混合中空微胶囊，包含其的软组织用支架及其的制备方法与流程

本本发明涉及混合中空微胶囊，包含其的软组织用支架及其的制备方法。

背景技术：

在组织工学领域中，为了获得所需要的生物学效果，将大孔多孔性生物体相容性物质用于细胞的生长和向动物模型内移植的模板。为了用于组织工学用途，模板与宿主组织的机械特性类似性极为重要。并且，来自对应物质的机械刺激调整干细胞的分化反应。

为了如脂肪组织(adipose tissue)的软组织(soft tissue)的组织工学用途，需要如对应宿主组织的柔软且可弹性恢复的支架(scaffold)。例如，脂肪组织的弹性系数的范围为3至4kPa。在移植对应物质之后，当从外部施加外力时，对应物质得维持内部结构。以往的软组织工学主要以高分子类的交联的大孔多孔性支架为中心进行了研究。上述高分子类支架虽然柔软，但是，在高压缩变形下无法弹性恢复。并且，上述高分子类支架的机械强度仅可通过高分子链的交联密度来控制。

为了制备可用于骨再生的坚固支架，得使用仅具有无机成分的物质。示出了很多将多孔性羟基磷灰石用成骨再生用支架的例。上述支架很容易被破碎，而且，若发生一次变形，则无法恢复。并且，上述支架的分解速度缓慢。

利用生物体模仿羟基磷灰石/高分子复合体的形成方法获得了可用成骨替代材并容易破碎的多孔性物质。本发明人员可通过利用冻结的方法制备包括涂敷PEI的无机粒子的网络并借助二环氧PEG交联剂交联的无机含量85％的弹性支架。在将上述物质用成组织工学用支架的情况下，基于游离的交联剂的细胞毒性可引起其他问题。因此，需要可制备不包含交联剂且柔软并具有高无机含量的弹性支架的方法。

通过在如碳酸钙微粒、二氧化硅粒子、密胺树脂等的牺牲芯材上吸附一层具有相反电荷的高分子电解质层来合成高分子电解质中空胶囊。上述高分子类PEM中空胶囊的机械特性主要由PEM层的数和高分子链的交联密度定义。报告了有关如在无机纳米粒子表面形成PEM壳层的无机/有机混合中空结构的制备的研究。Dmitry G.Shchukin等利用Y₂O₃-FeO₃和磷酸钙来制备了PAH/PSS PEM胶囊，Matthieu F.Bedard等报告了包括金纳米粒子的(PDADMAC/PSS)胶囊壳层。

仅由PEM构成的中空胶囊的机械特性主要通过在AFM胶体探头的存在下的力和变形的测定、基于渗透压的变形的测定及当通过窄小管道被压接时，在胶囊发生的变形的测定来测定。测定机械特性的结果，确认了PEM中空胶囊可从最大20％变形恢复。为了基于机械刺激的药物传递，需要最大90％压缩变形之后可恢复的中空胶囊。

现有技术文献

专利文献

(专利文献)美国专利第8623085号

非专利文献

(非专利文献1)Langer R,Vacanti JP"Tissue engineering"Science 260(5110):920-926

(非专利文献2)D.W.Hutmacher"Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage"Biomaterials,21(24)(2000),pp.2529-2543

(非专利文献3)R.A.Marklein and J.A.Burdick,"Controlling Stem Cell Fate with Material Design"Adv.Mater.,2010,22,175-189.

(非专利文献4)L.E.Flynn,"The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells"Biomaterials,2010,31,4715-4724.

(非专利文献5)L.Flynn and K.A.Woodhouse,"Adipose tissue engineering with cells in engineered matrices"Organogenesis,2008,4,228-235

技术实现要素：

根据本发明的多个实例，本发明提供利用大孔多孔性物质的冻结的制备过程，上述大孔多孔性物质包含可从高压缩变形状态借助弹力回复的交联的无机粒子网络，本发明还提供上述物质作为软组织工学用支架及药物传递系统的使用可能性。

本发明的一实施方式涉及中空微胶囊，上述中空微胶囊包括：(a)中空型芯高分子层，内部为空心；以及(b)有机无机复合层，在上述中空型芯高分子层的表面包括无机纳米粒子和胶囊涂敷用高分子，上述有机无机复合层为由一个有机无机复合层构成的有机无机复合单层或者由多个有机无机复合层层叠而成的有机无机复合多层，上述芯高分子层和上述胶囊涂敷用高分子相交联。

本发明的再一实施方式涉及包括本发明的多个实例的中空微胶囊的软组织用支架。

本发明的另一实施例方式涉及中空微胶囊的制备方法，上述中空微胶囊的制备方法包括：步骤(A)，在①带正电荷的牺牲芯材或②被改性成带负电荷的牺牲芯材上形成芯高分子层；步骤(B)，①在上述牺牲芯材为带正电荷的牺牲芯材的情况下，在上述芯高分子层上交替一次以上地形成无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层，②在上述牺牲芯材为被改性成带负电荷的牺牲芯材的情况下，在上述芯高分子层上交替一次以上地形成涂敷无机纳米粒子涂敷用组合物的无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层；步骤(C)，使芯高分子和胶囊涂敷用高分子相交联；以及步骤(D)，对上述牺牲芯材进行蚀刻并消除牺牲芯材。

根据本发明的多个实例，本发明提供利用大孔多孔性物质的冻结的制备过程，上述大孔多孔性物质包含可从高压缩变形状态借助弹力回复的交联的无机粒子网络，本发明还提供上述物质作为软组织工学用支架及药物传递系统的使用可能性。上述物质的弹性与所使用粒子的性质无关，将作为生物体相容性无机纳米粒子的羟基磷灰石、二氧化硅纳米粒子及聚L-谷氨酸纳米结球体涂敷在作为天然生物体高分子的明胶或壳聚糖，并将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和远螯二环氧或戊二醛用成交联剂。可通过交联密度控制上述物质的机械特性和分解特性。上述支架的恢复特性在向支架内装载细胞的过程中极为有效。通过生物体外及生物体内实验确认了上述物质具有生物体相同性。利用上述方法，通过自组装方式(LbL，Layer-by-Layer)方式，在可通过EDTA溶液蚀刻的碳酸钙微粒上交替吸附壳聚糖粒子和7nm胶质性二氧化硅、羟基磷灰石或磁铁矿纳米粒子来制备弹性混合中空微胶囊。壳聚糖层与戊二醛或远螯二环氧相交联，从而稳定。

附图说明

图1为支架的图像。(a)当10％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶及4mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺支架-溶胀时，90％压缩时，恢复时；(b)10％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶及0.1mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺支架在有水或没水状态下的图像。

图2为支架的图像。(a)10％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶及0.1mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；(b)10％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶及0.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；(c)10％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶及2mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；(d)10％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶及4mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；(e)20％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶及4mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；(f)10％0.5um-SiO₂，1％胶及4mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺。

图3为对于纯(bare)羟基磷灰石纳米粒子(HAp)、覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石纳米粒子(Cit-HAp)、涂敷胶Cit-HAp(Gel-Cit-HAp)及10％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶及4mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺支架的热重量分析(thermo gravimetric analysis)。为了避免基于湿气的重量损失，图表从120摄氏度示出。

图4为支架的流变学测定结果。(a)10％羟基磷灰石纳米粒子及1％胶支架的频率扫描(frequency sweeps)，4个不同的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺含量的支架(即，0.5、1、1.5及2mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)，(b)基于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺含量增加的剪断应力变化图表，(c)当将水用成溶剂时支架的溶胀率。

图5为在多种条件下支架的体外酶分解降解曲线(enzymatic degradation profiles)(重量损失0％意味着支架完全降解成粒子)。

图6为种植(seeding)NIH 3T3并培养(incubation)三日之后的10％羟基磷灰石纳米粒子，1％胶，0.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺支架的扫描式电子显微镜照片。

图7为对于在两周内向老鼠皮下注入的羟基磷灰石纳米粒子-胶支架的组织学分析。(A)苏木精-曙红染色(hematoxylin-eosin staining)支架的剖面图像(S：支架，暗紫色；M：肌肉)，右侧插入照片为对于体外种植牙状态的图像，(B)对胶原蛋白具有天狼星红染色(sirius red staining)的支架的剖面图像(胶原蛋白：暗红色)，(C)在边界中C的放大图(免疫细胞：没有浅紫色边界的暗紫色点)，(D)D-部分的放大图(定居细胞：具有紫色点的浅紫色区域；血管：紫色区域包围鲜红色点)。

图8为不同大小的混合中空胶囊(a)、(b)制备工序，(c)光学图像。

图9为(i)对在实施例6-1中制备的弹性混合中空胶囊(a)通过窄小的膜片钳进行挤压之前和(b)进行挤压之后的荧光光学图像；(ii)在对HHC不同的PSS 70K Da Mw浓度中执行的渗透压诱导破坏(rupture)的光学图像。

图10为示出在实施例9中执行的中空微胶囊的药物装载及基于外力的药物放出的实验结果。使用的外力循环(a)和从各个循环中放出的药物的量(b)及药物的累积图表(c)。在累积图表中附加与各个外力循环始点相对应的胶囊的代表荧光图像(比例尺10μm)。

具体实施方式

以下，更加详细说明本发明的多个实施方式及多种实例。

本发明的一实施方式涉及中空微胶囊，上述中空微胶囊包括：(a)中空型芯高分子层，内部为空心；以及(b)有机无机复合层，在上述中空型芯高分子层的表面包括无机纳米粒子和胶囊涂敷用高分子，上述有机无机复合层为由一个有机无机复合层构成的有机无机复合单层或者由多个有机无机复合层层叠而成的有机无机复合多层，上述芯高分子层和上述胶囊涂敷用高分子相交联。

在本发明中，优选地，有机无机复合层的最外围层应为胶囊涂敷用高分子层，上述芯高分子层和上述胶囊涂敷用高分子优选相交联，由此，在洗涤步骤中，可以防止无机纳米粒子的流失。

如上所述的本发明的一实施方式可通过以下两个代表实例体现。

根据第一个代表实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述有机微机复合层由在上述中空型芯高分子层的表面上(b1)由上述无机纳米粒子构成的无机纳米粒子层和(b2)由上述胶囊涂敷用高分子构成的胶囊涂敷用高分子层依次交替一次以上而成的一个或多个有机无机复合层构成。

根据第二个代表实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述有机无机复合层由在上述中空型芯高分子层的表面上(b1′)由涂敷无机纳米粒子涂敷用高分子的上述无机纳米粒子构成的涂敷无机纳米粒子层和(b2)上述胶囊涂敷用高分子层交替一次或多次而成的一个或多个有机无机复合层构成，上述无机纳米粒子涂敷用高分子相交联。

以下，首先说明第一个代表实例的发明。

如上所述，根据第一个代表例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述有机微机复合层由在上述中空型芯高分子层的表面上(b1)由上述无机纳米粒子构成的无机纳米粒子层和(b2)由上述胶囊涂敷用高分子构成的胶囊涂敷用高分子层依次交替一次以上而成的一个或多个有机无机复合层构成。

例如，上述有机无机复合层可以为在上述中空型芯高分子层表面依次形成(b1)由上述无机纳米粒子构成的无机纳米粒子层和(b2)由上述胶囊涂敷用高分子构成的胶囊涂敷用高分子层的层。或者，上述有机无机复合层可以为在上述中空型芯高分子层表面依次形成(b1)层、(b2)层、(b1)层及(b2)层的层。

根据一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述中空型芯高分子层可以为(i)带正电荷的高分子的单个高分子芯层，也可以为(ii)带正电荷的高分子层和带负电荷的高分子层交替一次以上而成的复合高分子芯层，上述复合高分子芯层的最外围高分子层为带正电荷的高分子层。

如上所述，上述中空型高分子层可以为(i)带正电荷的高分子的单个高分子芯层。或者，上述中空型芯高分子层可以为(ii)带正电荷的高分子层和带负电荷的高分子层交替一次以上而成的复合高分子芯层，尤其，与(i)的情况相比，在(ii)的情况下，使牺牲芯材的表面变得更加光滑，从而可获得更容易形成有机无机复合层的有利效果。

只是，与反复涂敷带正电荷的高分子和带负电荷的高分子的情况相比，可通过数次反复涂敷一个种类的高分子也能够获得如上所述的光滑的表面。但是，通过自组装方式，反复涂敷带正电荷的高分子和带负电荷的高分子可更加容易形成光滑的表面。由此确认了可在更加简单的条件下，能够以更高的收益率交替层叠无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层的有机无机复合层。不仅如此，若通过自组装方式层叠多层，则与高分子单层相比，确认了机械物性和稳定性增加。

并且，优选地，当上述复合高分子芯层为单层时，上述复合高分子芯层为带正电荷的高分子单层，优选地，当上述复合高分子芯层为复合层时，最外围高分子层为带正电荷的复合层，这是因为有利于通过自组装方式，通常在芯高分子层表面交替层叠带负电荷的无机纳米粒子和带正电荷的高分子层。

并且，上述复合高分子芯层的厚度为8nm至12nm，优选地，在上述复合高分子芯层的厚度为9nm至11nm的情况下，可在反复的极度弹性变形中也能够维持优秀的稳定性。

根据再一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述带正电荷的高分子选自壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺(PEI)、聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)、聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDADMAC)及他们中的两种以上的混合物，上述带负电荷的高分子选自褐藻酸、肝素、聚苯乙烯磺酸(PSS)、聚丙烯酸(PAA)及他们中的两种以上的混合物。

根据另一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述中空型芯高分子层为(i)壳聚糖单个高分子芯层或者为(ii)中空壳聚糖层和在上述中空壳聚糖层上褐藻酸层及壳聚糖层交替一次以上而成的复合高分子芯层，上述复合高分子芯层的最外围高分子层为壳聚糖高分子层。

根据再一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述(b)有机无机复合层由以上述无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层形成的1至30个有机无机复合层构成。

如上所述，上述(b)复合层可由以上述无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层形成的1至30个有机无机复合层构成，优选地，2至10个，最为优选地，由2至5个的有机无机复合层构成。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述无机纳米粒子选自二氧化硅、羟基磷灰石、磁铁矿、金、银及他们中的两种以上的混合物。

在本发明中，优选地，羟基磷灰石被柠檬酸盐及他们中的两种以上的混合物所覆盖，这是因为可通过负电荷的反抗力，可在水中很大程度提高分散稳定性，在没有上述覆盖过程的情况下，需要如超声波降解等追加步骤。并且，通过覆盖过程，可使未被覆盖的纳米粒子快速沉淀，从而具有顺畅进行自组装步骤的优点。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述胶囊涂敷用高分子为带正电荷的高分子。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述(b)有机无机复合层选自二氧化硅层和壳聚糖层依次层叠而成的一个或10个复合层、羟基磷灰石层和壳聚糖层依次层叠而成的一个或10个复合层及磁铁矿层和壳聚糖层依次层叠而成的一个或10个复合层中。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，在上述中空微胶囊中，在位于最外侧的上述胶囊涂敷用高分子层表面还形成最外角高分子层。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述最外围高分子层为带负电荷的高分子层。

通过上述追加涂敷等过程，可使最外围高分子层带正电荷或负电荷，上述过程使最外围层具有与在渗透压实验中所使用的渗透引导高分子电解质相反的电荷，从而简单进行渗透压实验。例如，在将带负电荷的聚苯乙烯磺酸用成渗透压引导高分子电解质的情况下，优选地，上述最外围层带正电荷。

尤其，在最外围高分子层为壳聚糖的情况下，壳聚糖粒子间会发生交联，因此很难形成均匀的粒子，但是，如以下实施例6-1、实施例6-2、实施例7、实施8所示，在最外围层为藻酸盐层而不是壳聚糖层的情况下，粒子和粒子不会交联，从而具有防止粒子和粒子凝聚而发生交联的优点。

以下，首先说明第二个代表实例的发明。

根据第二个代表实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述有机无机复合层由在上述中空型芯高分子层的表面上(b1′)由涂敷无机纳米粒子涂敷用高分子的上述无机纳米粒子构成的涂敷无机纳米粒子层和(b2)上述胶囊涂敷用高分子层交替一次或多次而成的一个或多个有机无机复合层构成，上述无机纳米粒子涂敷用高分子相交联。

例如，上述有机无机复合层可以为依次层叠(b1′)由涂敷无机纳米粒子涂敷用高分子的上述无机纳米粒子构成的涂敷无机纳米粒子层和(b2)由上述胶囊涂敷用高分子构成的胶囊涂敷用高分子层的层。或者，上述有机无机复合层可以为在上述中空型芯高分子层表面依次形成(b1′)层、(b2)层、(b1′)层及(b2)层的层。

在本发明中，“涂敷”无机纳米粒子层为“涂敷高分子”的无机纳米粒子层。

根据一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述中空型芯高分子层可以为(i)带负电荷的高分子的单个高分子芯层，也可以为(ii)带负电荷的高分子层和带正电荷的高分子层交替一次以上而成的复合高分子芯层，上述复合高分子芯层的最外围高分子层为带负电荷的高分子层。

如上所述，上述中空型芯高分子层可以为(i)带负电荷的高分子的单个高分子芯层。或者，上述中空型高分子层也可以为(ii)带负电荷的高分子层和带正电荷的高分子层交替一次以上而成的复合高分子芯层。

只是，与反复涂敷带正电荷的高分子和带负电荷的高分子的情况相比，可通过数次反复涂敷一个种类的高分子也能够获得如上所述的光滑的表面。但是，通过自组装方式，反复涂敷带正电荷的高分子和带负电荷的高分子可更加容易形成光滑的表面。由此确认了可在更加简单的条件下，能够以更高的收益率交替层叠无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层的有机无机复合层。

并且，优选地，当上述复合高分子芯层为单层时，上述复合高分子芯层为带负电荷的高分子单层，优选地，当上述复合高分子芯层为复合层时，最外围高分子层为带负电荷的复合层，这是因为有利于通过自组装方式，在芯高分子层表面层叠涂敷无机纳米粒子层。通常无机纳米粒子层带负电荷，但其上涂敷有带正电荷的高分子，因此在芯高分子层表面上通过自组装方式层叠的涂敷无机纳米粒子层带正电荷。

并且，上述复合高分子芯层的厚度为8nm至12nm，优选地，在上述复合高分子芯层的厚度为9nm至11nm的情况下，可在反复的极度弹性变形中也能够维持优秀的稳定性。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述带正电荷的高分子选自壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺盐酸盐、聚二甲基二烯丙基氯化铵及他们中的两种以上的混合物，上述带负电荷的高分子选自褐藻酸、肝素、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸及他们中的两种以上的混合物。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述中空型芯高分子层为藻酸盐单个层。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述(b)有机无机复合层由以上述涂敷无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层形成的1或30个的上述的有机无机复合层构成。

如上所述，上述(b)复合层可由以上述涂敷无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层形成的1至30个有机无机复合层构成，优选地，2至10个，最为优选地，由2至5个的有机无机复合层构成。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述无机纳米粒子选自二氧化硅、羟基磷灰石、磁铁矿、金、银及他们中的两种以上的混合物。

在本发明中，优选地，羟基磷灰石被柠檬酸盐及他们中的两种以上的混合物所覆盖，这是因为可通过负电荷的反抗力，可在水中很大程度提高分散稳定性。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述无机纳米粒子涂敷用高分子为带正电荷的高分子，上述胶囊涂敷用高分子为带负电荷的高分子。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，上述(b)有机无机复合层为由涂敷壳聚糖的二氧化硅层和藻酸盐层依次层叠而成的一个至10个的复合层。

根据又一具体实例，本发明公开中空微胶囊，其特征在于，在上述中空微胶囊中，在位于最外侧的上述胶囊涂敷用高分子层表面还包括最外围高分子层，上述最外围高分子层为带正电荷的高分子层。

本发明的再一实施方式涉及包括本发明的多个实例的中共微胶囊的软组织用支架。

本发明的另一实施方式涉及包括本发明的多个实例的中空微胶囊的药物传递体。

根据一实例，本发明公开药物传递体，其特征在于，上述药物传递体可借助机械找刺激呈现出反应性或者可借助机械刺激调整药物的释放。

本发明的又一实施例方式涉及中空微胶囊的制备方法，上述中空微胶囊的制备方法包括：步骤(A)，在①带正电荷的牺牲芯材或②被改性成带负电荷的牺牲芯材上形成芯高分子层；步骤(B)，①在上述牺牲芯材为带正电荷的牺牲芯材的情况下，在上述芯高分子层上交替一次以上地形成无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层，②在上述牺牲芯材为被改性成带负电荷的牺牲芯材的情况下，在上述芯高分子层上交替一次以上地形成涂敷无机纳米粒子涂敷用组合物的无机纳米粒子层和胶囊涂敷用高分子层；步骤(C)，使芯高分子和胶囊涂敷用高分子相交联；以及步骤(D)，对上述牺牲芯材进行蚀刻并消除。

根据一实例，本发明公开中空微胶囊的制备方法，其中上述带正电荷的牺牲芯材为碳酸钙微粒，被改性成带负电荷的牺牲芯材为被改性成磷酸盐的碳酸钙微粒，上述芯高分子层和上述胶囊涂敷用高分子层通过自组装方式形成。

在本发明中，上述改性成磷酸盐可以通过使碳酸钙与pH9至11的Na₂HPO₄溶液相接触来执行。

并且，在本发明中，壳聚糖可利用如戊二醛的交联剂以化学方式交联，藻酸盐可由Ca²⁺离子交联。

并且，在本发明中，优选地，在零下的温度中执行上述(C)交联步骤，尤其，优选地，作为交联对象的高分子为壳聚糖。在此情况下，很大程度提高了交联结合的柔韧性，由此制备的高分子层的弹性也得到了很大程度的提高。

以下，通过实施例，更加详细说明本发明，但是，本发明的范围和内容并不局限于以下实施例。并且，基于包括以下实施例的本发明的公开内容，具体地，本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施未公开实验结果的本发明，上述变形及修改也术语本发明的发明要求保护范围。

根据本发明的多个具体实例，本发明提供羟基磷灰石纳米粒子含量最大95％，即使从初始形态约变形90％之后可弹性恢复的生物体吸收性、生物体相同性弹性大孔多孔性羟基磷灰石-胶混合支架的制备方法。使涂敷胶的羟基磷灰石纳米粒子与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺相交联，并在-5℃至-80℃下，通过冷冻干燥获得多孔性结构。所制备的支架的弹性特性与所使用粒子的性质无关，上述结果通过使用PLGA纳米结构体来制备支架的情况来证明。通过改变1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺浓度和粒子含量来制备压缩弹性率相异的物质。通过生物体外及生物体内实验来确认了上述支架的生物体相容性。

并且，本发明提供利用呈现最大90％的弹性变形恢复力的相交联的混合二氧化硅纳米粒子/生物体相容性高分子中空微胶囊的冻结的合成方法。在可通过EDTA溶液蚀刻的碳酸钙微粒上通过自组装方式交替吸附壳聚糖粒子和7nm胶质性二氧化硅粒子来制备胶囊，并使壳聚糖层和戊二醛相交联。

在本发明的弹性支架的制备方法中，使用作为生物体相容性主要成分的羟基磷灰石、二氧化硅和PLGA纳米粒子最大95％，并将胶、壳聚糖或甘肃用于涂敷上述粒子的生物体高分子，且将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、远螯二环氧或戊二醛用成交联剂。

并且，在本发明的中空胶囊中，将二氧化硅、羟基磷灰或磁铁矿纳米粒子用成无机成分，将壳聚糖、胶或藻酸盐用成高分子成分，将戊二醛或远螯二环氧用成交联剂，且将碳酸钙用成牺牲芯材。

实施例

实施例1：通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺交联剂交联的羟基磷灰石/胶支架的制备及特性确认(覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石纳米粒子@1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺-交联的胶)

在-18℃下，交联覆盖柠檬酸盐并涂敷胶(来自猪的B型胶)的大小为200nm的羟基磷灰石纳米粒子，从而制备柔软且可弹性恢复的大孔多孔性羟基磷灰石/胶支架。在被冻结之前的最终溶液中，使高分子与粒子的重量百分比维持1:10。即，在0.6ml的去离子水中，向60mg的粒子涂敷6mg的胶，且将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺量设定完成0.1mg、0.5mg、2mg及4mg(参照图2a至图2d的扫描式电子显微镜照片)。图1a为4mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺支架的数字图像，图1a明显示出支架胫骨大压缩变形之后也能够恢复。将粒子以与胶激烈地混合、搅拌的方式涂敷之后，在冻结之前添加作为交联剂的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺。高分子的交联密度对所制备的支架的机械特性产生很大的影响。因使用0.1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，而在交联密度最低的情况下，获得如果冻一样的非常柔软的支架，并且，上述支架仅可在溶剂(水)中维持完全形态(图1b)。在0.6ml的去离子水内，在将胶的浓度从粒子60mg降低至3mg的情况下，呈现出相同结果。并且，用于获得具有适当强度的支架的胶的最终溶液内最优浓度为1重量百分比。

冻结温度的范围为-5至-80℃，并改变最终溶液内粒子含量，从而可调整支架的多孔性。在所有温度中，交联时间均为24小时。随着粒子含量的增加，支架的多孔性会下降，但是支架的机械强度会增加。将羟基磷灰石粒子的浓度改变为20重量百分比(在0.6ml的去离子水中，粒子含量为120mg)，将胶的浓度改变为1％(在0.6ml的去离子水中，胶的含量为6mg)且在0.6ml的最终溶液中，将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度改变为4mg来制备支架的情况下，也呈现出与上述相同的结果(图2e)。

对未处理的羟基磷灰石粒子、覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石粒子、涂敷胶的羟基磷灰石粒子及羟基磷灰石10％/胶1％/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺4mg成分的支架执行热重量分析。为了进行分析，使用经由冷冻干燥过程的薄盘形态的支架。分析结果，在支架中，无级含量为90％且有机含量为10％(图3)。

对高度为2mm、直径为8mm的支架盘实施流变分析。为了诱导线形振动变形，将角频率设定为ω＝10rad/s，将变形率定位γ＝0.025％。在所有实验中，ω及γ值相同。在0.1mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺支架的情况下，支架的前端弹性率为300Pa，在2mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺支架的情况下，支架的前端弹性率为7kPa，随着交联密度的增加，支架的前端弹性率也会增加(图4a及图4b)。

通过重量测定法来测定支架的膨胀率。在测定冷冻干燥的羟基磷灰石纳米粒子支架的重量之后，将其放置在去离子水中5分钟。用过滤纸擦去膨胀的样品表面的水并测定重量之后，通过公式(1)SR＝(Wh-Wd)/Wd来计算支架的膨胀率。公式中，Wh为膨胀的支架的平衡重量，Wd为干燥的支架的重量。对四种相同样品分别测定三次重量之后求出平均值。

支架的膨胀率和机械特性可通过以下两个变量来控制。第一，在冻结步骤之前，可通过改变1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺含量来改变支架的交联密度，第二，使胶和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的含量恒定，从而可改变粒子的浆料浓度。在仅由高分子形成的支架的情况下，第二个变量不妥当。可从图4a及图4b所示的流变数据中确认上述事实。考虑到上述性质，可确定利用在特定条件下制备的支架的鞋特性的用途。例如，类似于脂肪组织，0.5mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺支架具有3kPa的弹性率，因此可用于脂肪组织用组织工学的用途。如预测，随着交联密度的增加，支架的膨胀率和储存弹性率会降低(图4c)。

分析了经由洗涤、压热器加热及冷冻干燥过程的盘形态的羟基磷灰石纳米粒子-胶支架的分节特性。将样品切割成直径为8mm、厚度为1.5-2mm的大小之后测定了重量。将仅由10％的胶形成的支架用成对照组。在磷酸盐缓冲液(PBS)中，在存在胶原酶的条件下，对交联的胶进行酶分解。使用0.16mg/mL的磷酸盐缓冲液(1％，pH7.4)和来自Clostridium histolyticum的胶原酶、作为活化剂的1.45mg/mL氯化钙磷酸盐缓冲液溶液、作为抗菌剂的0.01mg/mL(0.001％)叠氮化钠来制备酶溶液。在48孔组织培养板上，将交联密度不同的各个支架放置在1.5ml的酶溶液之后，在恒温箱中维持37℃的温度。随着交联密度增加，进行支架的生物体外酶分解所需要的时间也增加，在所有条件下，在两周之内完成分解(图5)。在20％羟基磷灰石纳米粒子支架的情况下，得经过由酶粒子网构成的细密的壁，因此会花费更长时间。

在37℃温度下，在5％CO₂环境下，在添加10％胎牛血清和1％抗生剂溶液的DMEM-F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12)完全培养基中培养了NIH 3T3纤维芽细胞。每48小时交换培养基。使用0.25％胰蛋白酶来从培养板回收细胞之后，向经由冷冻干燥及杀菌处理的支架上喷洒包含5×10⁵个细胞的约为10μl的细胞悬浮液。孵化支架1小时之后，将其放置在完全培养基溶液。图6为为了确认细胞相容性而孵化三日喷洒NIH 3T3细胞的羟基磷灰石10％/胶1％/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺4mg支架后拍摄的扫描式电子显微镜图像。可从扫描式电子显微镜图像中知道细胞积极地与支架壁碰撞。

用去离子水对合成的支架进行洗涤之后，在压热器中进行了加热。在细胞培养基(DMEM,Sigma-Aldrich,MO,USA)内，以生理条件对杀菌处理的支架进行预处理。接着，在无菌条件下，对支架进行冷冻干燥。在得到光州科学技术院(GIST)动物实验论理委员会的许可下执行动物实验。使用异氟醚对公老鼠(Balb/c，五个月，东方生物，韩国京畿)进行麻醉，并将杀菌处理的支架移植在老鼠的皮下空间。两周之后，在老鼠死亡之后回收了支架。在甲醛溶液中固定回收的样品之后，用石蜡包埋了支架。使用切片机(Leica RM2135,Wetzlar,Germany)，将石蜡内的支架切割成6μm的厚度。用苏木精和伊红和天狼星红对样品载玻片进行染色之后，用明场显微镜(Axioskop40,Carl Zeiss,Jena,Germany)观察了上述样品载玻片。如图7所示，两周内，移植的支架被非常薄的胶原蛋白层所包围，少量的免疫细胞位于支架和生物体的边界。并且，观察到多个血管，从而确认了大量的组织在从生物体移植的支架内生长。因此，确认了支架在生物体内具有优秀的生物体相容性。

实施例2：制备以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺交联剂交联的二氧化硅/胶支架(二氧化硅@1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺交联的胶)

使大小500nm的二氧化硅纳米粒子10重量百分比在e-管内涡旋并涂敷1％胶。溶液的最终体积为0.6ml，粒子和高分子的量分别为60mg和6mg。向最终溶液添加4mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺交联剂，并在-18℃的温度下，进行冻结24小时来完成交联。所获得的支架的机械特性与实施例1的羟基磷灰石10％/胶1％/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺4mg支架类似(图2f)。支架的壁主要由二氧化硅粒子构成。

实施例3：制备通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺交联剂交联的/胶支架(PLGA@1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺-交联的胶)

通过溶剂乳化法合成大小约为500nm的PLGA纳米粒子。在水中，为了提高PLGA分散液的稳定性，向所获得的粒子涂敷胶。以45℃的温度对涂敷的粒子的分散液进行加热来提高稳定性。粒子与高分子的重量比为10:1。在0.6ml的最终去离子水分散液内的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的量为4mg。在-25℃下，执行交联24小时。

实施例4：制备通过远螯二环氧交联剂交联的羟基磷灰石/壳聚糖支架(覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石纳米粒子@TKD-交联的壳聚糖)

使大小约为200nm的覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石纳米粒子10重量百分比在e-管内涡旋并涂敷1％胶。溶液的最终体积为0.6ml，粒子和高分子的量为60mg和6mg。向最终溶液添加5mg的远螯二环氧交联剂，并在-18℃下，进行冻结24小时来完成交联。

实施例5：制备通过戊二醛交联剂交联的羟基磷灰石/壳聚糖支架(覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石纳米粒子@GA-交联的壳聚糖)

使大小约为200nm的覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石纳米粒子10重量百分比在e-管内涡旋并涂敷1％壳聚糖。溶液的最终体积为0.6ml，粒子和高分子的量分别为60mg和6mg。向最终溶液添加5mg的戊二醛交联剂，在-18℃下，进行冻结24小时来完成交联。

实施例6：制备将碳酸钙粒子用成模板的二氧化硅/壳聚糖混合中空胶囊

根据报告的方法，将碳酸钙微粒用成牺牲芯材来制备中空胶囊。通过简单的沉淀反应合成平均大小为6至20μm的球形碳酸钙粒子。快速混合相同体积的碳酸钠溶液和氯化钠溶液之后，在100ml的圆底烧瓶内以1000RPM进行搅拌。可通过改变反应时间和反应物的浓度来调整CaCO₃芯的大小。在pH7中，芯呈现不溶性，但是，在pH≤4的酸性pH条件下，芯会完全溶解。

利用两种不同的涂敷方法来制备混合中空胶囊。在第一个方法中，在球形碳酸钙牺牲粒子上交替涂敷壳聚糖和7nmLudox SM胶质性二氧化硅粒子，在第二个方法中，在被改性成钙磷酸盐的球形碳酸钙牺牲粒子上交替涂敷了涂敷壳聚糖的7nmLudox SM胶质性二氧化硅粒子和藻酸盐。

(1)第一个方法(①被改性成磷酸盐的CaCO₃@Chi-Alg-Chi-(SiO₂–Chi)₃-Alg)

如图8a所示，在pH10的条件下，使碳酸钙粒子与0.2M的Na₂HPO₄发生反应(通过NaOH溶液调整pH)，由此将碳酸钙粒子表面改性成磷酸盐离子。在涂敷主要高分子之前，如下形成由壳聚糖-藻酸盐-壳聚糖形成的高分子基材(base)。

向去离子水分散直到重量的被改性的碳酸钙芯，并经由10分钟的超声波处理之后，与0.5M的NACl溶液内5％壳聚糖溶液混合10分钟。之后，与0.5M的NaCl溶液内1％藻酸盐溶液混合10分钟，由此涂敷了藻酸盐。涂敷藻酸盐的CaCO₃与0.5M的NaCl溶液内5％壳聚糖溶液混合10分钟，由此涂敷壳聚糖，接着，涂敷Chi-Alg-Chi的(在本发明中，涂敷顺序为从左侧向右侧层依次涂敷)的CaCO₃粒子与2.5％7nmLudox SM胶质性二氧化硅粒子混合10分钟，从而形成作为第四层的7nmLudox SM胶质性二氧化硅粒子层。作为第五层，通过如上所述的方法涂敷了壳聚糖层。各个步骤之后，以0.1MNaCl进行了三次洗涤。通过反复第四及第五步骤来形成所需要数量的层。

(2)第二个方法(②CaCO₃@Alg-(Chi@SiO₂-Alg)₃)

如图8b所示，将未被改性的CaCO₃粒子用成牺牲芯材，涂敷藻酸盐的CaCO₃与涂敷壳聚糖的7nmLudox SM胶质性二氧化硅粒子的分散液混合10分钟，由此形成作为第二层的涂敷壳聚糖的7nmLudox SM胶质性二氧化硅粒子层，涂敷Alg-Chi@SiO₂的(Chi@SiO₂为涂敷壳聚糖的二氧化硅粒子)CaCO₃粒子与1％褐藻酸钠混合10分钟，从而形成作为第三层的藻酸盐层。在各个步骤之后，通过0.5MNaCl进行三次洗涤，并反复上述第二及第三步骤形成所需要数量的层。在两种方法的情况下，均为了防止凝聚而将藻酸盐作为最终层。

(3)交联及蚀刻(①Chi-Alg-Chi-(SiO₂-Chi)₃-Alg，②Alg-(Chi@SiO₂-Alg)₃)

上述两种情况下，均如下以相同的方式执行交联，通过上述两种方法制备的多层胶囊粒子与200μl的50％戊二醛溶液混合，并在-18℃下进行冻结之后，进行交联24小时。

完成交联后，通过水和CaCO₃对粒子进行三次洗涤，并用pH7.5的0.1MEDTA溶液进行蚀刻三小时。

(4)观察弹性

使用大小不同的碳酸钙芯，可通过几乎相同的方法获得多种大小的混合中空胶囊(图8b)。通过与胶囊相比，内径小80％的窄小膜片钳来压接中空胶囊之后，测定变形和恢复来确定弹性(图9i)。胶囊变形至80-90％之后，可完全复原。中空胶囊在基于渗透压的变形之后也呈现出恢复能力，相反，在向在壳层不包含粒子的对照组胶囊施加渗透压时，对照组胶囊被破坏(图9ii)。在渗透压实验中，在多种浓度的聚合物(苯乙烯磺酸钠)(PSS，Mw70kDa)溶液中，培养最终层为壳聚糖层的胶囊10分钟。

实施例7：制备羟基磷灰石/壳聚糖混合中空胶囊(被改性成磷酸盐的CaCO₃@Chi-Alg-Chi-(覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石纳米粒子-Chi)₃-Alg)

从Sigma-Aldrich公司购买羟基磷灰石粒子，通过0.1MHCl调整的pH6及在室温条件下，通过0.2MTrisodium citrate进行处理12小时。通过去离子水对粒子进行完美洗涤，粒子的平均大小为150nm，且电动电势为-27mV。

在pH10中(通过NaOH调整pH)，CaCO₃粒子表面与0.2MNa₂HPO₄发生反应，从而被改性成磷酸盐。在涂敷主要高分子之前，在带负电荷的磷盐酸改性粒子如下形成有壳聚糖-藻酸盐-壳聚糖三个层形成的高分子基材。

向去离子水分散直到重量的碳酸钙芯，并经由10分钟超声波处理之后，与0.5M的NaCl溶液内5％壳聚糖溶液混合10分钟。接着，与0.5M的NaCl溶液内1％藻酸盐溶液混合10分钟，由此涂敷了藻酸盐。涂敷藻酸盐的CaCO₃与0.5MNaCl溶液内5％壳聚糖溶液混合10分钟，由此涂敷壳聚糖。

接着，涂敷Chi-Alg-Chi的(在本发明中，涂敷顺序为从左侧向右侧层依次涂敷)的CaCO₃粒子与2.5％羟基磷灰石纳米粒子混合10分钟，从而形成作为第四层的覆盖柠檬酸盐的羟基磷灰石粒子(平均直径为150nm)。作为第五层，通过如上所述的方法涂敷壳聚糖层。在各个步骤之后，以0.1MNaCl进行了三次洗涤。通过反复第四及第五步骤来形成所需要数量的层。

交联步骤如下。多层的CaCO₃粒子与200μl的50％戊二醛溶液混合，在-18℃下进行冻结之后，进行交联24小时。完成交联后，通过水和CaCO₃对粒子进行三次洗涤，并用pH5.5的0.1MEDTA溶液进行蚀刻三小时。

实施例8：制备Fe₃O₄/壳聚糖混合中空胶囊(被改性成磷酸盐的CaCO₃@Chi-Alg-Chi-(磁铁矿-Chi)₃-Alg)

FeCl₃6H₂O(0.1M)溶液和FeCl₂4H₂O(0.2M)溶液利用1MHCl被调节成具有酸性pH，并混合5％SDS表面活性剂来调整粒子的凝聚。在非活性大气条件下，向上述混合溶液慢慢添加氢氧化铵，直到上述混合溶液的pH达到12。通过丁醇对合成的粒子进行洗涤，在600℃中，混合月桂酸和磁粒(比例3:2)，由此在粒子表面涂敷月桂酸。通过丙酮对未涂敷的月桂酸进行洗涤，并作为表面活性剂再次向水悬浮(resuspended)。

在pH10的条件下，CaCO₃粒子表面与0.2MNa₂HPO₄发生反应2小时，从而被改性成磷酸盐。在涂敷主要的高分子之前，在带负电荷的磷酸盐改性粒子如下形成由壳聚糖-藻酸盐-壳聚糖三个层形成的高分子基材。

向去离子水分散知道重量的被改性的碳酸钙芯，并经由10分钟的超声波处理之后，与0.5M的NACl溶液内5％壳聚糖溶液混合10分钟。之后，与0.5M的NaCl溶液内1％藻酸盐溶液混合10分钟，由此涂敷了藻酸盐。涂敷藻酸盐的CaCO₃与NaCl溶液内5％壳聚糖溶液混合10分钟，由此涂敷壳聚糖。

接着，涂敷Chi-Alg-Chi的(在本发明中，涂敷顺序为从左侧向右侧层依次涂敷)的CaCO₃粒子与2.5％氧化铁纳米粒子混合10分钟，从而形成作为第四层的氧化铁磁铁纳米粒子(平均直径为15nm)。在各个步骤之后，通过0.1MNaCl进行三次洗涤，并反复上述第四及第五步骤形成所需要数量的层。

交联步骤如下。多层的CaCO₃粒子与200μl的50％戊二醛溶液混合，在-18℃下进行冻结之后，进行交联24小时。完成交联后，通过水和CaCO₃对粒子进行三次洗涤，并用pH5.5的0.1MEDTA溶液进行蚀刻三小时。

实施例9：制备药物传递体及特性实验

(1)制备中空胶囊

根据上述实施例6的第一个方法，分别制备了具有(Chi-Alg-Chi)-(SiO₂-Chi)1-Alg结构的一层的混合中空胶囊(1L-HHC)和具有(Chi-Alg-Chi)-(SiO₂-Chi)₃-Alg结构的三层的混合中空胶囊(3L-HHC)。并且，为了进行对比，也制备了呈没有无机纳米粒子的(Chi-Alg–Chi)-(Alg–Chi)₃-Alg结构的三层中空胶囊(3L-HC)。

(2)中空胶囊内药物搭载及释放实验

在悬浮模型药物的0.1MNaCl溶液分散上述制备的中空胶囊，并在室温中放置12小时，从而搭载中空胶囊内药物。使用了如FITC、PEI800Mw、PEI1300Mw、FITC-Dextran4kDa、Lysozyme14kDa、FITC-BSA的多种分子量的模型药物。

表面被水虎鱼(Piranha)溶液(3:1，H₂O₂/H₂SO₄)亲水化处理的载玻片上涂敷带正电荷的Mw70kDa壳聚糖，接着涂敷上述制备的药物搭载中空胶囊(带负电荷的Alg为最外围高分子层)。以手动的方式分别施加100g、250g、500g的压力6秒钟之后，收集释放的溶液，并用新的水重新填充。以在解除压力之后从弹性变形复原的状态放置10分钟，并观察扩散并排出的溶液。

在493nm中，通过测定吸光度来分析搭载FITC、FITC-Dextran及FITC-BSA的胶囊的药物释放量，在570nm中，通过茚三酮法分析PEI释放量，在275-280nm中，通过测定吸光度来分析Lysozyme释放量。

结果，在直至释放所有药物的总共六次的循环期间，在每一次循环中，作为本发明的混合中空胶囊的三层中空胶囊的平均释放量为13.5％。相反，在最初压缩中，用于对比的作为中空胶囊的三层中空胶囊的释放量为49.7％，在第三次循环中，释放完所有药物。

实施例9：中空微胶囊的药物装载及基于外力的药物释放(比较对照组胶囊(Chi-Alg-Chi)-(Alg-Chi)₃和混合胶囊(Chi-Alg-Chi)-(SiO₂-Chi)₃)

向中空为胶囊装载的分子量小的模型药物可使用fluorescein，向中空为胶囊装载的分子量大的模型药物可使用荧光(FITC)标记的葡聚糖(MW：4kDa)。在上述模型药物以0.1w/v％溶解的0.1MNaCl溶液中，在室温放置中空胶囊12小时，从而可用成模型药物。其中，作为一例，装载荧光标记葡聚糖的中空微胶囊借助外部压力释放药物。

在载玻片表面附着胶囊之后，在载玻片表面均匀地展开装载药物的胶囊之后，反复施加0.98N的机械压力6秒钟并解除压力进行松弛10分钟的过程来观察药物的释放(图10a)。所使用的中空微胶囊的种类为两种，对照组(control)使用了涂敷壳聚糖及褐藻酸的(Chi-Alg-Chi)-(Alg-Chi)₃而成的胶囊，实验组使用了包含二氧化硅粒子的(Chi-Alg-Chi)-(SiO₂-Chi)3的混合中空胶囊(3L-HHC)。在493nm波长中定量借助各个的外力循环释放的荧光标记葡聚糖并根据时间提示(图10b)。图10c将图10b的结果通过累积图表呈现，图10c还提出在各个的外力循环的对应始点的代表胶囊的荧光显微镜图像。