一种基于叔丁醇/水混合溶剂制备超声造影剂的方法与流程

本发明涉及医药领域，具体涉及了一种基于叔丁醇/水混合溶剂的制备用于超声成像的微泡超声造影剂的方法。

背景技术：

超声造影剂通过改变组织的超声特性来增强增强检测部位的回声信号从而帮助操作人员获取更多更精确的信息，通常是脂质、聚合物或蛋白质包裹的气体微泡。超声造影剂在人体微小血管和组织血流灌注检测与成像方面具有很大优势。从理论上讲，超声造影剂可以用于体内除骨胳和肺以外任何器官血流灌注的评价。另外，近些年的研究表明超声造影剂在肿瘤或炎症部位的靶向成像和药物递送等方面表现出了广阔的应用前景，因此可以预见超声造影剂在不久的将来将会成为临床上超声诊断或治疗中的不可或缺的试剂。

目前，国际市场上已经被批准上市的超声造影剂有optison、sonazoid、sonovue、definity、imagent等，国内已经批准使用的超声造影剂主要是sonovue，但是价格都非常高，成像时间短，普通老百姓用不起。因此价格低廉、成像效果好的超声造影剂将有助于解决目前国内“看病难”、“看病贵”的大难题。

目前临床上用的超声造影剂的包膜材料可以分为两类，以optison为代表的白蛋白类的超声造影剂和以磷脂为主要包膜材料的超声造影剂。其中白蛋白类的超声造影剂因为成像时间较短，应用受局限，目前已经逐渐失去市场，预计未来超声造影剂市场将主要被以磷脂为主要包膜材料的造影剂所占据。

由于单独的一种磷脂很难形成稳定的微泡，通常磷脂类的超声造影剂制备时都需要两种以上的磷脂组合，有时还需要加入一些聚合物材料、表面活性剂、脂肪酸等其他材料以获得稳定的微泡。由于磷脂在高温条件下或水溶液中长期存在时容易发生降解产生溶血性磷脂，影响产品的稳定性和安全性。另外超声造影剂在制备时通常会加入一些带有负电荷的磷脂，这类磷脂在一般的溶剂中都很难分散开，最终会严重影响产品的均一性和可重复性。因此开发高效安全 可重复性高的包膜材料混合方法显得尤为重要。

专利文献wo99036104公开了一种制备均一稳定可过滤除菌的脂质混悬液的方法，但是这种方法程序非常复杂，无疑提高了生产成本。该方法最后得到的产品中磷脂是以溶液状态存在的，磷脂在处理过程中以及储存中易降解。

专利文献cn100496615c公开了一种制备微泡冻干粉的方法，使用前需向冻干粉中加入水化液并充气然后机械震荡就可以得到微泡悬浮液。但是这种方法中冻干前磷脂是在水溶液中通过加热震荡分散的，这就导致磷脂很容易在高温水溶液中降解，而且磷脂在水中分散无法得到完全均一稳定的溶液。当成膜脂质有两种以上时，无法实现分子水平上均匀混合，得到的微泡悬浮液中各个微泡的组分会有较大差别。另外，这种方法得到的磷脂混悬液中磷脂是以粒径较大的脂质体形式存在，难以直接进行过滤除菌。

技术实现要素：

基于以上需求和问题，本发明提供一种基于叔丁醇/水混合溶剂制备超声造影剂的方法，该方法操作简单，微泡包膜材料可以在很温和的条件下分散得到均一稳定的溶液，可以进行过滤除菌，容易进行产业化生产。

本发明技术方案如下：

一种基于叔丁醇/水混合溶剂制备超声造影剂的方法，包括制备微泡包膜材料混悬液，其中所述混悬液的溶剂为叔丁醇和水混合液。

为了获得均一稳定的微泡包膜材料混悬液，需要一种溶剂能够将微泡包膜材料(和冻干保护剂)均匀混合分散。另外，为了获得微泡冻干粉，这种溶剂还需要具有合适的熔点和饱和蒸汽压。

水是冷冻干燥工艺中最常用的溶剂，但是双亲性材料在水中很容易自组装成胶束或脂质体等结构，直接将多种双亲性材料分散在水中很难实现分子水平上的均匀混合。

目前能够用于冷冻干燥的最优选的非水溶剂是叔丁醇，由于其具有较高的熔点(25.7℃)和饱和蒸汽压(26.8mmhg，20℃)，用普通的冷冻干燥设备实现冷冻干燥，极大的节约成本。另外，较低的毒性也使得叔丁醇较适合用于药物制剂的冷冻干燥。尽管纯的叔丁醇可以溶解大多数双亲性材料和不同分子 量的聚乙二醇，但是却无法溶解大多数的冻干保护剂。另外，微泡制备时通常需要加入一定比例的带有负电荷的磷脂如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油或磷脂酸等，而这类磷脂在叔丁醇中的溶解度较差。

本发明研究发现，以叔丁醇和水混合液为溶剂能够同时溶解绝大多数双亲性包膜材料和冻干保护剂，而且溶解过程不需要太高的温度，40℃左右甚至更低的温度就可以溶解，且溶解后冷却到室温后不会析出。最后获得的所述混悬液澄清、均一、稳定，并且很容易利用过滤进行除菌。另外，使用叔丁醇和水混合液为溶剂进行冷冻干燥时，叔丁醇能够在水中形成针状结晶，大大缩短冷冻干燥的周期。

优选地，所述叔丁醇和水混合液中叔丁醇的质量含量为1％～99％，进一步优选为30％～70％。

本发明所述微泡包膜材料混悬液，其中所述包膜材料主要包括双亲性的材料。这里所用的双亲性材料是构成微泡壳层的主要成分，形成致密的膜来阻止微泡内部气体向外扩散，维持微泡的稳定性，同时保证微泡具有一定的弹性。

双亲性材料包括氢化卵磷脂、氢化大豆磷脂、氢化卵磷脂酰丝氨酸、氢化卵磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、聚乙二醇化的磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇化的脂肪酸、单硬脂酸甘油酯、蔗糖单硬脂酸酯、氢化蓖麻油、棕榈酸抗坏血酸脂、司盘类表面活性剂、吐温类表面活性剂、脂肪酸、胆固醇、维生素e中的一种或几种的混合物。

所述制备微泡包膜材料混悬液的时候还需要加入一些冻干保护剂，这些材料的主要作用是在混悬液冷冻干燥时能够对支撑起包膜材料，使其保持在溶液中的稳定分散状态而不至于塌陷聚集，使得冻干粉在水化时能够很容易分散得到均一稳定的溶液。另外冻干保护剂在冻干保护剂在水中能够与微泡膜表面通过氢键作用大量附着，氢键的存在可以极大地提高微泡的稳定性，而且冻干保护剂在微泡表面的附着也能够降低微泡在体内被识别的几率从而延长微泡的循环时间。

这里所说的冻干保护剂可以分为两类，聚合物类和小分子类。聚合物类的 冻干保护剂包括不同分子量的聚乙二醇、泊洛沙姆、多糖、聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或几种的混合物。进一步地，所述的冻干保护剂为分子量为4000的聚乙二醇。小分子类的冻干保护剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、肌醇、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸中的一种或几种的混合物。

本发明所述方法还包括将制备好的微泡包膜材料混悬液进行冷冻干燥的步骤，冷冻干燥后得到微泡冻干粉。该微泡冻干粉能够稳定存在，常温条件下即可以保存很长时间。具体地，将微泡包膜材料混悬液制备好后分装入药物制剂用的西林瓶，然后通过冷冻干燥的方法除去所述溶剂(即叔丁醇和水混合液)得到微泡冻干粉。所述冷冻干燥可采用本领域常用方法。

本发明所述方法还包括将制备好的微泡冻干粉进行充入填充气体的步骤。填充气体是超声造影剂(超声微泡内核)的成分，为了提高超声微泡的稳定性，填充气体应该在水中具有较低的溶解度，还要对生物体安全无毒。这类填充气体优选的是八氟丙烷、八氟环丁烷、十氟丁烷等氟化碳类气体或六氟化硫等氟化硫类气体，因为这些气体是生物惰性的，安全无毒，而且在水中的溶解度较低。

具体地，可在冷冻干燥结束后(制得微泡冻干粉)向西林瓶中充入填充气体。本发明中气体填充过程可以是在冻干机外用特定的充气装置进行，工业化生产时更优选的方法是气体填充、密封的过程都是在冻干设备中进行。

具体地，所述基于叔丁醇/水混合溶剂制备超声造影剂的方法，包括以下步骤：

1)将所述包膜材料和冻干保护剂加入叔丁醇和水混合液中，加热溶解，制得微泡包膜材料混悬液；然后过滤除菌；

2)将步骤1)过滤除菌的微泡包膜材料混悬液冷冻干燥，得到微泡冻干粉；

3)将步骤2)制备好的微泡冻干粉充入填充气体。

上述制备方法中，

所述包膜材料和冻干保护剂的重量比例为1:200～1:5；优选为1:50～1:10。

所述包膜材料和冻干保护剂的总重量占所述溶剂(即叔丁醇和水混合液)重量的1％～50％；优选为5％～15％。

所述加热溶解温度为25℃～70℃；优选为35℃～50℃。

所述过滤除菌优选采用220nm的滤膜。

本发明所述基于叔丁醇/水混合溶剂制备超声造影剂的方法在气体填充后还包括密封、无菌处理等本领域常规步骤，最后可制得成品。

本发明还包括上述方法制得的超声造影剂。

本发明所述超声造影剂(微泡冻干粉)在使用时需要向包装容器(如西林瓶)中注入水化液，水化液的量优选占包装容器(如西林瓶)容积的10％～80％。水化液的选择应该是完全无毒、可以进行静脉注射的。大多数临床使用的注射液都可以被用做水化液，如生理盐水，磷酸盐缓冲液，甘油注射液，葡葡萄糖注射液，氨基酸注射液等。也可以是加入了一定量的甘油和/或丙二醇的生理盐水或磷酸盐缓冲液，甘油的加入能够提高微泡的粘弹性和稳定性，丙二醇可以促进双亲性包膜材料的分散。

本发明所述超声造影剂(微泡冻干粉)水化后优选通过机械振荡器来激活微泡以获取可以用于超声成像造影的微泡混悬液。这里所采用机械振荡器与目前临床上牙科所用的银汞调和器的结构原理基本一致。优选地，震荡方式是往复式，振荡频率为2000～7000rpm，震荡幅度为0.5～3cm，震荡时间为30～180s。

本发明制备方法简单，微泡各组分之间能够在很温和的条件下分散得到均一稳定的溶液，达到分子水平的均匀混合，各组分在制备过程中不易发生降解，样品冻干效率高，样品均一稳定，可以进行过滤除菌，可重复性高、容易规模化生产，表现出广阔的临床应用前景。

特别地，本发明解决了传统方法中因磷脂在高温条件下或水溶液中长期存在时容易发生降解产生溶血性磷脂，影响产品的稳定性和安全性的技术问题。产品高效安全、方法可重复性高。

附图说明

图1为实施例1和对比例1制得微泡包膜材料混悬液照片。

图2为实施例1制得的微泡悬液的微泡显微镜照片。

图3为实施例1制得的微泡悬液的微泡的粒径分布图。

图4为实施例1制得的超声造影剂(微泡混悬液)对新西兰大白兔的肾脏造影结果图。图4中，a，微泡注射前；b，微泡注射后2分钟；c微泡注射后30分钟；d，微泡注射后50分钟。

图5为对比例1制得的超声造影剂(微泡混悬液)对新西兰大白兔的肾脏造影结果图。图5中，a，微泡注射前；b，微泡注射后1分钟；c微泡注射后8分钟；d，微泡注射后16分钟。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

准确称取16mg二硬脂酰基-磷脂酰甘油，16mg二硬脂酰基-磷脂酰胆碱，1gpeg4000，加入溶剂(即9.5g去离子水和9.5g叔丁醇的混合液)，加热到45℃溶解得到微泡包膜材料混悬液，为澄清的溶液(见图1)，然后冷却到室温。将溶解后的溶液用220nm的滤膜过滤后分装入2ml的西林瓶(实际容积约为3.5ml)，每瓶分装入1g。将分装好的西林瓶放于冻干机隔板上，迅速冷却到-40℃冷冻2h，然后保持该温度在真空度为120mtorr的条件下冷冻干燥10h，之后将隔板温度升到25℃解析干燥3h。干燥结束后，保持冻干机的真空状态，回填入八氟丙烷气体，待真空度恢复到常压后，压下西林瓶上的橡胶塞，密封西林瓶，制得超声造影剂。

该超声造影剂(冻干粉制剂)使用之前，向西林瓶中注入1ml的生理盐水，放于医用银汞调和机的夹头上，振荡频率为4000rpm，振荡45s后，得到微泡悬浮液。

实施例2

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将磷脂成分更换为：32mg二硬脂酰基-磷脂酰甘油。

实施例3

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将冻干保护剂换成甘氨酸。

实施例4

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将冻干保护剂换成蔗糖。

实施例5

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶剂为12g去离子水和7g叔丁醇的混合液。

实施例6

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶剂为8g去离子水和11g叔丁醇的混合液。

对比例1

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于以水为溶剂制备微泡包膜材料混悬液。

制备过程中发现，在制备微泡包膜材料混悬液的时候，实施例1中只需在45℃加热溶解5min左右就可以得到澄清透明的混悬液，而对比例1中在45℃加热溶解1h后仍然可以看到很多颗粒状不溶物，而且混悬液浑浊不透明(图1)。在使用传统的220nmpvdf膜针头滤器(直径25mm)对混悬液进行过滤时，实施例1中混悬液在过滤100ml后没有遇到明显的阻力，而对比例1中的混悬液过滤时过滤的阻力非常明显，仅过滤了2ml后滤器就基本完全被堵塞无法继续进行了。

另外在同等冻干条件下，实施例1中的样品能够完全干燥并得到完整的冻干制剂，而对比例1中的样品则发现几乎所有的冻干制剂的底部都出现了坍塌，个别冻干样品中出现了喷瓶。

对比例2

一种超声造影剂，其制备方法与实施例2的区别仅在于以水为溶剂制备微泡包膜材料混悬液。

制备过程中发现，在制备微泡包膜材料混悬液的时候，实施例2中只需在45℃加热溶解5min左右就可以得到澄清透明的混悬液，而对比例2中在45℃加热溶解0.5h后才基本完全溶解，而且混悬液浑浊不透明。在使用传统的220nmpvdf膜针头滤器(直径25mm)对混悬液进行过滤时，实施例2中混悬液在过滤100ml后没有遇到明显的阻力，而对比例2中的混悬液过滤时过滤的阻力非常明显，仅过滤了3ml后滤器就基本完全被堵塞无法继续进行了。

在同等冻干条件下，实施例2中的样品能够完全干燥并得到完整的冻干制剂，而对比例2中的样品则发现几乎所有的冻干制剂的底部都出现了坍塌，个别冻干样品中出现了喷瓶。

实验例1

为获取微泡在光学显微镜下的图像；具体操作步骤如下：用等体积的生理盐水稀释实施例1制得的微泡悬液，用移液器吸取10μl微泡悬液滴在干净的载玻片上，小心盖上盖玻片，使用显微镜在不同物镜倍数下观察微泡的大小、形态及分散情况并拍照。图2是得到的微泡的显微照片，可以看到微泡的尺寸大都在2μm以下。

实验例2

采用库尔特颗粒计数仪测试实施例1制得的微泡悬液微泡的粒径分布及浓度。操作步骤如下：取新制备的微泡悬液20μl加入到20ml生理盐水中中，轻微摇晃混合均匀。设定分析体积为20μl，测试微泡的粒径分布及浓度。样品测试重复三次，取平均值。图3是其中一次代表性的结果，可以看到微泡的尺寸分布范围很窄，大部分都在2μm以下，与显微镜照片吻合。

实验例3

以新西兰大白兔为实验对象，于兔左耳经耳缘静脉建立外周静脉通道，在导管的末端连接三通管，其中一个通道用于注射超声造影剂，一个通道尾随生理盐水。新西兰大白兔用3％的戊巴比妥钠静脉注射麻醉(30mg/kg)，并辅以0.2％肝素钠抗凝血。待兔完全麻醉后，以背卧的姿势固定在兔床上。右腹部毛发用脱毛膏小心脱除，对兔肝脏和肾脏进行未注射造影剂的超声检查，记录基础状态下的图像。待图像满意后将分别将实施例1和对比例1中的超声造影剂微泡 混悬液按20μl/kg的剂量经兔耳缘静脉团注，即刻尾随2.0ml生理盐水冲洗管道，实时动态观察并记录兔肝脏和肾脏回声强度增强情况以及肾脏能量多普勒血流信号增强情况。

图4和图5分别是实施例1和对比例1中造影剂的成像结果，可以看到实施例1中的造影剂能够对兔子肝脏和肾脏进行超声增强造影，并且这种增强效果能够持续到50分钟后仍然很强。而对比例1中的造影剂在注射后8分钟信号明显减弱，16分钟后基本完全消退。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。