“一个”，但是其也符合“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思。

在本申请全文，术语“约”用于表明数值包含用于确定数值使用的装置或方法的标准差。

权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确说明仅指选择，或选择是相互排斥的，尽管公开支持仅指选择和“和/或”的定义。

如本说明书和权利要求所使用的，单词“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。

本发明的其它目的、特征和优点通过以下详细描述会变得明显。然而，应该理解详细说明和具体实施例在表明本发明的具体实施方案时仅通过举例说明的方式给出，因为对本领域技术人员而言，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改通过该详细说明会变得显而易见。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并被包含以进一步证实本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一个或更多个结合本文所提供的说明书实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。

图1是非细胞毒性干细胞移植或替代方法的示意图。

图2.巨噬细胞中的人apoE转基因表达和apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的减少。

图3.合成启动子的双荧光素酶分析。转染Thp-1、RAW264.7、MonoMac-1、HeLa、293和Caco-2细胞，48小时后测量荧光素酶活性(n＝3至10)。通过克隆序号表示合成启动子。

图4.(a)MSP-GFP小鼠的外周血流式细胞术分析，其显示移植后3周的GFP表达大多数在CD11b-阳性细胞中(n＝10，P<0.0001)。(b)约7％的CD11b-阴性细胞表达非常低水平的GFP(n＝10，P<0.0001)。(c)来自MSP GFP小鼠的红细胞中没有观察到GFP表达，而来自移植了的对照小鼠的红细胞是GFP阳性，该骨髓细胞由通用启动子CMV驱动的编码GFP的慢病毒转导。(d)移植后17周通过ELISA测定的MSP-GFP小鼠和MSP-GDNF小鼠的血浆中(n＝5)的GDNF水平。(e)骨髓移植后不同时间点的MSP-GFP小鼠外周血白细胞中的GFP-阳性细胞(n＝7)。

图5.(a)通过体视学评估的MSP-GFP小鼠黑质中的Iba1-阳性细胞和GFP-阳性细胞的总数。(b)MSP-GFP小鼠黑质中的骨髓源性(GFP阳性)小胶质细胞的比例(每组中n＝3)。(c)经生理盐水和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理的MSP-GFP小鼠中脑的剖面图，其显示SNpc中的GFP阳性细胞和Iba1(小胶质细胞标记)阳性细胞。(d)经MPTP处理的MSP-GFP小鼠剖面图，其显示经基因修饰的骨髓源性小胶质细胞(绿色)与TH阳性神经元(红色)很接近。

图6.最后一次注射MPTP后九周，通过ELISA测定的MSP-GFP小鼠和MSP-GDNF小鼠黑质(a、n＝5，P<0.002)、纹状体(b、n＝5，P<0.001)中的GDNF水平。

图7.(a)显示来自每天用生理盐水(n＝3)或5mg MPTP/kg(n＝2)持续处理28天的小鼠SNpc中TH阳性细胞的定量体视学数据图。(b)每天用生理盐水(n＝3)或5mg MPTP/kg(n＝2)持续处理28天的小鼠黑质中GFP阳性细胞的半定量分析。每条表示每个动物黑质致密部的每五个代表性剖面图的GFP阳性细胞总数的平均值±标准差。

图8.显示MPTP处理后9周SBpc中的Nissl染色细胞总数的定量体视学数据图(***P<0.001)。每组的动物数示于括号中。

图9.(a)慢病毒载体(LV-MSP-Tet-On-GDNF)设计的图示。GDNF表达通过多西环素调节的巨噬细胞特异性启动子(MSP)驱动。Tet-ON依赖于阻遏物(tetR-KRAB，tTR-KRAB编码的)，该阻遏物在没有多西环素时结合至tetO，并通过自身循环抑制GDNF及其自身的表达，而在多西环素存在时tTRKRAB不结合tetO，因此允许GDNF表达。(b)用LV-MSP-Tet-On-GDNF转导骨髓源性巨噬细胞。转导24小时后收集培养基，通过ELISA试剂盒测量GDNF浓度。

图10.(a)显示SNpc中TH阳性(P<0.001)神经元总数的定量体视学数据图。每组的动物数示于括号中。(b)显示1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶/丙磺舒(MPTP/p)小鼠SNpc中TH免疫活性神经元中的α-突触核蛋白免疫活性包含体的图片。(c)示出旋转试验上MPTP/p小鼠受损运动能力的定量数据图(P<0.001)。通过旷场实验评价的总活力(d)和培育行为(e)。MPTP/p动物在旷场中穿过显著更少方格数(总活力测量；P<0.001)。与生理盐水/p小鼠相比，这些动物还表现出显著更少的培育行为(P<0.001)。(f)显示横杆跑动实验受损能力的定量数据图。MPTP/p小鼠用显著(P<0.001)更多时间穿过升高45°角的1m长、8mm直径横杆。爬杆试验也获得了类似的结果(g，h)。MPTP/p小鼠用显著更多时间从固定在住笼中55cm长、8mm直径杆调头(g，P<0.001)和下降(h，P<0.001)。总共8只MPTP/p小鼠和10只生理盐水/p小鼠用于行为分析。

发明详述

造血干细胞移植(HSCT)用于治疗各种血液病、自身免疫病和恶性病。HSCT是移植源于骨髓(该情况下称为骨髓(BM)移植)、血液(例如外周血和脐带血)或羊水的造血干细胞。目前，在HSCT之前受试者经受称为清髓的苛刻预处理方案以根除疾病和造血干细胞(HSC)。“清髓”指通过在HCST前施用化疗和/或放疗严格或全部清除HSC。该处理严重损害造血系统的骨髓增殖功能。用于异体移植(从相同物种的基因不同供体移植细胞、组织或器官至受体)的清髓技术可以包括环磷酰胺与白消安的组合或全身放疗(TBI)。自体移植(从基因相同受体移植细胞、组织或器官至受体，如受试者既是受体又是供体)也可以使用类似的预处理方案。根据疾病可以使用各种化疗和/或放疗的组合。

HSC的无差别破坏可以引起正常血细胞计数减少，该正常血细胞如淋巴细胞、中性粒细胞和血小板。白细胞计数的这种下降还导致免疫系统功能的损失和获得机会性感染的风险增加。化疗和/或放疗导致的中性粒细胞减少可能在治疗后几天内发生。受试者仍然容易受到感染直到中性粒细胞计数恢复到正常范围内。如果减少的白细胞计数(白细胞减少)、中性粒细胞计数(中性粒细胞减少)、粒细胞计数(粒细胞减少)和/或血小板计数(血小板减少)变得十分严重，必须中断治疗以使得白血细胞和/或血小板计数恢复。

正在试验不根除全部造血细胞、使用较低剂量的化疗和/或放疗的“非清髓的”预处理方案，但是受试者仍然遭受类似的副作用，只是程度较低。值得注意的是，通过自体HCST的非恶性病治疗不需要细胞毒性预处理方案。例如，目前的实验性非清髓性预处理方案包括基于抗体的移植前预处理(Czechowicz等人.Science.2007,318(5854):1296-1299；Xue等人.Blood.2010,116:5419-5422)、I型干扰素介导的移植前预处理(Sato等人.Blood.2013,121(16):3267-3273)和G-CSF调节的移植前预处理(Mardiney和Malech,Blood.1996,87(10):4049-4056；Barese等人.Stem Cells.2007,25(6)1578-1585)。然而，抗体介导的预处理方案(Czechowicz等人)仅在免疫缺陷的受试者中起作用，而对有免疫能力的HSCT受体不起作用。I型干扰素介导的和G-CSF调节的移植前预处理方案仍然需要放疗或化疗，只是剂量减少。在没有放疗或化疗的情况下尝试了AMD3100，显示并不足够有效。本文所描述的方法的实施方案提供了有效的“非细胞毒性”方案(即具有很小毒性至没有毒性的方案)以避免放疗和化疗的副作用。

I.干细胞移植或替代

干细胞是可以分化成特定细胞的未分化细胞，可以分裂(通过有丝分裂)以产生更多干细胞。在哺乳动物中，有两大类干细胞：(i)胚胎干细胞，其是从胚泡内细胞团分离，(ii)成体干细胞，其发现于各种组织中。在成年有机体中，干细胞和祖细胞作为身体的修复系统，补充成体组织。人成体干细胞的通常来源包括骨髓(BM)、脂肪组织(脂质细胞)和血液。从血液中收集细胞可以通过清血法进行，其中从供体中抽取血液(类似于献血)，经过提取干细胞并将血液的其他部分返回到供体的机器。干细胞的另一个来源是脐带血。

成体干细胞经常用于医学治疗，例如在骨髓移植中。现在可以使干细胞生长、操作和/或转变(分化)为特定细胞类型，该特定细胞类型具有与各种组织如肌肉或神经的细胞一致的特性。通过治疗性克隆产生的胚胎细胞系和自体胚胎干细胞也作为治疗有希望的候选而提出。

干细胞自体收集是风险最小的收集方法之一。显然，自体细胞是从人自身获得的，就像人可以储存他或她自己的血液用于选择性外科手术，人也可以储存干细胞。自体干细胞移植是将干细胞去除、储存和/或再引入同一个人的医疗流程。然后，这些储存的细胞可以成为在本文所描述的方法中移植或替代干细胞的来源。

干细胞移植最常用造血干细胞(HSC)进行。自体HSCT包括从受试者提取HSC和/或冷冻收集的HSC。在预处理和基因工程化从受试者分离的细胞后，将受试者的HSC移植到受试者中。异体HSCT涉及从异体HSC供体获得的HSC。通常异体供体具有与受试者匹配的人白细胞抗原(HLA)型。

本文所描述的非细胞毒性方法的实施方案包括动员目标干细胞群(包括移动干细胞到血液或其他体液)；从干细胞富集的体液去除、分离和/或选择目标干细胞群；施用移植或替代干细胞群至受试者，其中该移植或替代干细胞群位于目标干细胞群的巢中。在某些方面，该方法的步骤重复数次。移植的多个循环可以引起受试者中移植或替代干细胞群越来越多出现。

在某些方面，将造血干细胞从骨髓中其巢动员，并用治疗性干细胞替代。造血干细胞(HSC)是具有重建整个造血系统的能力的骨髓细胞。造血干细胞通过其小尺寸、缺少谱系(lin)标记、活体染料如罗丹明(罗丹明DULL，也称为rholo)的低着色、以及其表面上存在各种抗原标记而识别。许多HSC标记属于分化系列簇，如同：CD34、CD38、CD90、CD133、CD105、CD45以及c-kit(干细胞因子受体)。造血干细胞对用于检测谱系定型的标记是阴性的，因此称为Lin减(Lin-)。血液谱系标记包括但不限于用于人骨髓的CD13和CD33、用于人红系细胞的CD71、用于人B淋巴细胞的CD19、用于人巨核细胞的CD61；用于小鼠B淋巴细胞的B220(小鼠CD45)、用于小鼠单核细胞的Mac-1(CD11b/CD18)、用于小鼠粒细胞的Gr-1、用于小鼠红系细胞的Ter119、用于小鼠T淋巴细胞的Il7Ra、CD3、CD4、CD5、CD8等。抗体可以用于清除lin+细胞。

干细胞可以包括来自许多组织来源的许多不同的细胞类型。术语“诱导多能干细胞”(iPS细胞)指通过一种或更多种转录因子过表达衍生自间充质细胞(如成纤维细胞和肝细胞)的多能细胞。在某些方面，iPS细胞通过Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4过表达衍生自成纤维细胞(例如Takahashi等人.Cell,126:663-676,2006)。如本文所使用的，“衍生自iPS细胞的细胞”指作为iPS细胞体外培养或体内移植结果的或多能性的或最终分化的细胞。

神经干细胞是多能细胞的亚群，其沿着神经细胞路径部分分化并表达一些神经标记，包括例如巢蛋白。神经干细胞可以分化成神经元或胶质细胞(如星形胶质细胞和少突胶质细胞)。

使用选择方法清除细胞群中表达特定表面标记的细胞，该选择方法去除至少一些表达各种细胞表面标记的细胞。该选择方法可以通过保持不表达选择标记的细胞存活能力的任何合适方法实现，其包括例如，荧光激活细胞分类术(FACS)或磁性激活细胞分类术(MACS)。优选地，经清除的群包含少于10％、少于5％、少于2.5％、少于1％、或少于0.1％的表达选择标记的细胞。

A.动员方法

造血干细胞存在于控制存活、增殖、自我更新或分化的骨髓(BM)特定巢中。在正常个体中，BM和血液腔之间HSC的持续交换很可能填充空巢或被损坏的巢，有助于维持正常造血作用(Wright等人.Science.2001,294:1933-1936；Abkowitz等人.Blood.2003,102:1249-1253)。多年来已经知道，可以通过称为“干细胞动员剂”的多种激动剂增强HSC输出。造血细胞因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)被广泛临床用于引起HSC动员用于BM移植(Lapidot和Petit.Exp.Hematol.2002,30:973-981；Papayannopoulou,T.Blood.2004,103:1580-1585)，其是刺激骨髓产生粒细胞和干细胞并将其释放到血流的糖蛋白。功能上，其是细胞因子和激素，一种集落刺激因子，由许多不同组织产生。另外，已显示AMD3100增加了通过对抗CXCR4应答治疗和功能的人的百分比，CXCR4是对HSC回到BM重要的趋化因子受体。在某些方面，对受试者施用诱导干细胞从巢移动的试剂和抑制干细胞回到巢的试剂。

施用动员剂的剂量和剂量方案会根据剂型、施用方式、待治疗病状和待治疗患者情况而变化。相应地，最佳治疗浓度会通过常规实验在时间和地点根据经验最好地确定。

某些动员剂可以以用于静脉内或肌肉内灌注或注射的溶液或混悬剂形式经肠胃外施用。在这种情况下，动员剂通常以每天每kg体重约10μg至10mg的速率施用。施用方法包括使用包含每毫升约0.01mg至1mg活性物质的溶液或混悬剂。在某些方面，动员剂以每天每kg体重约10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、或100μg至1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg的速率施用。

某些动员剂可以经肠施用。口服地，动员剂可以以每天每kg体重100μg至100mg的速率施用。在一些方面，动员剂以每天每kg体重约100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、或500μg施用至约1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg或100mg的速率施用。所需剂量可以以一份或更多份施用。对于口服施用，合适的形式是例如片剂、凝胶、气雾剂、丸剂、糖衣丸、糖浆、混悬剂、乳剂、溶液、粉末和颗粒。

本文所公开的试剂和/或药物组合物可以按照各种途径施用，通常通过注射，如局部注射或全身注射。然而，也可以使用其它给药途径，如经肌肉内、经静脉、经真皮内、经皮下等。此外，如果需要可以进行重复注射。

对于体内施用，可以将活性剂添加至例如药学上可接受载体，如生理盐水和缓冲盐水，并通过现有技术已知的几种方法中的任意方法施用。施用的实例包括肠胃外给药如通过静脉注射，其包括通过供应具有目标细胞的组织或器官的血管局部灌注、或者通过气雾剂吸入、皮下注射或肌肉内注射、局部施用例如施用至皮肤伤口和损伤、直接转染至例如为移植制备的骨髓细胞中并且随后移植到受试者中、直接转染至随后移植到受试者的器官中。其他施用方法包括口服施用，特别当将活性剂封装时。

B.分离方法

与困难的骨髓移植相反，HSC可以轻易地从外周血收集，并且该方法提供了较大的移植体，不需要供体经历全身麻醉以收集移植体，导致移植时间较短，并且可以提供较低的长期复发率。为了从循环外周血收集HSC，将受试者施用一种或更多种诱导细胞离开骨髓并在血管中循环的动员剂。受试者然后经历清血法以富集并收集HSC，然后使清除HSC的血液回到该受试者。

C.施用方法

组合物可以使用输送的传统模式施用，输送的传统模式包括但不限于，经静脉内、经腹膜内、经口的、经淋巴管内、经皮下的、经动脉内的、经肌肉内的、经胸膜内的、经鞘膜内的，以及通过局部导管输液。当通过注射施用组合物时，可以通过持续输注或通过单次或多次剂量施用。对于肠胃外施用，干细胞动员剂可以在无热原的、肠胃外可接受的水溶液中施用，所述水溶液包含在药学上可接受载体中的所需干细胞动员剂。用于肠胃外注射的特别合适的载体是无菌蒸馏水，其中将一种或更多种干细胞动员剂配制为无菌等渗溶液，妥善保存。

II.治疗方法

本文所描述的方法提供了温和且低风险但是高水平的内源干细胞的替代，所述内源干细胞具有或基因工程化的或药理学上再生的HSC或组合。该HSCT策略可以转化成在临床研究和患者管理特别是对于衰老相关疾病中增强和拓宽HSCT应用的改革方法。

在将体内骨髓细胞重新引入患者之前，可以将这些细胞培养和(i)扩大以增加造血祖细胞群，(ii)基因工程化和/或(iii)另外预处理。这些造血干细胞或前体细胞可以用于体内基因疗法，借助于此，在将经改造的细胞再引入患者之前该细胞可以在体外改造。在基因疗法中，使用传统重组DNA技术，可以将所选的核酸如基因分离、放置到载体如病毒载体中、将载体转染到造血细胞中以转化细胞，该细胞可以反过来表达该基因编码的产物。然后，可以将细胞引入患者中(Wilson等人.PNAS.1998,85:3014-3018)。然而，有效的造血干细胞转染存在问题(Miller.Blood.1990,76:271-278)。可以将经改化的细胞工程化以表达和/或分泌治疗性蛋白如生长因子、细胞因子、单克隆抗体(另一种蛋白或细胞的正调节子或另一种蛋白或细胞的负调节子)、配体、酶、受体等。

活性剂的体内施用可以通过会保持细胞存活能力的任何标准方法实现，如通过将其添加到培养基(适合于目标细胞)并将该培养基直接添加至细胞。如现有技术已知的，该方法中使用的任何培养基可以是水性的且无毒性的以不导致细胞不能存活。另外，如果需要，其可以包含用于维持细胞存活能力的标准营养素。

A.治疗帕金森症的方法

帕金森症(PD)是中枢神经系统退行性疾病，特征在于颤抖、僵硬、运动缓慢以及步行和步态困难。PD的运动症状起因于黑质中产多巴胺细胞的死亡，黑质是中脑的一个区域；该细胞死亡的原因未知。然而，PD的小鼠模型显示或神经生长因子胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)或neurturin(NTN)的表达提供了对抗多巴胺能神经退行性疾病的保护效应(Biju等人.Molecular Therapy.2010,18:1536-1544；Biju等人.Neuroscience Letters 2013,535:24-29)。在临床应用中，会从患有帕金森症的患者收集HSC和储存。可以将该HSC工程化以表达BDNF或NTN，然后将其移植回同一受试者中(Biju等人,2010)。该移植会重复多次以得到足够数量的表达GDNF或NTN的血细胞。

用神经营养因子治疗帕金森症(PD)的基于细胞的、非侵入性方法可以用于保护PD中受影响的多巴胺(DA)神经元。在临床前研究中，均已经证实了GDNF的症状和神经保护益处。然而，GDNF穿过血脑屏障(BBB)很差以致全身给药不起作用。涉及或GDNF蛋白或表达GDNF的病毒载体的侵入性脑注射的临床试验已经显示了不一致的结果。这可能至少部分归因于这种营养因子未充分输送至退化的黑质DA神经元，由于其在脑组织中的有限扩散以及人大脑的大目标体积(相对实验啮齿类)。此外，PD的慢性渐进性本质需要经数月/数年的GDNF持续输注以维持DA神经元存活和功能。基于造血干细胞(HSC)移植的、巨噬细胞/小胶质细胞介导的GDNF输送可以用作治疗PD的其他方法。

该方法运用已知的巨噬细胞返回接近损伤神经元的退化中枢神经系统位点的特性，合并巨噬细胞特异性合成启动子(MSP)，并利用HSC移植(HSCT)长期临床经验以及HSC基因疗法的最近进展。该疗法的临床设想是自体HSC从骨髓动员，通过清血法从外周血分离，然后用携带GDNF基因的表达载体(如慢病毒载体)体外转导。预处理后，将经转导的HSC输入患者中，使得会形成各种血细胞谱系的经移植HSC成活。治疗基因仅在单核/巨噬细胞谱系的细胞中以高水平表达，因为其在MSP控制下。巨噬细胞会渗入大脑并变成小胶质细胞，其在PD患者神经退行性病变集中的黑质纹状体系统中累积。这些小胶质细胞会分泌GDNF蛋白并使营养因子易接近在患者中受到影响的周围神经元。事实上，类似的方法对脑白质营养不良是有疗效的，脑白质营养不良是一类罕见的遗传性神经退行性疾病。

B.治疗动脉粥样硬化的方法

动脉粥样硬化是美国和其他发达国家中死亡率和发病率的主要原因，其是心肌梗死、中风和外周血管闭塞疾病的基础。当前的疗法通常针对使用他汀类药物降低LDL胆固醇水平。本文所描述的方法可以与基因工程化巨噬细胞一起使用以提供动脉粥样硬化的额外治疗。

巨噬细胞是动脉粥样化形成的主要参与者，其由来源于骨髓造血干细胞(HSC)的单核细胞分化。当在巨噬细胞中表达时，一些基因是抗动脉粥样硬化的，而其他的是促动脉粥样硬化的。例如，巨噬细胞中的apoE表达是抗动脉粥样硬化的或防动脉粥样硬化的。因为单核细胞/巨噬细胞通常寿命短暂，所以其直接基因操作的任何抗动脉粥样硬化作用不可能持久。另一方面，HSC是自我延续的且寿命长的，巨噬细胞源自该HSC。

已经研究了慢病毒HSC基因疗法用于改善动脉粥样硬化。本文所述的HSCT过程可以用于在用于减轻动脉粥样硬化的巨噬细胞中表达apoE。该方法还可以包括从受试者分离经动员的造血干细胞；通过基因工程化造血干细胞来操纵分离的造血干细胞以包含apoE或LXRa，其中apoE或LXRa在巨噬细胞中表达。

C.恢复活力的方法

当前有超过3900万美国人年龄65岁或更老。旨在增加健康期限和寿命的生物医学研究突破会创造经济效益和显著改善这些老年人的生活质量以及社会整体。

衰老研究领域目前已经转移至发展提高实验动物健康期限和寿命的干预措施。新的药理学、生物学和遗传学干预具有延长寿命、延迟癌症、痴呆和与衰老相关的其他可能疾病的潜力。然而，这些干预有许多注意警告和限制。例如，雷帕霉素已显示在小鼠中延长寿命以及健康期限，但是这些效果的机制仍不确定，越来越多的副作用增加了关于这种药物是否会对人有益的一些疑问。

本文所描述的方法可以通过恢复血细胞活力用于延长健康期限和寿命。均衍生自造血干细胞(HSC)的血细胞负责身体每种细胞类型的日常维护和免疫防护。HSC及其后代血细胞与年龄相关的下降导致组织氧化差、止血受损和免疫保护下降，还有慢性炎症和肿瘤发生增加(老年人中两种常见健康问题)，其可能最终导致疾病和死亡。恢复血细胞活力可以使用如本文所描述的造血干细胞移植(HSCT)来实现。

使用本文所描述的方法替代HSC的能力是发展基于动员的预处理方案的基础。在该方法多个重复之后，近交系小鼠模型的数据显示～65％的移植效率。这些方法可以用于将较年轻的或恢复活力的干细胞引入受试者中。

恢复血细胞活力可以引起健康期限和寿命延长。可以使用将老HSC替代为年轻HSC的小鼠模型。例如，可以使用通过本文所描述的方法移植或年龄相仿的老化HSC(对照)或年轻HSC(来源于10周龄小鼠)的19月龄的20只雌性和20只雄性C57BL/6小鼠证实通过替代恢复血细胞活力用于健康期限延长。每个月通过使用50小时家笼活动、步长、握力、Y迷宫和新受试者测试来测量运动和认知功能进行健康评价。通过表征26月龄和32月龄的血细胞验证了80％-90％的移植效率和恢复血细胞活力。在研究的第二部分中，将19月龄的36只雌性和44只雄性C57BL/6小鼠如上移植。监测和记录动物存活率。进行生命终止病理学。

在人类中，这种干预可以在以下几种情况下应用：(1)如临床中目前实践的，在皮下注射G-CSF和/或其他HSC动员剂(如G-CSF()和AMD3100(MOZOBIL^TM))后通过清血法从年轻人收集PBSC，然后冷藏保存。该方法重复多次(如1年2次)以储存足够大的细胞数量。当这些个体衰老后，其老化表型血细胞会替代和重新构建为其年轻时获得和储存的年轻PBSC。通过重复基于动员预处理的年轻PBSC移植，该替代能够达到～90％。该技术和试剂在当前临床中是容易适用的。(2)或者，能够从老年人收集多批PBSC和冷藏保存。来自这些PBSC的HSC可以通过基因操作(Sirt3过表达)或通过药理学操作(用cdc42抑制剂处理)在体外恢复活力，并使用所描述的预处理方案和移植方法移植回同一个体。HSC可以在含cdc42抑制剂(CASIN)的培养中体外处理8至16小时，然后移植回同一受试者(Florian等人,2012)或者基因工程化以过表达SirT3(Brown等人,2013)。(3)年轻HSC的另一个可能来源会是自体重编码多能干细胞(如iPS细胞)。皮肤和血细胞可以从老年患者收集并转化成诱导多能干细胞(iPS)。iPS细胞分化成HSC，将其移植到同一受试者中((Hanna等人,2007)。重复进行该移植以实现HSC的足够替代。

D.治疗阿尔茨海默症的方法

阿尔茨海默症(AD)是痴呆的最常见形式，影响着全世界超过2800万人。尽管AD的原因和进展并不十分清楚，已经描述了不同神经营养因子分布的变化及其受体如脑源性神经营养因子(BDNF)表达的变化(Tapia-Arancibia等人.Brain Research Reviews.2008,59(1):201-220；Schindowski等人.Genes,Brain and Behavior.2008,7(Supp 1):43-56)。另外，已经显示在AD的啮齿类动物和灵长类动物模型中BDNF表达提供了神经保护效应(Nagahara等人.Nat.Med.15:331-337)。

E.治疗HIV感染的方法

造血干细胞移植(HCST)可以用于治疗各种血液疾病、自身免疫病症、恶性病和各种其他疾病。在一些实例中患者被HSCT治愈。在著名的Berlin患者(感染HIV的白血病患者)中，认为HSCT通过用CCR5Δ32突变的供体HSC纯合子替代其HSC治愈其HIV感染，这传达了对HIV进入和感染的细胞抗性(Hutter等人.N Engl J Med(2009)360(7):692-98)。

使用放疗和/或化疗的预处理的常规HSCT被认识是高风险的并经常导致严重的感染、移植物抗宿主病和其他不良反应，尽管其是对患有恶性血液病的患者有效和救命的治疗。与当前的HSCT方法学相反，本文所描述的方法的方面会对所有HSCT患者(免疫缺陷和免疫健全两者)起作用，因为某些方面是放疗和化疗非依赖性的，并且没有这些预处理方案的不良反应。结合细胞工程如RNA引导性基因组编辑，当前描述的HSCT方法可以用于治疗或治愈HIV感染。

四十年来，HSCT是重要的医疗项目，全世界许多医生和研究人员不断积极寻求更好的预处理方案。自1993年以来，G-CSF用于动员HSC进入外周血以用于收集，但尚未用作或发展为有效的且非毒性的预处理方案。当前的移植前预处理方案是苛刻的且有毒性的，对患有非恶性病的患者非常不利(不像患有恶性病的患者，由于需要杀死癌细胞，毒性可以对其是合理的)。本文所描述的温和的且非毒性的预处理方案可以有利用于HIV感染的患者。在某些方面，HSCT用于用感兴趣的HSC替代内源HSC，因此重新构建具有理想特性的血细胞，特别当与基因疗法结合时(Kiem等人.Mol Ther(2014)July；22(7):1235-38)。

抗HIV细胞是已知存在的，例如CCR5Δ32(32个碱基对删除，包括删除cDNA(基因库登录号NM_000579.3)核苷酸794至825)导致Berlin患者的非功能CCR5蛋白细胞的框移和表达。CCR5是C-C趋化因子受体5型，也称为CD195，其作为趋化因子受体、是参与免疫系统的白细胞表面上的蛋白。HIV的许多形式利用CCR5进入和感染宿主细胞。携带CCR5基因中的CCR5Δ32变体的一些个体被保护免受HIV感染。CCR5的野生型氨基酸序列为：

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL(SEQ ID NO：1)。CCR532的氨基酸序列为：

由于CCR5Δ32纯合个体不常见，且找到HLA匹配的供体非常稀少，研究者正在基因工程化HSC以使其抗HIV。在某些方面，CCR5缺陷型HSC可以用作供体细胞以替代在HSCT中内源CCR5正常的HSC(Li等人.Mol Ther(2013)21(6)：1259-69；Tebas等人.New England Journal of Medicine(2014)370(10)：901-10；Kay和Walker，New England Journal of Medicine 370(10)：968-69；Kalomoiris等人，Hum Gene Ther Methods(2012)23(6)：366-75；Holt等人，Nat Biotech(2010)3-7)。本文所描述的HSCT方法可以与基因工程化的抗HIV细胞或其前体结合使用以通过减少或消除患者中的HIV储存库而治疗感染HIV的个体。在某些方面，可以通过使用本文所描述的HSCT方法结合抗HIV的造血干细胞、抗HIV细胞前体及其抗HIV后代而制定治疗或治愈HIV感染。在某些方面，抗HIV细胞或前体细胞是CCR5敲除的HSC。

这种CCR5缺陷型细胞治疗的原理是感染宿主细胞，除CD4分子之外，HIV需要CCR5作为共受体。CCR5Δ32突变的人纯合子不会感染HIV(即其像Berlin患者一样抗HIV)。相比之下，HIV可以在药物“治愈的”患者和接受HSC移植的淋巴瘤患者中再次出现。此外，由于为了患者的生命以及与常规HSCT预处理(放疗和/或化疗)相关的高风险，需要维持可用的、有效的HIV/AIDS的鸡尾酒药物治疗(尽管较小的HIV-1储存库与病理后遗症如炎症减少相关)，因为涉及有毒性的预处理步骤，除了有其他HSCT适应症如白血病的罕见个体之外，HSCT不可能得到IRB批准用于HIV感染患者。

统计学上极不可能找到HLA-匹配的和CCR5Δ32纯合供体。本文所描述的HSCT方法可以使用自体细胞，是非毒性的(完全不依赖放疗和化疗)，是非免疫抑制的，并且在门诊就可以容易地进行。因此，该方法会是HIV/AIDS患者的理想HSCT方法。

已知多种方法用于制备抗HIV细胞。例如美国专利第8728458号，其通过引用以其整体并入本文，描述了基于慢病毒的CCR5敲降基因。在美国专利公开2005/0220772中，其通过引用以其整体并入本文，筛查供体用于使用常规技术将天然存在的干细胞移植到感染HIV的受试者中。在其它实例中，美国专利公开2011/0262406，其通过引用以其整体并入本文，描述了基因工程化为抗HIV的细胞。抗HIV的细胞及其制备方法是现有技术已知的，可以结合当前的HSCT方法用于HIV感染的治疗。

在一个具体的实施方案中，使用基因组编辑给予HIV抗性的细胞可以与当前描述的HSCT方法结合用于治疗HIV感染。CRISPR/Cas9方法或其他先进的类似技术可以用于产生自体CCR5缺陷型HSC。在某些方面，将表达向导RNA(gRNA)和Cas9核酸酶/切割酶的整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)用于感染从待治疗患者分离的HSC(CD34+)。在某些方面，通过清血法分离HSC。将gRNA设计为结合到CCR5基因内的特定基因组DNA序列和Cas9核酸酶/切割酶两者。Cas9核酸酶/切割酶在DNA的选定位点切割DNA，其会在天然DNA修复反应期间被改变(突变)。突变效率可以达到30％或更高(通过测量仪核酸酶分析测量(Guschin等人,Methods Mol Biol(2010)649:247-56)或深度测序)。IDLV不会整合到宿主基因组中。选择标记如GFP或CD25可以用于富集经工程化的HSC。使用本文所描述的新HSCT方法将CCR5突变的HSC移植到患者中。在某些方面，移植会重复多次以达到足够高的移植水平(通过测量仪核酸酶分析或焦磷酸测序测量)来治疗或治愈患者的HIV感染。在另一方面，在治疗启动前可以通过清血法收集多批次CD34+HSC。

III.试剂盒和制剂

在一些实施方案中，本发明还提供了组合物，其包含1种、2种、3种或更多种干细胞动员剂与以下成分中的一种或更多种：药学上可接受的稀释剂；载体；助溶剂；乳化剂；防腐剂；和/或佐剂。这些组合物可以包含有效量的至少一种干细胞动员剂。因此，还包括在制备药物的药学组合物中使用本文提供的一种或更多种干细胞动员剂。

可以将干细胞动员剂配制成各种剂型的治疗性组合物，该剂型包括但不限于，液体溶液或混悬液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、聚合物微胶囊或微泡、脂质体、可注射或可输注的溶液。优选的剂型取决于施用模式和靶向的具体干细胞。组合物还优选包含本领域已知的药学上可接受媒介、载体或佐剂。

用于药物制剂的可接受制剂组分在所采用的剂量和浓度下对受体是无毒的。除了提供的试剂外，组合物可以包含用于修饰、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、黏度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的组分。用于配制药物组合物的合适材料包括但不限于，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠)；缓冲液(如醋酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β环糊精或羟丙基-β糊精环糊精)；填充剂；单糖；二糖；其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇和山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克、PEG、山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、曲拉通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾，甘露醇山梨醇)；输运载体；稀释剂；赋形剂和/或药学佐剂。(参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,(A.R.Gennaro编辑),1990,Mack出版公司)，在此通过引用并入。

制剂组分以施用位点可接受的浓度存在。有利地使用缓冲液以将组合物维持在生理pH或稍低pH，通常在约4.0至约8.5、或者约5.0至8.0的pH范围内。药物组合物可以包含约pH6.5至8.5的TRIS缓冲液，或约pH4.0至5.5的醋酸缓冲液，其还可以包含山梨醇或其合适的替代物。

用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。可以通过经由无菌过滤膜的过滤完成灭菌。如果组合物是冻干的，灭菌可以在冻干和重构之前或之后进行。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式保存或在溶液中保存。在某些实施方案中，将胃肠外组合物置于具有无菌接入端口的容器中，如具有皮下注射针可刺破的塞子的静脉注射溶液袋或瓶，或准备用于注射的无菌预充注射器。

一旦本发明的药物组合物配制完成，其可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或作为脱水粉末或冻干粉末储存在无菌瓶中。这些制剂可以以或随时可用的形式储存或以施用前重组的形式(如冻干)储存。

如果需要，可以使用药物组合物中通常所采用的稳定剂，如蔗糖、海藻糖或甘氨酸。通常，这些稳定剂会以少量添加，例如约0.1％至约0.5％(重量/体积)。也可以以常规量添加表面活性剂稳定剂，如或(ICI Americas有限公司，布里奇沃特，纽约州，美国)。

用来配制药物组合物的组分优选具有高纯度且基本上不含可能有害的污染物(如至少国家食品(NF)级，通常至少分析级，更典型地至少药物级)。此外，旨在体内使用的组合物通常是无菌的。给定化合物必须在使用前合成，在这个意义上，得到的产品通常基本不含任何可能有毒的试剂。用于肠胃外施用的组合物也是无菌的，基本等渗的并在GMP条件下制成。

对于本发明的化合物，单独或作为药物组合物的一部分，这种剂量为约0.001mg/kg体重至1mg/kg体重，优选约1μg/kg体重至100μg/kg体重，最优选1μg/kg体重至10μg/kg体重。

本领域技术人员会容易确定治疗有效的剂量，且会依赖于疾病的严重程度和进程、患者的健康状况和对治疗的应答、患者的年龄、体重、身高、性别、先前病史和治疗医生的判断。

IV.实施例

包括以下实施例以及附图以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解实施例或附图所公开的技术能代表发明人发现的在本发明实践中发挥良好的技术，因此能够认为构成用于其实践的优选实施方案。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在所公开的具体实施方案中可以做出许多改变，并仍获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1

非细胞毒性HSCT

已经开发了提供温和且基本没有副作用的预处理方案的方法。骨髓是位于特定巢中的造血干细胞(HSC)的家。大多数HSC处于巢中，但是一些(1％至5％)离开其巢进入血液并在血液中流动。HSC从骨髓迁出产生了准备容纳即将到来的HSC的空巢。在临床上通过使用G-CSF或G-CSF和AMD3100的组合的动员可以显著增加HSC迁出。这导致外周血中HSC数增加和骨髓中的空巢增加。前者结果是从外周血管收集HSC的基础；后者结果是本文所描述的基于动员的预处理方案的基础。当空巢在数目上达到峰值时，血液中经动员的HSC会通过清血法去除(并处理用于储存为将来应用)。足够量的移植或替代HSC通过常规静脉注射/输注施用，并与剩余的内源循环HSC竞争以占据骨髓中可用的巢。事实上，小鼠模型数据显示在该程序多循环之后高达90％的移植效率，如通过绿色荧光蛋白阳性(GFP+)外周血细胞(在正常GFP背景上)测量的。

使用14周龄的雄性C57BL/6J同系繁殖小鼠作为受体。连续4天每12小时将G-CSF以125μg/kg体重的剂量经由0.1ml腹膜内注射施用至每只小鼠。然后，在最后一剂G-CSF后14小时和通过尾静脉注射骨髓移植之前1小时，将AMD3100(Mozobil)以5mg/kg体重的剂量经由0.05ml皮下注射施用至每只小鼠。通过用包含0.5％肝素的Iscove改良的Dulbecco培养基冲洗GFP转基因C57BL/6J小鼠的胫骨、股骨、肱骨和臀骨收集骨髓细胞(BMC)。在红血细胞裂解后，在包含2％FBS的0.2ml PBS中，将或全部(25×10⁶)BMC或Sca1+(7×10⁶)BMC给到经G-CSF和AMD3100处理的受体小鼠。通过Anti-Sca-1MicroBead试剂盒(Miltenyi Biotec有限公司)分离Sca-1+细胞。整个过程每2周重复1次。为了评价替代效率，收集外周血，通过流式细胞术和/或免疫荧光显微技术确定GFP+细胞百分比。移植实验数据与基于模型的估计值进行比较(见表1)。

理论上移植效率可以如下建模。

·n＝移植重复数；a＝替代速率/周期；a'＝巢排空速率；y＝供体HSC与总HSC(即供体细胞加内源清除细胞)的比；x＝替代结果(累积％移植物)；

·基于上述HSC及其巢平衡，我们得到；

·x＝1–(1–a’y)ⁿ–[1–(1–a’y)^n-1]*a’*(1-y)＝1–(1–a)ⁿ–[1–(1–a)^n-1]*a’*(1–y)

·当y>0.9时，我们可以忽略项[1–(1–a’y)^n-1]*a’*(1-y)的小值，并具有以下：

·x＝1–(1-a)ⁿ

假设抑制速率/每个为0.17(17.0％，基于我们的初步数据和文献)，那么：

表1.动员辅助的HSC移植

实验值x是HSCT从GFP+小鼠到野生型小鼠指定循环后血液中GFP+细胞百分比。基于在供体GFP转基因小鼠中87％的白细胞是GFP+的发现，计算调整值x。

由于C57BL/6J小鼠是高度同系繁殖的，其彼此基因相同。其之间的组织或器官移植与人纯合双胞胎之间或自体移植是免疫上等同的，因此不引起免疫反应如移植排斥或移植物抗宿主反应。另外，因为小鼠身体尺寸非常小，具有小体积血液，所以清血法并不适合它们。因此，将小鼠处死用于收获骨髓作为供体细胞来源。在人类中，如临床目前实践的，在G-CSF和AMD3100动员之后，供体细胞可以来自他/她自身。所收集的细胞会被冷藏保存。需要多个循环的收集和储存用于后来的移植。

实施例2

通过单核细胞/巨噬细胞中ApoE过表达而改善动脉粥样硬化

基于慢病毒HSC基因疗法的人apoE巨噬细胞表达减少apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变。将用编码人apoE的慢病毒载体转导的ApoE-/-HSC富集的骨髓细胞用于移植经致死剂量辐射的apoE-/-小鼠。apoE表达由先前开发的合成巨噬细胞启动子(SP-apoE)所驱动。移植后16周从受体小鼠收集的腹膜巨噬细胞证明以高水平表达人apoE(图2，左图)。10至26周龄的apoE巨噬细胞表达显著减少了受体apoE-/-小鼠中的动脉粥样硬化病变(图2，中图和右图)。在图2中，SP-GFP、SP-apoE和CMV-apoE(CMV启动子驱动型人apoE基因)是在这些转导和移植实验中使用的慢病毒载体，而Pos C表明野生型骨髓供体组(He等人,Hum.Gene Ther.17(9),949(2006))。

实施例3

通过巨噬细胞/小胶质细胞输送生长因子保护黑质多巴胺能神经元治疗帕金

森症

MitoPark^TM小鼠模型提供了用于解决帕金森症其他小鼠模型局限性的深刻含义。MitoPark^TM小鼠代表DA神经元中线粒体转录因子A(Tfam)的条件性敲除。TFAM蛋白促进mtDNA转录和复制。尽管Tfam中的人基因突变还没有与PD关联，但散发性PD特征在于线粒体功能障碍及线粒体在PD发病机理中的作用是广泛接受。注意到MitoPark^TM小鼠具有人PD的几个特征，并且与大多数当前可用的小鼠动物模型相比是PD的特别可靠模型。DA神经元损失的慢性和渐进性本质会不仅补充MPTP引起的DA神经元严重损失的先前研究，还会使得发明人能够涉及或治疗范例或预防范例。

由10至12周龄可明显看出，MitoPark^TM小鼠呈现出自发性活动力的渐进性损伤。竖直运动比水平运动下降更早和更快(数据未显示)，建模PD中轴向位置不稳定性的早期发生。通过施用L-DOPA暂时逆转运动缺损。另外，发现MitoPark^TM小鼠在旋转杆行为中发展了损伤。令人感兴趣的是，蔗糖偏好测试显示了明显的抑郁症状。MitoPark^TM小鼠从～20周龄开始体重减轻，在29至33周龄时死亡，在此时已经失去大多数黑质DA神经元。因此，MitoPark^TM小鼠呈现出与文献报道一致的PD样表型。

为了评价巨噬细胞脑渗透，用来自同龄GFP转基因小鼠供体的GFP+骨髓细胞移植14周龄MitoPark^TM小鼠和同胎仔畜对照。移植预处理使用定制铅管通过头部防护辐射(以避免大脑辐射引起的巨噬细胞渗透的可能贡献)完成。如由受体外周血中的GFP+细胞百分比所证明的，移植效率为～80％。移植后5周，处死小鼠以评价回归至SN的巨噬细胞。在对照同胎仔畜中，在SN中很少观察到GFP+细胞，而在MitoPark^TM小鼠的SN中发现了许多表达GFP的细胞，其大多数还对小胶质标记Iba1是阳性的。

基于HSC的巨噬细胞输送GDNF可以用于保护黑质纹状体多巴胺能神经系统，引起病理变化、生化变化和神经系统缺陷的显著改善，没有主要的副作用。12周龄、18周龄和24周龄的同基因供体老鼠的富集HSC的骨髓细胞用由巨噬细胞特异性启动子(MSP-GDNF或MSP-GFP)驱动的表达hGDNF或GFP cDNA的慢病毒载体转导。MSP-GFP-2A-GDNF慢病毒载体也用于一些研究中。将经转导的细胞移植到经头部防护辐射(为了减轻直接脑辐射可能导致BBB阻断，因此利于巨噬细胞渗入的任何问题)的同龄MitoPark^TM小鼠。重要的，虽然辐射作为预处理方法是最方便的和广泛用于小鼠的，但是在PD患者的临床阶段使用本文所描述的方法而不是辐射。HSCT后4周确认转导/移植效率。进行体重、行为测试、组织收集、各种检查和数据分析。

为了成功实现骨髓造血干细胞源性巨噬细胞介导的GDNF基因疗法，设计了一系列强大的巨噬细胞特异性合成启动子(MSP)以将转基因表达限制到该谱系(He等人,2006)。在该启动子下，慢病毒转导的骨髓干细胞源性巨噬细胞显示了强大且稳定的转基因表达最长移植后15个月(研究最长时间点)。使用高活性MSP，测试了经基因修饰的骨髓干细胞源性巨噬细胞作为将GDNF输送到PD小鼠模型神经退化位点的载体的效用。已显示巨噬细胞介导的GDNF治疗显著改善了黑质多巴胺能神经元及其在纹状体中末梢的MPTP引起的退化、刺激轴突再生和逆转活动减退。

尽管本文所描述的方法优于GDNF输送的现有方法，但是该研究中的TH-免疫活性增强、DA新陈代谢和行为改变和几个先前研究类似。原理证明实验中使用的单独MPTP方案仅引起TH阳性细胞的适度减少(约50％)。此外，该MPTP方案通常观察到的黑质纹状体系统的同时复原限制了评价运动协调。为了克服这些限制并显示出骨髓源性巨噬细胞介导的GDNF输送的优越性，发明人提出使用慢性MPTP/丙磺舒小鼠模型。在该模型中，多巴胺细胞损失是渐进性的并超过70％，提高了细胞外谷氨酸，形成了路易体状的(Lewy body-like)细胞质内含物，炎症是慢性的(Meredith等人,2008)。此外，该行为损害持续长达MPTP/p处理后6个月。发明人已在其实验室中将该模型标准化。在先前的工作中，在神经退化之前开始GDNF治疗，其在临床是不可能的，因为在可察觉的临床症状出现之前百分之五十的神经元已经损失。发明人在相当大的神经退化已经发生之后启动GDNF治疗。为此目的，已经开发了由MSP(LV-MSP-Tet-On-GDNF)驱动的表达人GDNF基因的四环素调节的慢病毒载体。该载体使得人能够在神经退化已经发生后的不同时间点“开启”GDNF表达，由此接近地模仿临床帕金森症的早期、中期和晚期。在用多西环素处理之后，巨噬细胞系RAW 264.7和用LV-MSP-Tet-On-GDNF载体转导的骨髓源性巨噬细胞显示出GDNF的强劲表达，多西环素是抗生素四环素家族成员。

巨噬细胞特异性合成启动子。发明人已经开发了将转基因表达限制到该谱系的一系列巨噬细胞特异性合成启动子，并使用或荧光素酶报告基因分析表征其强度和特异性，随后在几种巨噬细胞系和非巨噬细胞系中瞬时转染，或在小鼠模型中的GFP报道基因(He等人,2006)。在人单核细胞系Thp-1和Mono Mac-1以及小鼠巨噬细胞RAW264.7中(图3)，合成启动子的荧光素酶活性极高(CSF1R或CD11b启动子的10至200倍，图3)。相比之下，在非巨噬细胞系如人肠上皮细胞Caco-2、宫颈上皮癌细胞Hela、胚胎肾细胞293(图3)、T淋巴细胞Jurkat和小鼠成骨细胞Oct-1中(数据未显示)，与普遍存在的CMV启动子相比，合成启动子的特异性荧光素酶活性极低(图3)。

构建由巨噬细胞特异性合成启动子驱动的表达GDNF基因的慢病毒载体。包含巨噬细胞特异性合成启动子的慢病毒载体(参见Biju等人,2010)是以上述设计为基础的(He等人,2006)。巨噬细胞特异性合成启动子(MSP)由包含两个顺式元件的序列C/EBP和AML-1组成。用CD68微型启动子基因替代初始设计中的p47phox微型启动子基因以进一步增加特异性。然后使用标准分子流程用大鼠GDNF基因(基因库#NM019139，STS 50-685)替代初始设计中的报道基因(荧光素酶/GFP)。将得到的构建体测序以验证插入位点以及GDNF基因的完整性。还生成了类似的慢病毒载体并将其用作对照，该载体携带编码由巨噬细胞特异性启动子驱动的GFP的基因。

骨髓移植后巨噬细胞特异性合成启动子体内驱动单核细胞/巨噬细胞中的转基因表达。使用由巨噬细胞特异性合成启动子(MSP)驱动的编码或GDNF或GFP的慢病毒载体基因修饰来自供体小鼠的骨髓细胞。将七至八周龄的C57BL/6J雄性受体小鼠致死辐射，然后移植或GDNF(MSP-GDNF小鼠)或GFP(MSP-GFP小鼠)载体转导的骨髓细胞。所有经移植的动物都存活且没有明显疾病。三周之后，分析来自受体小鼠的外周血样品的合成启动子的组织特异性(图4A、4B、4C)及其驱动GDNF合成和分泌的效率(图4D)。在MSP-GFP小鼠中，大部分(约66％)的CD11b(单核细胞/巨噬细胞标记)阳性的白细胞表达GFP(图4A)，而仅5％至7％的CD11b阴性白细胞低水平表达GFP(图4A和4B)，表明巨噬细胞特异性合成启动子选择性地驱动单核细胞/巨噬细胞中的转基因表达。在红细胞中未观察到转基因表达(图4C)。在MSP-GDNF小鼠中，在血浆中检测到显著量(1.723±0.622ng/ml)的GDNF蛋白，表明移植后经基因修饰的细胞能够合成和分泌GDNF。在骨髓移植后整6个月的实验期中，在MSP-GDNF小鼠血浆中检测到持续水平的GDNF蛋白，而在MSP-GFP小鼠血浆中未检测到GDNF(图4D)。为了评价巨噬细胞合成启动子体内长期活性，使用七只MSP-GFP小鼠的亚组。在骨髓移植后1.5个月、4个月、8个月、11个月和15个月，分析这些小鼠外周血的GFP表达(图4E)。全部白细胞的约26％至30％表达GFP，且在骨髓移植后整15个月的实验期中GFP表达相当稳定。

单核细胞/巨噬细胞分化额日小胶质细胞及增强其在神经退化期间补充至黑质。移植后八周，将受体小鼠注射MPTP以诱导多巴胺能神经元退化。将溶于生理盐水中的MPTP如下经皮下注射至MSP-GDNF和MSP-GFP小鼠中：第1天15mg/kg游离碱MPTP，第二天25mg/kg，第3天至第7天30mg/kg。按照相同方案用生理盐水处理对照小鼠。最后一次注射MPTP或生理盐水9周后，处死MSP-GFP小鼠以评价经基因修饰的巨噬细胞分化为小胶质细胞及其补充至黑质。在大脑中，经基因修饰的巨噬细胞强烈地表达GFP，展现出小胶质细胞的分枝形态学特征，并表达黑质标记Iba1。在经生理盐水处理的MSP-GFP小鼠中，在黑质中观察到一些GFP细胞，而经MPTP处理的小鼠黑质中GFP细胞数显著增加(参见Biju等人,2010)。在MSP-GFP小鼠中，最后一次注射MPTP 9周后，黑质中全部小胶质细胞(Iba1阳性)的47％是骨髓源性的，而在经生理盐水处理的MSP-GFP小鼠中，骨髓源性小胶质细胞比例仅为14％(图5A和5B)。在经MPTP处理的MSP-GFP小鼠黑质的一些区域中，大多数Iba1阳性细胞是骨髓源性的(图5C)。类似地，在MPTP引起多巴胺能纤维末端退化之后，MSP-GFP小鼠纹状体中GFP阳性小胶质细胞数显著增加(数据未显示)。该结果表明经基因修饰的骨髓源性小胶质细胞优先补充至脑受损位点，因此为骨髓干细胞源性巨噬细胞用于GDNF持续输送至选择性脑损伤位点的治疗用途提供了原理证明。更重要的是，发现经基因修饰的骨髓源性小胶质细胞靠近TH阳性神经元(图5D)，提供了小胶质细胞分泌的治疗性分子会进入将死神经元的额外证据。

另外，在巨噬细胞移至大脑及其随后分化为小胶质细胞之后，测量黑质和纹状体中的GDNF水平以确定没有发生基因沉默。最后一次注射MPTP 9周后，在MSP-GDNF小鼠中，平均黑质GDNF蛋白水平为36.42±6.10pg/mg组织，而MSP-GFP小鼠中内源黑质GDNF的水平为8.38±1.34pg/mg组织(图6A)。与MSP-GFP小鼠(13.53±0.63pg/mg组织)相比，观察到MSP-GDNF小鼠的纹状体GDNF水平显著提高(21.56±1.19pg/mg组织)(图6B)。对于这种缓慢渐进性疾病如PD，GDNF疗法的重要目标应该是经年持续输送以维持多巴胺神经元存活和功能。然而，如果将大量GDNF长期注入脑内，GDNF的广泛作用特别对于非多巴胺神经元可能成为麻烦。临床试验和动物实验中的严重副作用归因于非常高剂量的GDNF(Bohn,1999)。然而，使用骨髓源性小胶质细胞，用相对低和明显安全水平的组织暴露于GDNF，可以实现MPTP诱导的神经退化显著减少，因此减少剂量相关的副作用。值得注意的是，本研究中MSP-GDNF小鼠中GDNF的脑组织水平为约36pg/mg组织，而病毒介导的基因转移导致最高4200pg/mg组织(Georgievska等人,2004)。在猴子(心室内注射)和大鼠(黑质注射)中，治疗应答所需要的GDNF注入剂量为10⁸pg至10⁹pg(100μg至1000μg)(Bowenkamp等人,1995；Zhang等人,1997)。高剂量(100μg/天)的核壳内GDNF引起显著的小脑浦肯野(Purkinje)细胞死亡(Hovland,Jr.等人,2007)。

为了证明即使当神经元死亡率相对低时，骨髓源性小胶质细胞补充仍然发生，用生理盐水或MPTP通过使用连续渗透微型泵注入系统(Model#2006，Alzet，库比蒂诺，CA)处理MSP-GFP小鼠。将微型泵经皮下植入动物上背部。微型泵以0.35.μl/小时的流速输送生理盐水或MPTP持续28天。MPTP溶液的浓度以动物接受的方式调节或每天5mg MPTP/kg持续28天。在第30天(开始MPTP或生理盐水后)，杀死动物，分析大脑TH阳性细胞损失和SNpc中骨髓源性GFP细胞的补充。MPTP连续输注28天导致损失SNpc中约31％的TH阳性细胞(图7A)。该损失伴随着SNpc中骨髓源性GFP细胞数4倍增加(图7B)，表明即使每天一些神经元死亡，骨髓源性小胶质细胞补充仍然发生。

巨噬细胞介导的GDNF输送保护黑质多巴胺神经元及其在纹状体中的末端。最后一次MPTP或生理盐水注射3周或9周后，处死受体小鼠，通过黑质致密部(SNpc)TH阳性神经元的定量分析及纹状体中TH阳性末端的密度，评价巨噬细胞介导的GDNF输送对黑质纹状体多巴胺能系统的神经保护作用。在经生理盐水处理的MSP-GFP和MSP-GDNF动物组中，TH免疫反应神经元的组织及强度基本相似(参见Biju等人,2010)。体视学分析证实与经生理盐水处理的动物相比，MPTP处理后MSP-GFP小鼠SNpc中的TH阳性神经元损失50％至55％。在MSP-GFP小鼠中，MPTP处理后黑质下网状部分(SNpr)中的TH阳性树突状纤维网络也显著减少。相比之下，MSP-GDNF小鼠SNpc中MPTP引起的TH阳性神经元仅损失15％至20％。此外，当面对MPTP处理时，相对于生理盐水处理，MSP-GDNF小鼠中的SNpr TH-阳性树突状纤维网络密度很大程度上保留。另外，计数每个处理组SNpc中Nissel染色的神经元总数以确保GDNF处理确实阻止实际细胞死亡(图8)。

观察纹状体多巴胺纤维末端的平行结果。为了定量TH染色的强度，在纹状体的背外侧面上进行光学密度测量，所述纹状体的背外侧面接收来自SNpc多巴胺神经元的最大份额的神经支配。通过该方法，纹状体内的TH免疫反应性在MSP-GFP和MSP-GDNF小鼠的生理盐水组是类似的(参见Biju等人,2010)。相对于对照，MPTP处理后3周处死的MSP-GFP小鼠中TH染色强度平均损失70％，而在MSP-GDNF小鼠中损失仅有35％(参见Biju等人,2010)。令人感兴趣的是，MSP-GDNF小鼠中的TH染色强度随时间提高。在最后一剂MPTP 9周后处死的MSP-GDNF小鼠中，TH染色强度减少仅15％(参见Biju等人,2010)，表明黑质纹状体路径内的持续再生过程。事实上，经MPTP处理的MSP-GDNF小鼠纹状体的显微镜检查显示出许多长而厚的TH阳性纤维(参见Biju等人,2010)，其经常分枝为不规则突起，表明黑质多巴胺神经元的出芽或轴突再生。基本上，在经MPTP处理的MSP-GFP小鼠纹状体中较少观察到这种纤维。

为了进一步确认，生化测定多巴胺及其代谢物、二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的组织水平。与经MPTP处理的MSP-GFP小鼠相比，经MPTP处理的MSP-GDNF小鼠黑质呈现出显著更高水平的多巴胺(38.8％)、DOPAC(27.7％)和HVA(40.3％)(参见Biju等人,2010)。还测定了另一种单胺类神经递质5-羟色胺及其代谢物5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的黑质水平以评价经MPTP处理的MSP-GDNF相对于MSP-GFP小鼠中多巴胺及其代谢产物水平的相对保留是选择性的还是可能对单胺类神经递质的普遍效果。这些分析证实了经MPTP处理组MSP-GFP相对于MSP-GDNF小鼠中5-HT和5-HIAA的类似水平。

GDNF对MPTP引起的小鼠行为损伤的影响。通过旷场试验评估的一般活动水平证实了相对于对照小鼠，MPTP处理显著降低MSP-GFP小鼠活动水平。相比之下，将MSP-GDNF小鼠的活动保留为与对照小鼠类似的水平。此外，MSP-GFP小鼠呈现出减少体重归一化的食物摄入，该效果在MSP-GDNF小鼠中是相反的。

评价GDNF疗法的副作用。直接大脑输注GDNF已经示出引起副作用，包括触摸痛和体重减轻(Hoane等人,1999)。在发明人的研究中，如通过在后足中趾表面使用丙酮应答的缩足频率或持续时间所确定的，没有动物显示触摸痛迹象。贯穿实验期间每2天记录体重，表示为初始体重的平均变化。尽管在全身辐射或移植后，MSP-GFP组和MSP-GDNF组都急剧损失重量，但两组均快速体重反弹并继续获得额外重量。随着时间，MSP-GFP小鼠比MSP-GDNF小鼠获得显著更多的重量，即便在施用MPTP后仍继续该趋势。GDNF在CNS外施加生物效应，在胚胎发育期间充当肾脏形态发生素，调节睾丸中的精原细胞分化。相应地，分析MSP-GFP和MSP-GDNF小鼠的睾丸可能归因于循环GDNF水平不同的变化。在光显微水平下，睾丸的苏木精和伊红染色部分没有观察到结构或形态学变化。

由MSP驱动的慢病毒载体表达的四环素调节的GDNF基因。在上述数据中，在MPTP引起神经退化之前给予GDNF，其在临床情况下是不可能的，因为在可察觉临床症状之前超过50％的多巴胺能神经元已经失去。因此，如果在施用MPTP之后进行该处理，将会有更大益处(恢复性)。由于所涉及的过程的复杂性，在MPTP处理开始后，技术上进行骨髓移植极其困难。使用可以被外部因素开启的经调控载体会允许我们在MPTP处理后各时间点给予GDNF，并模拟临床帕金森症的早期、中期和晚期。在该方案中，在MPTP处理前进行移植；然而，GDNF的表达和输送会延迟直到在MPTP处理后通过在不同时间点施用多西环素而被“开启”。为此目的，发明人开发了经四环素调控的MSP-GDNF慢病毒载体。将可以在施用四环素的控制下表达治疗性基因的最新一代慢病毒载体(Szulc等人，2006)修饰为用MSP替代PGK启动子。首先，慢病毒载体pLVPT-tTR-KRAB非重要区域中的Bsu15I位点通过部分酶切被破坏，然后钝端处理并再连接。第二，用Bsu15I在bp2148处和用BamHI在bp2695处酶切得到的质粒以释放PGK启动子。第三，MSP被PCR扩增并插入线性化慢病毒载体以得到pLVMPT-tTR-KRAB。第四，用BamHI在bp2695处和用SmaI在bp3402处酶切质粒，向其插入包含BamHI-XmaI-AscI-PmeI-BsiWI-dSmaI的小连接子(该步骤是为了修饰载体以促进用治疗性基因替换EGFP基因)。第五，为了释放EGFP基因，用XmaI和PfI23I酶切载体。通过PCR扩增GDNF ORF，并用AgeI和BstGI酶切，其分别向XmaI和PfI23I提供合适的黏性末端。第六，将GDNF基因插入载体中以产生最终构建体LV-MSP-Tet-On-GDNF(图9A)。通过ELISA，在骨髓源性巨噬细胞中体外测试LV-MSP-Tet-On-GDNF的GDNF产生(图9B)，显示在添加多西环素(2μg/ml)后24小时GDNF蛋白增加最高20倍。

MPTP/丙磺舒小鼠模型。使用仅用MPTP的帕金森症模型，发明人示出骨髓源性巨噬细胞用于向选择性大脑损伤位点持续输送GDNF的治疗性用途的原理证明。然而，单独MPTP方案导致TH阳性细胞仅适度减少(约50％)。另外，一般用该方案所观察到的黑质纹状体系统的自发恢复限制了检测运动协调变化。使小鼠经历运动协调测试，包括旋转棒测试、步态测试/足迹分析、爬杆实验、横杆跑动实验和网格试验。这些测试均未显示出经生理盐水处理的对照组和经MPTP处理组之间的统计学显著差异，与暴露于MPTP的幼年和成年小鼠行为障碍仅在纹状体多巴胺含量极大减少时发生并且通常是短暂的报道一致(Tillerson和Miller,2003)。为了克服该限制并示出骨髓源性巨噬细胞介导的GDNF输送优于各种其他方法，发明人使用长期MPTP/丙磺舒(MPTP/p)小鼠模型。在MPTP/p小鼠模型中，多巴胺细胞损失是渐进性的并超过70％，形成细胞质内含物，该行为损害在MPTP/p处理后持续最高6个月(Meredith等人,2008)。

为了在实验室中标准化该模型，用10剂含25mg/kg MPTP-HCl的生理盐水注射(皮下注射)称重为20g至24g的八只雄性C57BL6/J小鼠，以3.5天间隔注射含250mg/kg丙磺舒的Tris-HCl缓冲液(腹膜注射)5周(Meredith等人,2008)。用生理盐水和丙磺舒类似地处理10个对照。MPTP/p或生理盐水/p处理后3周，使动物经历一连串协调和刚性行为测试。然后将小鼠用固定剂(4％多聚甲醛)心脏灌流，处理大脑用于组织学和基于无偏设计的体视学。正如报道的，该处理导致黑质中TH阳性神经元(图10A)与显示路易状内含物的许多TH阳性神经元(图10B)减少约70％。通过旋转棒测试(图10C)、旷场试验(图10D和10E)、横杆跑动实验(图10F)和爬杆试验(图10G和10H)评价，MPTP/p处理导致运动能力的显著损害。

序列表

<110> 德克萨斯大学系统董事会

<120> 用于非细胞毒性干细胞移植的方法和组合物

<130> UTFK.P0442WO

<140> 未知

<141> 2015-05-07

<150> 61/990,698

<151> 2014-05-08

<150> 62/061,370

<151> 2014-10-08

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 352

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr

1 5 10 15

Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu

20 25 30

Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn

35 40 45

Met Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met

50 55 60

Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu

65 70 75 80

Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe

85 90 95

Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe

100 105 110

Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu

115 120 125

Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe

130 135 140

Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser

145 150 155 160

Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr

165 170 175

Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn

180 185 190

Phe Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu

195 200 205

Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys

210 215 220

Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile

225 230 235 240

Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu

245 250 255

Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser

260 265 270

Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr

275 280 285

His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe

290 295 300

Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys His Ile Ala Lys Arg Phe

305 310 315 320

Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser

325 330 335

Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu

340 345 350

<210> 2

<211> 215