组织再生基材和组织再生基材的制造方法与流程

本发明涉及细胞的侵入性优异、并且能够有效防止细胞从组织再生基材的漏出、能够促进组织的再生的组织再生基材以及该组织再生基材的制造方法。

背景技术：

由于近年来的细胞工程技术的进展，能够培养包括人类细胞在内的多种动物细胞，另外，使用这些细胞来构建人类的组织或器官的所谓的再生医疗的研究快速发展。更具体而言，例如以软骨、骨骼、皮肤、血管等组织或器官的再生为目的的再生医疗的研究在发展。

在再生医疗中，重点在于细胞是否能够增殖分化来构建三维的生物体组织样的结构物，例如，进行着将基材移植到患者的体内，使细胞从周围的组织或器官侵入基材中，之后进行增殖分化，而使组织或器官再生的方法。

另外，作为将生物体组织中产生的病灶在内窥镜下切除的方法，进行使用自动缝合器等的切除术。在对肺、支气管、肝脏、消化道等脆弱的组织、因病变导致脆弱化的组织进行切除术的情况下，仅通过进行缝合存在组织破裂的危险，另外，在例如肺的手术中会存在发生空气泄露的危险。因此，进行着将缝合强化材料缝合在生物体组织的切除部位的操作。

作为这样的再生医疗用的基材、缝合强化材料，提出了例如专利文献1所公开的由生物体吸收性材料构成的无纺布。由生物体吸收性材料构成的无纺布在用作再生医疗用的基材或缝合强化材料的情况下，细胞从其空隙部分侵入并增殖，可以期待组织尽快再生。另外，在作为脆弱的组织的强化材料使用的情况下，能够防止组织的破裂，能够防止空气泄露的发生等。此外，由于经过一定期间后降解而被生物体吸收，所以具有不需要再用手术取出的优异性能。

然而，实际上，即使使用现有的由生物体吸收性材料构成的无纺布，也存在有时无法如期待那样促进组织的再生的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平05－076586号公报

技术实现要素：

发明所要解决的课题

关于构成组织再生基材的无纺布，已知为了确保细胞的侵入性优选5～30μm左右的平均孔径。本发明的发明人深入研究的结果，发现这样的现有的组织再生基材虽然在细胞的侵入性的方面优异，但是侵入的细胞的一部分有时通过组织再生基材，会泄露到组织再生基材之外。可以认为由于侵入的细胞泄露到组织再生基材之外，实际上留在患部的细胞成分的浓度不足，所以无法如期待那样促进组织的再生。另一方面，在为了防止细胞的漏出而减小无纺布的平均孔径的情况下，会损害细胞的侵入性，无法促进组织再生。

本发明鉴于上述现状，其目的在于提供细胞的侵入性优异、并且能够有效防止细胞从组织再生基材漏出、能够促进组织的再生的组织再生基材以及该组织再生基材的制造方法。

用于解决课题的方法

本发明是一种组织再生基材，其为由生物体吸收性材料所构成的无纺布构成的组织再生基材，包括：由平均孔径为20～50μm的无纺布构成的层和由平均孔径为5～20μm的无纺布构成的层复合一体化而成的叠层结构。

以下详述本发明。

本发明的发明人深入研究的结果，发现具有相对于由平均孔径为20～50μm的无纺布构成的层(以下，也称为“细胞侵入层”。)、将由平均孔径为5～20μm的无纺布构成的层(以下，也称为“细胞漏出防止层”。)复合一体化而成的叠层结构的组织再生基材，能够在维持优异的细胞侵入性的同时，防止细胞泄露到组织再生基材之外，能够促进组织的再生，从而完成了本发明。

这里，重要的是上述细胞漏出防止层也为由具有一定范围的平均孔径的无纺布构成的层。如果仅仅防止体液或血液等所含的游离细胞的漏出，则例如通过将由生物体吸收性材料构成的膜叠层而能够发挥同样的效果。然而，在将膜叠层的情况下，无法充分得到促进组织的再生的效果。本申请发明的优异效果通过将由平均孔径为5～20μm的无纺布构成的层作为细胞漏出防止层才得以发挥。

这是因为由平均孔径为5～20μm的无纺布构成的层虽然几乎不使体液、血液等中游离的细胞通过，但体液能够顺利地通过。另一方面，可以认为是由于如果细胞漏出防止层的孔径为该孔径，则促进粘附细胞从细胞侵入层向细胞漏出防止层的侵入，并且向细胞侵入层中增殖的细胞的营养的供给变得充分。另外，可以考虑能够缓和由体液的浸润产生的应力，因此也保持组织再生基材对患部的紧贴性。

上述细胞侵入层成为捕捉到的体液和血液等所含的游离细胞、粘附后的细胞和从周围组织侵入的细胞发生增殖的支架，具有促进组织的再生的作用。

上述细胞侵入层由生物体吸收性材料所构成的无纺布构成。

作为构成上述细胞侵入层的生物体吸收性材料，可以列举例如：聚乙醇酸交酯、聚乳酸、聚－ε－己内酯、丙交酯－乙交酯共聚物、乙交酯－ε－己内酯共聚物、丙交酯－ε－己内酯共聚物、聚二噁烷酮、聚柠檬酸、聚苹果酸、聚－α－氰基丙烯酸酯、聚－β－羟基酸、聚三亚甲基草酸酯、聚四亚甲基草酸酯、聚原酸酯、聚原碳酸酯、聚碳酸乙烯酯、聚－γ－苄基－l－谷氨酸、聚－γ－甲基－l－谷氨酸、聚－l－丙氨酸等的合成高分子、淀粉、褐藻酸、玻尿酸、壳聚糖、果胶酸及它的衍生物等的多糖类、明胶、胶原蛋白、白蛋白、纤维蛋白等的蛋白质等的天然高分子等。这些生物体吸收性材料既可以单独使用，也可以并用2种以上。

上述生物体吸收性材料中，优选聚乙醇酸交酯。在使用聚乙醇酸交酯的情况下，特别是细胞的侵入性优异，能够进行正常的组织的再生。聚乙醇酸交酯例如将其制成纤维状后浸渍在37℃的生理盐水中时，拉伸强度变成浸渍前的1/2为止的期间约为14天。由于具有这样的降解性，可以认为在细胞增殖、组织再生的时期，基材被慢慢降解吸收，构建再生到基材内部的组织，作为其结果，构建出优质的再生组织。此外，由于埋入生物体内后数天炎症系的细胞消失，所以还能够发挥不易引起组织粘连的优异的效果。

此外，在本说明书中，聚乙醇酸交酯是指聚乙醇酸等的乙交酯的聚合物，但在不妨碍本发明的效果的范围内，也可以设为与丙交酯、ε－己内酯、p－二噁烷酮等其他的生物体吸收性的成分的共聚物。另外，在不妨碍本发明的效果的范围内，也可以制成与聚乳酸等其他的生物体吸收性材料的混合物。

在上述聚乙醇酸交酯为与丙交酯、ε－己内酯、p－二噁烷酮等其他的生物体吸收性的成分的共聚物的情况下，该共聚物中乙交酯成分的配合量的优选下限为60摩尔％。通过将乙交酯成分的配合量设为60摩尔％以上，特别能够发挥细胞的侵入性优异、且进行正常的组织的再生的本发明的优异的效果。

在使用上述聚乙醇酸交酯与聚乳酸等其他的生物体吸收性材料的混合物的情况下，该混合物中的聚乙醇酸交酯的配合量的优选下限为50摩尔％。通过将聚乙醇酸交酯的配合量设为50摩尔％以上，特别能够发挥细胞的侵入性优异、且进行正常的组织的再生的本发明的优异的效果。

在上述生物体吸收性材料为聚乙醇酸交酯的情况下，该聚乙醇酸交酯的重均分子量的优选下限为30000，优选上限为400000。如果上述聚乙醇酸交酯的重均分子量低于30000，则有时强度不足，得不到充分的组织强化效果，如果超过400000，则生物体内的降解速度变慢，有时会发生异物反应。上述聚乙醇酸交酯的重均分子量的更优选下限为50000，更优选上限为300000。

在上述生物体吸收性材料为聚乙醇酸交酯的情况下，可以用熔体流动速率作为该聚乙醇酸交酯的分子量的代替指标。该聚乙醇酸交酯的熔体流动速率的优选下限为0.1g/10分钟，优选上限为100g/10分钟。如果在该范围内，则容易制作由聚乙醇酸交酯构成的无纺布。聚乙醇酸交酯的熔体流动速率的更优选下限为1g/10分钟，更优选上限为50g/10分钟。

此外，熔体流动速率的测定条件是指将聚乙醇酸交酯在料筒内于240℃保持10分钟熔融后，在负荷4kgf的条件下测定的值。

构成上述细胞侵入层的无纺布的平均孔径的下限为20μm，上限为50μm。在上述细胞侵入层满足这样的平均孔径的情况下，能够提供细胞的侵入性优异、且适合正常的组织的再生的组织再生基材。无纺布中的孔径为20～50μm的孔中，细胞能够容易侵入，在细胞侵入层中能够增殖、分化而形成组织。相对于此，如果平均孔径低于20μm，则血液等之中所含的游离细胞无法高效地侵入，如果平均孔径超过50μm，则虽然游离细胞能够侵入，但由于细胞间的距离过大，所以粘附于细胞侵入层的细胞、从周围组织侵入的细胞无法充分增殖、分化。构成上述细胞侵入层的无纺布的平均孔径的优选下限为22μm，优选上限为40μm，更优选下限为24μm，更优选上限为30μm。

此外，在本说明书中，无纺布的平均孔径是指通过泡点法测定的平均孔径。

对于利用上述泡点法进行的无纺布的孔径分布的测定进行说明。

泡点法是指如下方法：使可以充分浸润测定对象的膜的液体预先吸收到膜的细孔内，设置于如图1所示的器具，从膜的背侧施加空气压，测定在膜表面能够观察到发生气泡的最小压力(泡点)，从液体的表面张力与泡点的关系式推算孔径分布(图2)。

具体而言，使作为测定对象的无纺布吸收湿润液(例如、氟系溶剂、商品名porofil(商标))后，在如图1所示的器具(例如、日本贝尔公司制、porometer3g)以试验片尺寸为直径25mm的圆状的方式设置后，从无纺布的背侧施加空气压，测定在膜表面能够观察到发生气泡的最小压力(泡点)。

此外，在图2中记载的计算细孔径的式子中，γ表示浸润液的表面张力，θ表示无纺布原材料上的浸润液的接触角，δp表示泡点压。

构成上述细胞侵入层的无纺布的平均纤维直径没有特别限定，优选下限为10μm，优选上限为50μm。在上述无纺布的平均纤维直径在该范围的情况下，容易将平均孔径调整在上述规定的范围。上述无纺布的平均纤维直径的更优选下限为15μm，更优选上限为40μm。

此外，无纺布的平均纤维直径能够通过根据使用扫描型电子显微镜以1000倍拍摄得到的无纺布的图像，对于能够测定纤维直径的全部纤维测量其中点的直径，算出其平均值，由此获得无纺布的平均纤维直径。

上述细胞侵入层的厚度没有特别限定，优选下限为300μm，优选上限为2.0mm。如果上述细胞侵入层的厚度低于300μm，则有时强度不足，无法用于强化脆弱的组织，如果超过2.0mm，则操作性变差。上述细胞侵入层的厚度的更优选下限为450μm，更优选上限为1.5mm。

上述细胞漏出防止层会防止体液、血液等之中所含的游离细胞泄露到组织再生基材之外，并且会使体液顺利通过，由此具有促进细胞向上述细胞侵入层的侵入，发挥保障对上述细胞侵入层中增殖的细胞的营养供给的作用。另外，在细胞侵入层增殖的细胞能够侵入细胞漏出防止层内部，能够防止仅该细胞漏出防止层发生脱落。

上述细胞漏出防止层由生物体吸收性材料所构成的无纺布构成。

作为构成上述细胞漏出防止层的生物体吸收性材料，能够使用与上述细胞侵入层中使用的材料同样的生物体吸收性材料。构成上述细胞漏出防止层的生物体吸收性材料既可以与构成上述细胞侵入层的生物体吸收性材料相同，也可以不同。

构成上述细胞漏出防止层的无纺布的平均孔径的下限为5μm，上限为20μm。在上述细胞漏出防止层满足这样的平均孔径的情况下，能够防止体液或血液等之中所含的游离细胞从组织再生基材漏出，并且能够使体液顺利地通过，能够促进细胞向上述细胞侵入层的侵入，保障向上述细胞侵入层中增殖的细胞的营养的供给。此外，在细胞侵入层增殖的细胞也能够侵入细胞漏出防止层内部，还能够防止仅该细胞漏出防止层发生脱落。如果构成上述细胞漏出防止层的无纺布的平均孔径超过20μm，则无法充分防止细胞从组织再生基材的漏出。如果构成上述细胞漏出防止层的无纺布的平均孔径小于5μm，则细胞向上述细胞侵入层的侵入性降低，或向上述细胞侵入层中的细胞的营养的供给不充分，有时无法充分促进组织的再生。构成上述细胞漏出防止层的无纺布的平均孔径的优选下限为6μm，优选上限为18μm，更优选的下限为7μm，更优选的上限为16μm。

构成上述细胞漏出防止层的无纺布的平均纤维直径没有特别限定，优选下限为0.7μm，优选上限为7.0μm。在上述无纺布的平均纤维直径在该范围时，容易将平均孔径调整为上述规定的范围。上述无纺布的平均纤维直径的更优选的下限为0.9μm，更优选的上限为5.0μm。

上述细胞漏出防止层的厚度没有特别限定，优选的下限为10μm，优选的上限为150μm。如果上述细胞漏出防止层的厚度低于10μm，则有时无法充分防止细胞从组织再生基材的漏出，超过150μm时，细胞向上述细胞侵入层的侵入性降低，或向上述细胞侵入层中的细胞的营养的供给不充分，有时无法充分促进组织的再生。上述细胞漏出防止层的厚度的更优选的下限为30μm，更优选的上限为100μm。

本发明的组织再生基材即可以具有上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层的二层复合一体化而成的叠层结构，也可以具有上述细胞侵入层、上述细胞漏出防止层和上述细胞侵入层的三层依次复合一体化而成的叠层结构。

其中，具有上述三层的叠层结构的组织再生基材在移植时，细胞能够从组织再生基材的两面侵入，而通过中央的细胞漏出防止层不会有侵入细胞泄露到组织再生基材之外，因此能够以极高的效率促进组织的再生。

在本发明的组织再生基材具有上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层的二层复合一体化而成的叠层结构的情况下，也可以在上述细胞漏出防止层的与上述细胞侵入层侧的相反侧的面再叠层平均纤维直径为0.1～0.7μm的纤维集合而成的层(以下，也称为“微细纤维集合体层”。)。通过叠层这样的微细纤维集合体层，能够进一步防止细胞从组织再生基材的漏出。

作为构成上述微细纤维集合体层的生物体吸收性材料，能够使用与上述细胞侵入层、细胞漏出防止层中使用的材料同样的生物体吸收性材料。构成上述微细纤维集合体层的生物体吸收性材料既可以与构成上述细胞侵入层、细胞漏出防止层的生物体吸收性材料相同，也可以不同。

构成上述微细纤维集合体层的纤维的平均纤维直径的优选下限为0.2μm，优选上限为0.65μm。在上述微细纤维集合体层的纤维在该范围的情况下，不会影响细胞向上述细胞侵入层的侵入性和向上述细胞侵入层中的细胞的营养的供给性，能够进一步防止细胞从组织再生基材的漏出。上述微细纤维集合体层的纤维的平均纤维直径的更优选下限为0.3μm，更优选上限为0.6μm。

上述微细纤维集合体层的厚度没有特别限定，优选下限为1.0μm，优选上限为100μm。如果上述微细纤维集合体层的厚度低于1.0μm，则有时得不到防止细胞从组织再生基材的漏出的效果，如果超过100μm，则细胞向上述细胞侵入层的侵入性降低，或向上述细胞侵入层中的细胞的营养的供给不充分，有时无法充分促进组织的再生。上述微细纤维集合体层的厚度的更优选下限为1.5μm，更优选上限为80μm。

本发明的组织再生基材中，上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层复合一体化。

如果上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层没有复合一体化，则在本发明的组织再生基材中接种细胞，或移植到组织或器官时，有时上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层的一部分或全部会剥离。一旦即使上述细胞侵入层和上述细胞漏出防止层在一部分剥离，也会在该剥离部所形成的空间产生细胞堆积，有时不能再生正常的组织或器官。

此外，在本说明书中，上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层复合一体化是指在将本发明的组织再生基材移植到组织或器官时，即使折叠移植，上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层也不会剥离。更定量而言，根据jisl1021－9所规定的剥离强度试验方法测定的剥离强度优选为0.1n以上，更优选为0.3n以上。

作为使上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层复合一体化的方法，可以考虑使用医疗用粘附剂贴合的方法、将细胞侵入层或细胞漏出防止层的表面的一部分用溶剂溶解后贴合的方法等。然而，在用这些方法将细胞侵入层与细胞漏出防止层时，有时在接合面中各层的孔被堵塞，妨碍体液的顺利通过，阻碍营养向细胞侵入层的细胞的供给。

本发明的发明人深入研究的结果，发现：根据包括制备上述细胞侵入层的工序；在上述细胞侵入层上由熔喷法喷出由生物体吸收性材料构成的丝，形成上述细胞漏出防止层，得到叠层体的工序；和对上述叠层体进行针刺，使上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层复合一体化的工序的组织再生基材的制造方法，能够在接合面中没有塞孔，将细胞侵入层与细胞漏出防止层复合一体化。这样的组织再生基材的制造方法也是本发明之一。(以下，也称为“第一本发明的组织再生基材的制造方法”。)

本发明的发明人进行深入研究的结果，还发现根据包括：制备上述细胞侵入层的工序；制备上述细胞漏出防止层的工序；将所得到的细胞侵入层与细胞漏出防止层叠层，得到叠层体的工序；和对上述叠层体进行针刺，使上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层复合一体化的工序的组织再生基材的制造方法，能够在接合面中不使孔发生阻塞地将细胞侵入层与细胞漏出防止层复合一体化。这样的组织再生基材的制造方法也是本发明之一。(以下，也称为“第二本发明的组织再生基材的制造方法”。)

以下，详细说明本发明的组织再生基材的制造方法。(以下，将第一本发明的组织再生基材的制造方法和第二本发明的组织再生基材的制造方法中共通的事项也简称为“本发明的组织再生基材的制造方法”。)

在本发明的组织再生基材的制造方法中，首先进行制备上述细胞侵入层的工序。

制备上述细胞侵入层的方法没有特别限定，能够使用例如电纺沉积法、熔喷法、针刺法、纺粘法、闪蒸纺丝法、水流交缠法、气流成网法、热粘法、树脂结合法、湿式法等现有公知的方法。其中，上述细胞侵入层的制备中优选针刺法。

在本发明的组织再生基材的制造方法中，优选在制备上述细胞侵入层的工序后，具有对上述细胞侵入层的叠层上述细胞漏出防止层一侧的表面实施起毛处理的工序。通过预先对上述细胞侵入层的表面实施起毛处理，与上述细胞漏出防止层的紧贴性进一步提高。

上述起毛处理具体而言，例如可以列举利用起毛机对上述细胞侵入层的叠层上述细胞漏出防止层一侧的表面进行起毛处理的方法等。此外，在作为上述细胞侵入层的制造方法使用针刺法的情况下，所得到的细胞侵入层的表面已经起毛，所以可以得到与实施起毛处理同样的效果。

在第一本发明的组织再生基材的制造方法中，接着，进行在上述细胞侵入层上，通过熔喷法喷出由生物体吸收性材料构成的丝，形成上述细胞漏出防止层，得到叠层体的工序。

熔喷法是将作为原料的生物体吸收性材料以1个阶段制成无纺布的熔融纺丝法。具体而言，用挤出机将熔融的生物体吸收性材料从在宽度方向具有多个抽丝头的模具向纤维捕集点用高温、高速的空气流中以丝状吹出，将拉伸成纤维状的树脂在传送带上集聚。在从喷出到集聚期间，发生纤维之间的交缠和热粘连，因此形成无纺布。在第一本发明的组织再生基材的制造方法中，将上述细胞侵入层在传送带上、以比熔喷法的纤维捕集点更靠前的方式配置，一边使该细胞侵入层在传送带移动，一边在细胞侵入层上喷出纤维而形成细胞漏出防止层。

此时，通过调节熔喷法的聚合物喷出量、喷出出口附近的空气风速、传送带的速度等，能够控制所形成的细胞漏出防止层的纤维径、密度、厚度等。

另一方面，在第二本发明的组织再生基材的制造方法中，与上述细胞侵入层不同，另外进行制备上述细胞漏出防止层的工序，之后将所得到的细胞侵入层和细胞漏出防止层进行叠层得到叠层体的工序。

制备上述细胞漏出防止层的方法没有特别限定，例如能够通过利用熔喷法喷出由生物体吸收性材料构成的丝来形成。

另外，上述叠层体能够通过将细胞侵入层与细胞漏出防止层重合来得到。

在本发明的组织再生基材的制造方法中，接着进行对上述叠层体进行针刺、使上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层复合一体化的工序。

通过针刺，能够在接合面中不堵塞各层的孔，使上述细胞侵入层与上述细胞漏出防止层可靠地复合一体化。

此外，对上述叠层体进行针刺时的针的进入方向没有特别限定。

在本发明的组织再生基材的制造方法中，接下来，可以对上述叠层体实施热定型处理。通过实施热定型处理，能够期待所得到的组织再生基材的表面变得平滑，操作性提高。

作为上述热定型处理的方法，可以列举例如在构成上述叠层体的聚合物的结晶点以上的温度下实施辊压的方法等。

在本发明的组织再生基材具有上述微细纤维集合体层的情况下，例如进行如下工序：在通过上述细胞漏出防止层上利用电纺沉积法喷出微细纤维的方法形成微细纤维集合体层并形成叠层体后，对该叠层体进行针刺，使上述细胞侵入层、上述细胞漏出防止层和上述微细纤维集合体层复合一体化。

本发明的组织再生基材由于具有上述细胞侵入层与细胞漏出防止层复合一体化的叠层结构，所以在作为组织的强化或促进组织再生的支架埋植时，细胞的捕捉性和侵入性优异，且能够防止细胞从组织再生基材的漏出，因此能够提高组织再生基材中的细胞的密度，促进组织尽早再生。更具体而言，例如适合作为以软骨、骨骼、皮肤、血管等的组织和器官的再生为目的的再生医疗用的基材。

作为这些组织和器官的再生方法，可以列举例如在想要再生的组织、器官的部位移植本发明的组织再生基材的方法。此时，也可以对本发明的组织再生基材预先接种细胞。

另外，本发明的组织再生基材通过贴附在肺穿孔、支气管断端、胰液瘘、胆汁漏等希望尽早治愈的部位，作为脆弱的组织的强化和促进组织再生的支架是有用的，特别是附在组织运动少的支气管断端、胰液瘘、胆汁漏等的部位时，其效果显著。

本发明的组织再生基材在手术后以覆盖脆弱的组织的方式贴附。在使用自动缝合器的情况下，通过将本发明的组织再生基材贴附在组织后使用自动缝合器进行缝合操作，在能够防止肺的空气泄露和从各种组织的体液泄露防止的方面也有用。

发明效果

根据本发明，能够提供细胞的侵入性优异、并且能够有效防止细胞从组织再生基材的漏出、促进组织的再生的组织再生基材以及该组织再生基材的制造方法。

附图说明

图1是说明利用泡点法的无纺布的孔径分布的测定方法的示意图。

图2是说明从通过泡点法得到的数据推算无纺布的孔径分布的方法的示意图。

图3是说明实施例和比较例中的评价方法的示意图。

具体实施方式

以下列举实施例，更加详细地说明本发明的方式，但本发明不仅仅限于这些实施例。

(实施例1)

(1)细胞侵入层的制备

作为生物体吸收性材料使用重均分子量为250000的聚乙醇酸交酯，将由其纺丝得到的丝构成的布利用针刺法无纺布化，通过该方法，得到平均纤维直径约为16μm、厚度约为1.5mm的细胞侵入层。

此外，在所得到的细胞侵入层中，吸收作为湿润液的氟系溶剂(商品名porofil(商标))后，在日本贝尔公司制的porometer3g上以试验片尺寸为直径25mm的圆状的方式设置，从细胞侵入层的背侧施加空气压，测定在膜表面能够观察到气泡发生的最小压力(泡点)。根据得到的泡点，得到表示细胞侵入层的孔径分布的曲线，由该曲线算出平均孔径，结果为28μm。

(2)细胞漏出防止层的叠层

将所得到的细胞侵入层以比利用熔喷法的纤维捕集点靠前的方式设置在传送带上。一边使传送带移动，一边在细胞侵入层上利用熔喷法喷出由聚乙醇酸交酯构成的丝，将细胞漏出防止层叠层。

熔喷法作为原料使用重均分子量为250000的聚乙醇酸交酯，设为聚合物喷出量0.2kg/h、喷出出口附近的空气风速11m/秒的条件进行。另外，传送带的移动速度设定为通过上述熔喷法得到的细胞漏出防止层的密度为10g/m²的速度。

此外，另外以同样的条件仅制造细胞漏出防止层，通过泡点法算出细胞漏出防止层的平均孔径，结果为12μm。

(3)细胞侵入层与细胞漏出防止层的复合一体化

以针从所得到的叠层体的细胞漏出防止层侧进入的方式进行针刺，使细胞侵入层与细胞漏出防止层复合一体化。

(实施例2)

在细胞侵入层的制备中，除了对通过针刺法得到的细胞侵入层实施热压处理使表面平滑以外，与实施例1同样操作，得到组织再生基材。

(实施例3)

在细胞侵入层的制备中，对通过针刺法得到的细胞侵入层实施热压处理使表面平滑后，通过黄铜制的刷子实施刷磨的方法实施起毛处理，将细胞漏出防止层叠层在实施了起毛处理的一侧，除此以外与实施例1同样操作，得到组织再生基材。

(实施例4)

(1)细胞侵入层的制备

作为生物体吸收性材料使用重均分子量为250000的聚乙醇酸交酯，通过将由其纺丝得到的丝构成的布利用针刺法无纺布化的方法，得到平均纤维直径约为16μm、厚度约为1.5mm的细胞侵入层和平均纤维直径约为16μm、厚度约为0.5mm的细胞侵入层的2种细胞侵入层。

此外，对于所得到的细胞侵入层，通过泡点法算出平均孔径，结果均为28μm。

(2)细胞漏出防止层的制备

作为生物体吸收性材料，使用重均分子量为250000的聚乙醇酸交酯，通过熔喷法，得到平均纤维直径约为2μm、厚度约为50μm的细胞漏出防止层。此外，关于所得到的细胞漏出防止层，通过泡点法算出平均孔径，结果为12μm。

(3)细胞侵入层与细胞漏出防止层的复合一体化

将厚度约为1.5mm的细胞侵入层、厚度约为50μm的细胞漏出防止层和厚度约为0.5mm的细胞侵入层依次重合，得到三层结构的叠层体。

从所得到的三层结构的叠层体的厚度约为0.5mm的细胞侵入层一侧进行针刺，使三层复合一体化，得到组织再生基材。

(比较例1)

作为生物体吸收性材料使用重均分子量为250000的聚乙醇酸交酯，通过将由其纺丝得到的丝构成的布利用针刺法无纺布化的方法，得到平均纤维直径约为16μm、厚度约为1.5mm的无纺布，将其作为组织再生基材。此外，对于所得到的无纺布，通过泡点法测定平均孔径，结果为28μm。

(比较例2)

作为生物体吸收性材料使用重均分子量为250000的聚乙醇酸交酯，通过熔喷法，得到平均纤维直径约为2μm、厚度约为50μm的无纺布，将其作为组织再生基材。此外，对于所得到的无纺布，通过泡点法测定平均孔径，结果为12μm。

(比较例3)

除了不进行利用针刺的复合一体化处理以外，与实施例1同样操作，得到组织再生基材。

(比较例4)

除了不进行利用针刺的复合一体化处理以外，与实施例2同样操作，得到组织再生基材。

(比较例5)

除了不进行利用针刺的复合一体化处理以外，与实施例3同样操作，得到组织再生基材。

(评价)

对于实施例和比较例中得到的组织再生基材，通过以下的方法进行评价。

将结果表示在表1中。

(1)颗粒捕获率的评价

制备将平均粒径为20μm的聚苯乙烯颗粒分散在乙醇水溶液(水/乙醇(体积比)＝80/20)中得到的颗粒分散液。

将组织再生基材切成20mm×20mm的正方形，固定在金属网上。从组织再生基材的细胞侵入层侧(实施例4中，为厚度约1.5mm的细胞侵入层侧)，缓慢滴加颗粒分散液2ml，使其透过组织再生基材。测定透过前后的颗粒分散液在波长230nm的吸光度，使用通过浓度已知的聚苯乙烯乳液颗粒分散液的吸光度测定得到的标准曲线，计算颗粒浓度(个/ml)。使用所得到的透过前后的颗粒分散液的颗粒浓度和由透过前后的分散液的重量计算的分散液体积，求出透过前后的颗粒分散液中的颗粒数，通过下述式计算颗粒捕获率(％)。

颗粒捕获率(％)＝(透过前的颗粒分散液中的颗粒数－透过后的颗粒分散液中的颗粒数)/透过前的颗粒分散液中的颗粒数

(2)细胞保持性的评价

通过图3所示的培养方法，在组织再生基材中接种细胞，评价其增殖。

即，在培养皿4上配置海绵状体5，注入培养液6直到海绵状体5的表面呈液状。(由此，培养液仅从海绵状体5供给。)在该海绵状体5之上，配置实施例和比较例中制造的组织再生基材7。此外，在实施例和比较例3～5中，使细胞漏出防止层侧在下方的方式，与海绵状体5接触。另外，在实施例4中，使厚度约为0.5mm的细胞侵入层侧在下方的方式，与海绵状体5接触。

在以这样的状态配置的组织再生基材7中以1×10⁵个/cm²的接种密度接种成纤维细胞。然后，每天更换培养液6，培养7天。培养7天后，通过mtt试验法对组织再生基材7所含的细胞数计数，以比较例1的组织再生基材所含的细胞数为100，表示其他实施例和比较例的组织再生基材所含的细胞数。将结果表示在表1中。

(3)复合一体性的评价(定性评价)

通过以下的基准评价细胞再生基材的复合一体性。

◎：在折叠组织再生基材时，细胞侵入层和细胞漏出防止层不剥离，且如果要用手剥离细胞侵入层与细胞漏出防止层，则细胞侵入层或细胞漏出防止层先破裂。

○：在折叠组织再生基材时，细胞侵入层和细胞漏出防止层不剥离，且即使要用手剥离细胞侵入层与细胞漏出防止层，也不容易剥离。

△：在折叠组织再生基材时，细胞侵入层与细胞漏出防止层的一部分剥离，且能够用手容易剥离细胞侵入层与细胞漏出防止层。

×：在折叠组织再生基材时，细胞侵入层与细胞漏出防止层全部剥离，且能够用手容易剥离细胞侵入层与细胞漏出防止层。

(4)复合一体性的评价(定量评价)

根据jisl1021－9所规定的剥离强度试验方法测定剥离强度，来评价细胞再生基材的复合一体性。

具体而言，首先将得到的组织再生基材细切成宽20mm×长50mm，将细胞侵入层与细胞漏出防止层用手预先在纵向剥离25mm，形成夹持部，将其作为样品。将所得到的样品的各个层的夹持部用卡盘夹住(夹持距离20mm)，使用autograph(株式会社岛津制作所制“ags－j”、测压元件50n)，以拉伸速度100mm/min的条件拉伸，测定剥离强度。此外，在jisl1021－9中，样品设为宽50mm×长200mm，预先剥离的长度(夹持部长度)为50mm，但考虑细胞再生基材移植到组织或器官的情况，制作上述样品。另外，在该jis中，样品是在恒温恒湿室(20℃、65％)静置24小时，但由于本样品是由降解性高分子构成的基材，所以省略该操作，在样品刚制作好后立即进行测定。

在实施例4的细胞再生基材中，在样品制备中，将20mm×50mm的试验片的各层在纵向上剥离到25mm，将厚度约为1.5mm的细胞侵入层和厚度约为50μm的细胞漏出防止层分别用卡盘夹住，在上述条件下进行拉伸试验，测定该二层之间的剥离强度。

[表1]

产业上的可利用性

根据本发明，能够提供细胞的侵入性优异、并且能够有效防止细胞从组织再生基材的漏出、促进组织的再生的组织再生基材以及该组织再生基材的制造方法。

符号说明

4培养皿

5海绵状体

6培养液

7组织再生基材