用于预防和治疗癌症和癌细胞迁移的抗CCL25抗体和抗CCR9抗体的制作方法
本申请要求享有于2011年9月29日提交的美国专利申请第13/248,904号、于2011年9月15日提交的美国专利申请第13/233,769号以及于2010年12月14日提交的美国专利申请第12/967,273号的优先权。所有上述申请的全部内容通过引用的方式并入本文中。
技术领域
本申请主要涉及抗体领域。特别是，本申请涉及用于抑制或预防癌细胞生长和/或迁移的抗趋化因子和/或抗趋化因子受体抗体的应用。
背景技术：
尽管在癌症研究的最新进展，用于治疗恶性肿瘤的细胞特异性疗法仍然是难以捉摸的。许多的复杂的因素(能够使恶性细胞发生突变，逃避免疫保护和促进血管发生，从而为迅速生长的细胞提供营养)使靶向治疗方式的发展复杂化。目前的疗法有多种不良副作用。例如，化疗导致多种痛苦，有时甚至引起致命的副作用。生物技术的进步促进了具有较少副作用的靶向生物制剂的发展。
宿主细胞具有与信号的配体联合的表面受体，并导致宿主细胞活动。表皮生长因子受体有助于控制细胞的生长和转移。许多肿瘤细胞比正常细胞表达更高数量的表皮生长因子受体。一种新的治疗特定的IMC-225是专门设计用来靶向和阻断表皮生长因子受体，从而阻止细胞分裂和修复。最近，曲妥单抗(这是一种HER-2-特异性单克隆抗体)已被证明有效治疗转移性乳腺癌。该抗体阻断在抑制细胞生长的癌细胞上的相互作用。但是，HER-2在仅约25％到30％的乳腺癌细胞上被发现。
趋化因子是小的细胞因子样蛋白质的超家族，细胞因子样蛋白质对水解具有抗性，促进新生血管形成或者内皮细胞生长抑制，诱导细胞支架重排，活化或钝化淋巴细胞，并且通过与G蛋白偶联受体的相互作用调节趋向性。趋化因子可以调节表达其受体的宿主细胞的生长和迁移。
趋化因子(C-C基序)配体25(CCL25)，也已知为胸腺表达的趋化因子(TECK)，是属于CC趋化因子家族的小细胞因子。CCL25对胸腺细胞、巨噬细胞和树突细胞具有趋化性。CCL25通过结合趋化因子受体CCR9发挥其作用，并且被认为是对T细胞的发育起到了作用。所产生的人CCL25是一种包含151个氨基酸的蛋白前体。CCL25的基因(scya25)位于人第19号染色体上。
趋化因子(C-C基序)受体9(CCR9)，也已知为GPR 9-6，在胸腺(在未成熟和成熟T细胞上)中高表达，而在淋巴结和脾脏中低表达。CCR9也丰富地存在于消化道中，其表达与肠的T细胞相关。请注意，结合蛋白D6的趋化因子先前已经被称作CCR9，但是这个分子是清道夫受体，而不是真正的(信号)趋化因子受体。
技术实现要素：
本申请的一个方面涉及一种在受试者中治疗胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或它们的组合的步骤，其中，所述治疗有效量为大约0.5至50mg/kg。在另一个实施方式中，所述方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CCL25和/或CCR9免疫原来诱导抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。
本申请的另一个方面涉及在受试者中治疗癌症的方法，其包括：向所述受试者施用有效量的在受试者中表达抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或它们的组合的表达载体，其中，所述癌症是胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤。
本申请的另一个方面涉及在受试者中治疗或预防癌症的方法，其包括：向所述受试者施用有效量的表达下列试剂的表达载体：(1)抑制CCL25和/或CCR9表达的试剂，或(2)抑制CCL25和CCR9间的相互作用的试剂，或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的试剂，其中，所述癌症是胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤。
本申请的另一个方面涉及一种用于预防或抑制具有CCL25和/或CCR9表达升高的癌细胞在受试者中的迁移或转移的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗CCL25抗体、或抗CCR9抗体、或它们的组合的步骤，其中，所述治疗有效量为大约0.5至50mg/kg。在另一个实施方式中，所述方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CCL25和/或CCR9免疫原来诱导抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。在另一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用表达抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或它们的组合的表达载体的步骤。
本申请的另一个方面涉及一种提高化疗效果的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用有效量的抗CCL25抗体、或抗CCR9抗体、或它们的组合的步骤，其中，所述有效量为大约0.5至50mg/kg，其中，所述癌症是胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤。在另一个实施方式中，所述方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CCL25和/或CCR9免疫原来诱导抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。在另一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用在受试者中表达抗CCL25抗体、或抗CCR9抗体、或它们的组合的表达载体的步骤。
本申请的另一个方面涉及一种提高化疗效果的方法。所述方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用有效量的能够表达下列试剂的表达载体：(1)抑制CCL25和/或CCR9表达的试剂，或(2)抑制CCL25和CCR9间的相互作用的试剂，或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的试剂，其中，所述癌症是胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤。
本申请的另一个方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和能够表达下列试剂的表达载体：(1)抑制CCL25和/或CCR9表达的试剂，或(2)抑制CCL25和CCR9间的相互作用的试剂，或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的试剂。
附图说明
图1显示了乳腺癌组织的CCL25表达。
图2显示了CCL25抑制了顺铂诱导的乳腺癌细胞系生长的减少。
图3A-B显示了CCL25保护乳腺癌细胞免受顺铂诱导的凋亡。
图4A-B显示了乳腺癌细胞系中CCL25-CCR9相互作用导致的PI3K和Akt活化。
图5A-B显示了乳腺癌细胞系的CCL25处理之后的GSK-3β和FKHR的磷酸化。
图6显示了卵巢癌组织的CCR9和CCL25表达。
图7A-B显示了卵巢癌组织的CCL25表达的分析。
图8A-B显示了卵巢癌组织的CCR9表达的分析。
图9A-B显示了卵巢癌细胞系的CCR9和CCL25表达。
图10A-B显示了卵巢癌细胞的缺氧调节的CCR9mRNA和表面蛋白表达。
图11A-B显示了SKOV-3细胞的缺氧介导的和CCL25介导的迁移和侵袭。
图12A-B显示了SKOV-3细胞的CCL25诱导的胶原蛋白酶表达。
图13A-B显示了SKOV-3细胞的CCL25诱导的明胶酶表达。
图14A-B显示了SKOV-3细胞的CCL25诱导的基质降解酶表达。
图15显示了前列腺癌细胞的CCR9表达。
图16A-D显示了前列腺组织的CCR9表达。
图17A-D显示了前列腺癌组织的CCL25表达。
图18显示了正常健康供体或者患有前列腺疾病的患者的血清CCL25水平。
图19A-C显示了小鼠骨髓细胞的CCL25表达。
图20A-B显示了CCR9介导的前列腺癌细胞迁移和侵袭。
图21显示了前列腺癌细胞系的CCL25诱导的活性MMP表达。
图22A-F显示了CCR9基因敲减(knockdown)抑制PC3前列腺癌细胞系的骨转移。
图23显示了肺癌细胞患者的血清CCL25水平。
图24A-C显示了非肿瘤肺和肺癌组织的CCR9表达。
图25A-C显示了结肠癌组织的CCR9-CCL25表达。
具体实施方式
提供如下详细描述以使本领域技术人员实施和使用本发明。为了解释说明的目的，所提及的特定命名提供了对于本发明的彻底理解。但是，很明显，本领域技术人员应该理解，这些具体细节对于实施本发明不是必需的。提供特定应用的描述仅作为示例性实施例。不应认为本发明限于所示实施方式，而应给予与在此所公开的原理和特征相一致的最宽的可能的范围。
除非另有定义，所使用的与本申请有关的科学和技术术语应该具有本领域技术人员常规理解的含义。此外，除非上下文需要，单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。
定义
如在此所使用的，如下术语应该具有下面的含义：
本文所用术语“治疗(treat、treating或treatment)”指的是减轻或消除病症和/或伴随症状的方法。本文所用术语“预防(prevent、preventing或prevention)”指的是阻止受试者得到病症和/或伴随症状的方法。在某些实施方式中，术语“预防”指的是减小得到病症和/或伴随症状的风险的方法。
本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含特异性结合抗原(与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。术语“抗体”使用了广义含义，并且具体地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示所需的生物活性即可。“特异性结合”或者“与…发生免疫反应”是指，抗体与所需抗原的一个或者多个抗原决定簇反应，并且不会与其它多肽反应(即，结合)或者与其它多肽以非常低的亲和力结合。术语“抗体”也包括抗体片段，所述抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体(scFv)分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在本发明的某些实施方式中，合意的是，例如，使用抗体片段，而不是完整抗体，以提高肿瘤穿透性。在这种情况下，合意的是，使用已通过本领域任何已知方式修饰以提高其血清半衰期的抗体片段。
在此所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同系的抗体的群体获得的抗体，也就是说，除了可以以较小量存在的可能的自然发生的突变，包括所述群体的单个抗体是相同的。在此所述的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体以及这些抗体的片段，在“嵌合”抗体中，重链和/或轻链的一部分与源自特定种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应的序列相同或者同系，而链的其余部分与源自其它种或者属于其它抗体类别或亚类的抗体中相应的序列相同或者同系，只要它们显示所需的生物活性即可。
非人抗体的“人化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于绝大部分，人化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，将来自受体高变区的残基用来自具有所需特异性、亲和性和/或容量的非人种(供体抗体)(例如，小鼠、大鼠、兔子或者非人灵长动物)的高变区的残基来替代。制备人化抗体和其它嵌合抗体的方法为本领域已知的方法。
“双特异性抗体”是对于至少两个不同抗原具有结合特异性的抗体。在当前情况下，所述结合特异性中的一种是对于CXCL16或CXCR6的。第二结合靶为任何其它抗原，并且有利地为细胞表面蛋白或者受体或受体亚单元。制备双特异性抗体的方法为本领域已知的方法。
“非同性结合抗体(heteroconjugate antibody)”的使用也在本发明的范围内。非同性结合抗体由两种共价结合的抗体组成。例如，这种抗体已经被提出靶向免疫系统细胞至不该有的细胞(美国专利第4,676,980号)。应该注意到，可以利用已知的合成蛋白质化学的方法(包括涉及到交联剂的那些方法)在体外制备抗体。
本发明还考虑使用“免疫结合物”，包括与细胞毒性剂(如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段))或放射性同位素(即放射性结合物(radioconjugate))结合的抗体。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括：白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，蓖麻毒素A链，相思子毒素A链，蒴莲根毒素A链，巨曲霉蛋白毒素(α-sarcin)，油桐蛋白，石竹素蛋白，垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂(momordica charantia inhibitor)，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草抑制剂，白树毒素，米托洁林(mitogellin)，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素和新月毒素。各种放射性核素可用于制备放射性结合的抗体。实例包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
在药理学意义上说，在本发明的上下文中，抗体的“治疗有效量”指的是就抗体对治疗是有效的而言在疾病的预防或治疗中有效的量。“疾病”是将从用抗体治疗中获益的任何状态，包括癌和化学抗性。这包括慢性和急性疾病或病症，包括正在讨论的那些使哺乳动物易患病的病理状态。
本文所用的术语“肿瘤”是指通过细胞异常生长形成的赘生物或实体性病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。
术语“癌症”被定义为恶性赘生物或恶性肿瘤，是细胞族群表现出不受控制的生长、侵入并破坏相邻组织的浸润并且有时通过淋巴或血液转移或扩散到体内的其他位置的一类疾病。癌症的这三种恶性属性使其有别于良性肿瘤，良性肿瘤不侵入或转移。示例性的癌症包括：癌，黑素瘤，肉瘤，淋巴瘤，白血病，生殖细胞瘤，和胚细胞瘤。
在此所用的术语“癌”是指侵袭性恶性肿瘤，其由变异的上皮细胞或者未知组织发生的变异的细胞组成，但是其具有与上皮细胞相关的特定分子或者组织特性，例如，细胞角蛋白或者细胞间桥的生成。本申请的示例性的癌包括卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛素瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、髓母细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、垂体瘤和骨癌。
在此所用的术语“淋巴瘤”是指免疫系统的淋巴细胞的癌症。淋巴瘤通常表现为实体瘤。示例性淋巴瘤包括：小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、典型性霍杰金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍杰金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、亚顶极NK细胞淋巴瘤、真菌病真菌瘤、塞扎里综合征、原发性侵犯皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性障碍、原发性侵犯皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特异性外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。典型性霍杰金淋巴瘤的示例形式包括：结节性硬化型、混合细胞型、富淋巴细胞型和淋巴细胞耗尽型或者淋巴细胞不耗尽型。
在此所使用的术语“肉瘤”为由胚胎中胚层发展成的许多组织之中的一种组织中的变异细胞引起的癌症。因此，肉瘤包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。例如，骨肉瘤来源于骨，软骨肉瘤来源于软骨，脂肪肉瘤来源于脂肪，以及平滑肌肉瘤来源于平滑肌。示例性的肉瘤包括：Askin瘤、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤因原始神经外胚叶瘤(Ewing's-PNET)、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。软组织肉瘤的亚类包括软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤韧带样纤维瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。
在此所使用的术语“白血病”是指以白细胞异常增加为特征的血液或骨髓的癌症。白血病是覆盖一类疾病谱的广义术语。反过来，其是称为血液肿瘤的更宽泛疾病组的一部分。白血病细分为许多大组；第一分组在白血病的急性和慢性形式之间。急性白血病的特征在于，不成熟血细胞的数量迅速增加。由这些细胞导致的拥挤现象使骨髓不能产生健康血细胞。慢性白血病的特征在于，相对成熟但仍不正常的白细胞过度增长。通常在数月或数年间发展，所述细胞较比正常细胞以快得多的速率产生，从而导致血液中存在许多不正常的白细胞。白血病还通过受感染的细胞来细分。这一分级将白血病分为成淋细胞性白血病或者淋巴细胞性白血病，以及髓细胞性白血病或者骨髓性粒细胞性白血病。在成淋细胞性白血病或者淋巴细胞性白血病中，癌性变化发生在通常持续形成淋巴细胞的髓细胞类型中。在髓细胞性白血病或者骨髓性粒细胞性白血病中，癌性变化发生在通常持续形成红细胞、一些其它类型白细胞和血小板的髓细胞类型中。结合这两种分类方法提供了全部四种主要的分类。在这四种分类中的每一类中，通常存在几种典型的亚类。也有在这种分类法之外的罕见类型。示例性的白血病包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞前淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞性白血病、少年型粒-单核细胞型白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、Burkitt白血病和成人T细胞性白血病。
在此所使用的术语“黑素瘤”为黑素细胞的癌症或恶性肿瘤。黑素细胞是产生深色色素、黑色素的细胞，其是造成皮肤的颜色的原因。它们主要出现在皮肤中，但是也被发现在身体的其它部位，包括肠和眼睛。黑素瘤分为以下类型和亚型：恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、肢端黑素瘤、黏膜黑素瘤、结节性黑素瘤、息肉状黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、无黑素性黑素瘤、软组织黑素瘤、具有小痣状细胞的黑素瘤、具有Spitz痣特征的黑素瘤和色素层黑素瘤。
在此所使用的术语“生殖细胞瘤(GCT)”为由生殖细胞获得的赘生物。生殖细胞瘤可以是癌性的或非癌性的肿瘤。生殖细胞通常出现在生殖腺(卵巢和睾丸)的内部。起源于生殖腺外部的生殖细胞瘤可以是由胚胎发育过程中的错误导致的出生缺陷。生殖细胞瘤大概分为两类：生殖细胞瘤的或精原细胞瘤的生殖细胞瘤以及非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞瘤。示例性的生殖细胞瘤的或精原细胞瘤的生殖细胞瘤包括：生殖细胞瘤、无性细胞瘤和精原细胞瘤。示例性的非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞瘤包括：胚胎性癌、内胚层窦瘤或卵黄囊瘤(EST,YST)、绒毛膜癌、成熟型畸胎瘤、皮样囊肿、末成熟畸胎瘤、畸胎瘤伴恶变、多胚瘤、性腺胚细胞瘤和混合GCT。
在此所用术语“转移”是指肿瘤或癌从一个器官或部位扩散到其它不邻近的器官或部位。
术语“哺乳动物”是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人类，非人类灵长类动物，家畜和农场动物，动物园动物，竞技动物，或宠物动物，例如，狗，马，猫，牛等。优选地，所述哺乳动物是人。
术语“抑制”是相对术语，与参考试剂相比，如果在施用一种试剂之后一种反应或状态在数量上减少，或者如果在施用试剂之后其减少，则该试剂抑制了该反应或状态。同样地，术语“防止”并不一定意味着试剂完全消除了该反应或状态，只要反应或状态的至少一种特性被消除即可。因此，减少或防止感染或反应(如病理反应)的组合物能够，但不一定，完全消除这种感染或反应，只要感染或反应被适度地减少即可，例如，减少了在没有试剂的情况下或者在与参考试剂相比的情况下的至少约50％，如至少约70％，或约80％，或甚至约90％(即10％以下)的感染或反应。
术语“增加水平”是指高于相关领域中通常定义或使用的正常或对照水平的水平。例如，在组织中免疫染色的增加水平为被本领域普通技术人员认为高于在对照组织中的免疫染色水平的免疫染色水平。
术语“CXCL13免疫原”和“CXCR5免疫原”指的是一种免疫原组合物，其包含(1)得自CXCL13或CXCR5的免疫原肽和/或(2)编码并且能够表达得自CXCL13或CXCR5的免疫原肽的表达载体。得自CXCL13或CXCR5的免疫原肽可被融合到另一部分以增强其免疫原性。CXCL13免疫原肽的实例包括，但不限于，由选自RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQ ID NO:45)、PRGNGCPRKEIIVWKK(SEQ ID NO:46)、LPRGNGCPRKEIIVWK(SEQ ID NO:47)、QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48)、ILPRGNGCPRKEIIVW(SEQ ID NO:49)、RIQILPRGNGCPRKEI(SEQ ID NO:50)、RGNGCPRKEIIVWKKN(SEQ ID NO:51)、KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52)、IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53)、DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54)、RKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:55)、RCRCVQESSVFIPRRF(SEQ ID NO:56)、GNGCPRKEIIVWKKNK(SEQ ID NO:57)、CVQESSVFIPRRFIDR(SEQ ID NO:58)、IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO:59)、LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60)、FIDRIQILPRGNGCPR(SEQ ID NO:61)、RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62)、CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63)、QESSVFIPRRFIDRIQ(SEQ ID NO:64)、RFIDRIQILPRGNGCP(SEQ ID NO:65)、VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66)、ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67)、SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68)、NGCPRKEIIVWKKNKS(SEQ ID NO:69)、PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70)、RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71)、LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQ ID NO:72)、VQESSVFIPRR(SEQ ID NO:73、EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:74)、KKNK(SEQ ID NO:75)、RKRSSS(SEQ ID NO:76)、RGNGCP(SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78)、DRIQILP(SEQ ID NO:79)、RKEIIVW(SEQ ID NO:80)和KSIVCVDPQ(SEQ ID NO:81)中的一种或多种序列组成的肽，或者含有选自RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQ ID NO:45)、PRGNGCPRKEIIVWKK(SEQ ID NO:46)、LPRGNGCPRKEIIVWK(SEQ ID NO:47)、QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48)、ILPRGNGCPRKEIIVW(SEQ ID NO:49)、RIQILPRGNGCPRKEI(SEQ ID NO:50)、RGNGCPRKEIIVWKKN(SEQ ID NO:51)、KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52)、IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53)、DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54)、RKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:55)、RCRCVQESSVFIPRRF(SEQ ID NO:56)、GNGCPRKEIIVWKKNK(SEQ ID NO:57)、CVQESSVFIPRRFIDR(SEQ ID NO:58)、IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO:59)、LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60)、FIDRIQILPRGNGCPR(SEQ ID NO:61)、RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62)、CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63)、QESSVFIPRRFIDRIQ(SEQ ID NO:64)、RFIDRIQILPRGNGCP(SEQ ID NO:65)、VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66)、ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67)、SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68)、NGCPRKEIIVWKKNKS(SEQ ID NO:69)、PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70)、RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71)、LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQ ID NO:72)、VQESSVFIPRR(SEQ ID NO:73、EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:74)、KKNK(SEQ ID NO:75)、RKRSSS(SEQ ID NO:76)、RGNGCP(SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78)、DRIQILP(SEQ ID NO:79)、RKEIIVW(SEQ ID NO:80)和KSIVCVDPQ(SEQ ID NO:81)中的一种或多种序列的肽。CXCR5免疫原肽的实例包括，但不限于，由选自TSLVENHLCPATE(SEQ ID NO:82)、EGSVGWVLGTFLCKT(SEQ ID NO:83)、LPRCTFS(SEQ ID NO:84)、LARLKAVDNT(SEQ ID NO:85)和MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)中的一种或多种序列组成的肽，或者含有选自TSLVENHLCPATE(SEQ ID NO:82)、EGSVGWVLGTFLCKT(SEQ ID NO:83)、LPRCTFS(SEQ ID NO:84)、LARLKAVDNT(SEQ ID NO:85)和MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)中的一种或多种序列的肽。
术语“CXCL16免疫原”和“CXCR6免疫原”指的是一种免疫原组合物，其包含(1)得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽和/或(2)编码并且能够表达得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽的表达载体。得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽可以以融合蛋白的形式以增强其免疫原性。CXCL16免疫原肽的实例包括，但不限于，由选自AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89)、SWSVCGGNKDPWVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92)、RLRKHL(SEQ ID NO:93)、LQSTQRP(SEQ ID NO:94)、SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO:95)、AGENQKQPEKNA(SEQ IDNO:96)、NEGSVT(SEQ ID NO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98)、CGGNKDPW(SEQ ID NO:99)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ ID NO:101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO:102)、TGSCYCGKR(SEQ IDNO:103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO:104)、RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG(SEQ ID NO:105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO:106)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQ ID NO:110)和KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO:111)中的一种或多种序列组成的肽，或者含有选自AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89)、SWSVCGGNKDPWVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92)、RLRKHL(SEQ ID NO:93)、LQSTQRP(SEQ ID NO:94)、SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO:95)、AGENQKQPEKNA(SEQ ID NO:96)、NEGSVT(SEQ ID NO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98)、CGGNKDPW(SEQ ID NO:99)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ ID NO:101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO:102)、TGSCYCGKR(SEQ IDNO:103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO:104)、RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG(SEQ ID NO:105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO:106)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQ ID NO:110)和KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO:111)中的一种或多种序列的肽。CXCR6免疫原肽的实例包括，但不限于，由选自HQDFLQFSKV(SEQ ID NO:112)、AGIHEWVFGQVMCK(SEQ ID NO:113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO:115)中的一种或多种序列组成的肽，或者含有选自HQDFLQFSKV(SEQ ID NO:112)、AGIHEWVFGQVMCK(SEQ ID NO:113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO:115)中的一种或多种序列的肽。
术语“CCL25免疫原”和“CCR9免疫原”指的是一种免疫原组合物，其包含(1)得自CCL25或CCR9的免疫原肽和/或(2)编码并且能够表达得自CCL25或CCR9的免疫原肽的表达载体。得自CCL25或CCR9的免疫原肽可以以融合蛋白的形式以增强其免疫原性。CCL25免疫原肽的实例包括，但不限于，由选自LAYHYPIGWAVL(SEQ ID NO:116)、KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH(SEQ ID NO:117)、FEDCCLAYHYPIGWAVLRRA(SEQ ID NO:118)、IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN(SEQ ID NO:119)、AMKLLDAR(SEQ ID NO:120)、KVFAKLHHN(SEQ ID NO:121)、QAGPHAVKKL(SEQ ID NO:122)、FYLPKRHRKVCGNP(SEQ ID NO:123)YLPKRHRKVCGNPK(SEQ ID NO:124)、LPKRHRKVCGNPKS(SEQ ID NO:125)、PKRHRKVCGNPKSR(SEQ ID NO:126)、CGNPKSREVQRAMK(SEQ ID NO:127)、GNPKSREVQRAMKL(SEQ ID NO:128)、KFSNPISSSKRNVS(SEQ ID NO:129)、PKSREV(SEQ ID NO:130)、LHHNTQT(SEQ ID NO:131)和SSSKRN(SEQ ID NO:132)中的一种或多种序列组成的肽，或者含有选自LAYHYPIGWAVL(SEQ ID NO:116)、KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH(SEQ ID NO:117)、FEDCCLAYHYPIGWAVLRRA(SEQ ID NO:118)、IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN(SEQ ID NO:119)、AMKLLDAR(SEQ ID NO:120)、KVFAKLHHN(SEQ ID NO:121)、QAGPHAVKKL(SEQ ID NO:122)、FYLPKRHRKVCGNP(SEQ ID NO:123)YLPKRHRKVCGNPK(SEQ ID NO:124)、LPKRHRKVCGNPKS(SEQ ID NO:125)、PKRHRKVCGNPKSR(SEQ ID NO:126)、CGNPKSREVQRAMK(SEQ ID NO:127)、GNPKSREVQRAMKL(SEQ ID NO:128)、KFSNPISSSKRNVS(SEQ ID NO:129)、PKSREV(SEQ ID NO:130)、LHHNTQT(SEQ ID NO:131)和SSSKRN(SEQ ID NO:132)中的一种或多种序列的肽。CCR9免疫原肽的实例包括，但不限于，由选自QFASHFLPP(SEQ ID NO:133)、AAADQWKFQ(SEQ ID NO:134)、TFMCKVVNSM(SEQ ID NO:135)、IAICTMVYPS(SEQ ID NO:136)和VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ(SEQ ID NO:137)中的一种或多种序列组成的肽，或者含有选自QFASHFLPP(SEQ ID NO:133)、AAADQWKFQ(SEQ ID NO:134)、TFMCKVVNSM(SEQ ID NO:135)、IAICTMVYPS(SEQ ID NO:136)和VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ(SEQ ID NO:137)中的一种或多种序列的肽。
本文所用术语“生物样本”，是指生物来源的材料，其可以是体液或身体产物，例如，血液、血浆、尿液、唾液、脊髓液、粪便、汗液或呼吸物。生物样本还包括组织样本和细胞样本。
本文中，范围可被表示为从“大约”一个特定的值和/或到“大约”另一个特定的值。当表示这样的范围时，另一个实施方式包括从一个特定的值和/或到另一个特定的值。同样地，当值通过使用先行词“大约”表示为近似值时，将被理解的是，该特定的值形成另一个实施方式。其将进一步理解的是，范围的各端点，无论是与另一端点有关，还是独立于另一端点，都是显著的。还应该理解，在本文中公开了一些值，而每个值在此又被公开为除该值自身之外的“大约”该特定值。例如，如果公开了“10”这个值，那么“大约10”也被公开了。还应该理解，当公开一个值“小于或等于”某值时，如本领域技术人员适当地理解的，“大于或等于某值”以及在某些值之间的可能的范围也被公开。例如，如果公开了“10”这个值，则“小于或等于10”，以及“大于或等于10”也被披露。
通过针对CCL25和/或CCR9进行免疫来治疗或预防癌症
CCL25是CCR9趋化因子受体的配体。趋化因子和受体出现在癌症的转移和侵袭的调控中发挥作用。与正常组织相比，CCL25和CCR9在多种癌组织类型中都局部上调，包括卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、骨癌和胰腺癌。在患有这些癌症的患者的血清中，CCL25的水平也被增加。此外，可溶性CCL25趋化因子在体内和体外都增强癌细胞的增殖和迁移。
CCR9是G蛋白偶联受体(GPCRs)的趋化因子受体家族的成员，其会在癌细胞生存中具有不同的作用，假定使其免受化疗药物的作用。CCR9与CCL25的相互作用调节基质金属蛋白酶(MMP)的表达，并增强癌细胞的迁移和侵袭潜能。这表明CCR9-CCL25的相互作用有助于肿瘤细胞迁移和侵袭。因此，阻断此轴线有可能抑制癌细胞转移。
本申请的一个方面涉及一种通过针对CCL25和/或CCR9进行免疫来治疗或预防癌症的方法。所述方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码CCL25和/或CCR9的多核苷酸的CCL25和/或CCR9免疫原来诱导抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤，其中，所述癌症是胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、或肉瘤。
在另一个实施方式中，所述方法包括用有效量的下列物质使受试者免疫的步骤：(1)作为蛋白质、肽或编码CCL25和CCR9的多核苷酸的一种或多种CCL25和CCR9免疫原，和(2)作为蛋白质、肽或编码CXCL13和CXCR5的多核苷酸的一种或多种CXCL13和CXCR5免疫原，和/或作为蛋白质、肽或编码CXCL16和CXCR6的多核苷酸的一种或多种CXCL16和CXCR6免疫原。
抗CCL25抗体和抗CCR9抗体用于治疗或预防癌症的应用
本申请的另一个方面涉及抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体用于治疗或预防癌症的用途。所述用途包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或他们的组合，其中，所述癌症是胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。
在另一个实施方式中，所述受试者被诊断患有导致癌细胞中的CCL25和/或CCR9表达升高的癌症。这种癌症的实例包括，但不限于，胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤和生殖细胞肿瘤。在一个实施方式中，所述受试者被诊断患有脑癌。在另一个实施方式中，所述受试者被诊断患有骨癌。在另一个实施方式中，所述受试者被诊断患有垂体肿瘤。在又一个实施方式中，所述受试者被诊断患有卵巢癌。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括：确定来自受试者的组织中的CCL25和/或CCR9表达水平，以及如果检测到CCL25和/或CCR9的水平提高，则向受试者施用治疗有效量的抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或它们的组合。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括：确定来自受试者的组织中的CCL25和/或CCR9表达水平，以及如果检测到CCL25和/或CCR9的水平提高，则用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CCL25和/或CCR9免疫原来诱导抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗体以使受试者免疫。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括：确定来自受试者的组织中的CCL25和/或CCR9表达水平，以及如果检测到CCL25和/或CCR9的水平提高，则用有效量的下列物质使受试者免疫：(1)作为蛋白质、肽或编码基因的一种或多种CCL25和CCR9免疫原，和(2)作为蛋白质、肽或编码基因的一种或多种CXCL13和CXCR5免疫原，和/或作为蛋白质、肽或编码基因的一种或多种CXCL16和CXCR6免疫原。
本申请的一种优选的抗体是与人CCL25结合并且优选(部分或完全)阻断CCL25与受体(包括，但并不限于，CCR9)结合的能力的抗体。本申请的另一种优选的抗体是这样一种抗体，其与人CCR9结合并且优选(部分或完全)阻断在其细胞表面表达CCR9的趋化因子受体的细胞(如肿瘤或癌细胞)与配体(包括，但不限于，CCL25)结合的能力。本申请的又一种优选的抗体是这样一种抗体，其与人CCR9结合并且优选(部分或完全)阻断可溶的CCR9的趋化因子受体与配体(包括，但不限于，CCL25)结合的能力。
在一个实施方式中，抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体是单克隆抗体。在另一个实施方式中，抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体是人化抗体。在另一个实施方式中，抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体是人化的抗体片段。
在本申请的特定的实施例中，在使用治疗有效量的至少一种特异性针对另一种抗原的其他抗体对受试者进行治疗之前、同时或者之后，联合使用抗CCL25和/或抗CCR9抗体对受试者进行治疗。在一个实施方式中，所述另一种抗原是另一种趋化因子或趋化因子受体，如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1。
在另一个实施方式中，所述另一种抗原是与癌相关的趋化因子或趋化因子受体，并且选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7和CX3CR1。
在另一个实施方式中，所述另一种抗原是与黑素瘤相关的趋化因子或趋化因子受体，并且选自CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CX3CL1和CX3CR1。
在另一个实施方式中，所述另一种抗原是与白血病相关的趋化因子或趋化因子受体，并且选自CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7和CX3CR1。
其他的示例性抗原包括：分子，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如VIII因子，IX因子，组织因子和血管假性血友病因子；抗凝血因子，如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人体尿液或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；抑制缪勒管物质(Muellerian-inhibiting substance)；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3，神经营养因子-4，神经营养因子-5或神经营养因子-6(NT-3，NT 4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子，如神经生长因子-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如FGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；ErbB受体家族的成员，如EGF受体；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20和CD34；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如，M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白介素(ILs)，例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9和/或IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包封的部分；运输蛋白质；归巢受体；地址素；调节蛋白；αV/β3整联蛋白，包括其a或b亚单位，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；前列腺特异性抗原(PSA)；肿瘤相关抗原，如癌胚抗原(CEA)、CK2、CA125、TA90、HER2、HER3或HER4受体；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C；从典型凝集素或替代补体途径中的任一种蛋白质；和以上列出的任何多肽的片段。
可以使用公知的方法，例如，以推注或通过在一段时间内连续输注的静脉内施用，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、外用或吸入途径，将抗体施用到受试者。在某些实施例中，所述抗体被直接施用到肿瘤或癌症组织，包括在侵入操作过程中直接施用到瘤床。还可以将所述抗体放在针对受影响的组织的目标趋化因子施用的固体载体(如海绵或纱布)上。
本发明的抗体可以在通常接受的药学上可接受的载体中被施用。可接受的载体包括，但不限于，盐水，缓冲盐水，在盐水中的葡萄糖。固相载体、脂质体、纳米粒子、微粒、纳米微球或微球体，也可被用作用于施用抗体的载体。
抗体的适当剂量(“治疗有效量”)将取决于，例如，将要治疗的病，病的严重程度和病程，是否出于预防或治疗的目的施用抗体，以前的治疗，患者的临床病史及对抗体的反应，所用抗体的类型，以及主治医师的决定。所述抗体适于向患者一次或在一系列治疗下使用，并且可以在从诊断开始的任何时间向患者施用。所述抗体可以以单独治疗或者联合在治疗正被讨论的病中有用的其他药物或疗法进行施用。
作为一般的建议，无论通过一次或多次施用，所施用的抗体的治疗有效量将在约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围内。在一个特定的实施方式中，所施用的抗体的范围是从约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天，10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，100ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，以及10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。
在另一个实施方式中，施用抗体的剂量范围为每次注射1ng-10ng，每次注射10ng至100ng，每次注射100ng至1μg，每次注射1μg至10μg，每次注射10μg至100μg，每次注射100μg至1mg，每次注射1mg至10mg，每次注射10mg至100mg，以及每次注射100mg至1000mg。可以每天，每2天，每3天，每4天，每5天，每6天和每7天，或者每1周，每2周，每3周或每4周，注射抗体。
在另一个特定的实施方式中，所施用的抗体的剂量范围为从约1ng/kg至约100mg/kg。在又一个特定的实施方式中，所施用的抗体的范围为从约1ng/kg至约10ng/kg，约10ng/kg至约100ng/kg，约100ng/kg至约1μg/kg，约1μg/kg至约10μg/kg，约10μg/kg至约100μg/kg，约100μg/kg至约1mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，约10mg/kg至约100mg/kg，约0.5mg/kg至约30mg/kg，以及约1mg/kg至约15mg/kg。
在其他的特定的实施方式中，所施用的抗体的量为或者约为0.0006、0.001、0.003、0.006、0.01、0.03、0.06、0.1、0.3、0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600和1000mg/天。如预期的，所述剂量将取决于病、患者的大小、年龄和症状。
可以按照适当的或指示的推注或通过连续输注的单次剂量或者通过推注或通过连续输注的多倍剂量施用抗体。多倍剂量可被施用，例如，每天多次，每天一次，每2、3、4、5、6或7天，每周，每2，3，4，5或6周或每月。然而，其他的剂量方案可以是有用的。此疗法的进展是很容易用常规技术监测的。
在本申请的特定的实施方式中，可以向需要其作为唯一的治疗剂的受试者施用治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体。在特定的实施方式中，治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体杀死肿瘤或癌细胞或者促进肿瘤或癌细胞的凋亡。在另一特定的实施方式中，治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体抑制或防止肿瘤或癌的建立。在又一特定的实施方式中，治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体抑制或防止来自现存肿瘤或癌的肿瘤或癌细胞的迁移或转移。在再一特定的实施方式中，治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体抑制或防止肿瘤或癌细胞侵入到非癌组织中。
在本申请的特定的实施方式中，可以向需要其的患者施用治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体和一种或多种另外的治疗有效抗体，。所述一种或多种另外的治疗有效抗体可以针对CCL25和/或CCR9的另外的决定子、其他趋化因子、其他趋化因子受体、其他可溶性或细胞表面配体或受体，包括，但不限于，肿瘤或癌特异性抗原，病毒，细菌或寄生虫抗原，癌细胞的产物或凋亡残余物。可以在使用一种或多种另外的治疗有效抗体之前、同时和/或之后，施用抗CCL25和/或抗CCR9抗体。
在一个特定的实施方式中，就杀死肿瘤或癌而言，治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体增强了所述一种或多种另外的治疗有效抗体的有效性。在又一个特定的实施方式中，治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体减少了用于杀死肿瘤或癌细胞所需的所述一种或多种另外的治疗有效抗体的量。
在再一个特定的实施方式中，治疗有效量的抗-CCL25和/或抗CCR9抗体抑制或防止来自建立的肿瘤或癌的肿瘤或癌细胞的迁移或转移，提高所述一种或多种另外的治疗有效抗体在杀死肿瘤或癌细胞方面的局部有效性。在又一个特定的实施方式中，治疗有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗体抑制或防止肿瘤或癌细胞侵入到非癌组织中，提高所述一种或多种另外的治疗有效抗体在杀死肿瘤或癌细胞方面的局部有效性。
在另一个实施方式中，抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体是与细胞毒性剂结合的抗体。在另一个实施方式中，抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体与另一种抗癌剂(如化疗药物)一起施用。
本申请的另一个方面涉及一种抑制趋化因子CCL25与含有其受体的细胞的相互作用的方法。在一个实施方式中，所述方法包括使细胞接触有效量的抗体或其功能片段，该抗体或其功能片段与哺乳动物CCL25或CCL25的一部分结合。在另一个实施方式中，所述方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CCL25免疫原来诱导抑制CCL25的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。
本申请的另一个方面涉及一种抑制含有CCR9的细胞与其配体的相互作用的方法，所述方法包括使细胞接触有效量的抗体或其功能片段，该抗体或其功能片段与哺乳动物CCR9或CCR9的一部分结合。
在另一个实施方式中，所述治疗癌症的方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的在癌或恶性细胞中表达抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或它们的组合的表达载体。在另一个实施方式中，所述治疗癌症的方法包括用有效量的CCL25和/或CCR9免疫原来诱导宿主产生抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。
所述表达载体可以是能够将编码抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体的核苷酸递送到靶细胞中并且在靶细胞中表达抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体的任何载体。在另一个实施方式中，所述表达载体能够将编码抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体的核苷酸递送到靶细胞中以诱导宿主产生抗CXCL13和/或CXCR5抗体。表达载体的实例包括病毒载体和非病毒载体。表达载体的实例包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体包括，但不限于，逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺伴随病毒载体，以及其他大容量的病毒载体，如疱疹病毒和牛痘病毒。还包括具有这些病毒的使其适合于用作表达载体的性质的任何病毒家族。
逆转录病毒载体
逆转录病毒是一种动物病毒，属于逆转录病毒科的病毒家族，包括任何类型、亚科、属或嗜亲性。在美国专利第4,868,116号和第4,980,286号；PCT申请WO 90/02806和WO 89/07136；以及Mulligan(Science 260:926-932(1993))中描述了使用逆转录病毒载体用于基因治疗的方法的实例，在此将上述文献教导的内容通过引用的方式并入本文。
腺病毒载体
重组腺病毒已被证明在直接在体内递送到气道上皮细胞、肝细胞、血管内皮、CNS薄壁组织和许多其他组织部位之后实现高效率的基因转移。重组腺病毒通过结合到特异细胞表面受体而实现基因转导，在此之后，病毒通过受体介导的内吞作用以与野生型或复制缺陷型腺病毒相同的方式被纳入。
病毒载体可为基于其中一种或多种病毒基因已被移除了的腺病毒的病毒载体，并且这些病毒体在补体细胞系(如人293细胞系)中被产生。在一个实施方式中，从腺病毒载体中移除E1基因。在另一个实施方式中，从腺病毒载体中移除E1和E3基因。在另一个实施方式中，从腺病毒载体中移除E1和E4基因。在另一个实施方式中，所述腺病毒载体是无肠腺病毒载体。
腺相关病毒载体
另一种类型的病毒载体基于腺相关病毒(AAV)。这种缺陷型细小病毒是一种优选的载体，这是因为它可以感染许多细胞类型并且对人类是不致病的。AAV类型载体能够运送约4-5kb，并且已知野生型AAV稳定地插入到第19号染色体。包含这种位点特异性整合性质的载体是优选的。这种类型的载体的特别优选的实施方式是由Avigen,San Francisco,CA制造的P4.1C载体，其可包含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)和/或标记基因(如编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因)。
在另一种类型的AAV病毒中，AAV包含一对反向末端重复(ITRs)，其攻击含有与异源基因可操作地连接的指导细胞特异性表达的启动子的至少一个盒的侧翼。上下文中的异源是指不是AAV或B19细小病毒与生俱来的任何核苷酸序列或基因。
典型的AAV和B19编码区已被删除了，从而得到安全、无细胞毒性的载体。AAV ITRs或其修饰物赋予感染性和位点特异性整合，但没有细胞毒性，而启动子指导细胞特异性表达。
大型有效负载病毒载体
大型人类疱疹病毒的分子遗传实验提供了一种方法，由此大型的异源DNA片段可以在允许使用疱疹病毒感染的细胞中被克隆、传播和建立(Sun et al.,Nature genetics 8:33-41,1994；Cotter and Robertson,Curr Opin Mol Ther 5:633-644,1999)。这些大型DNA病毒(单纯疱疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV)，具有将>150kb的人类异源DNA片段递送到特定细胞的潜力。EBV重组体能够在受感染的B细胞中保持大量的DNA片段作为游离基因DNA。单个克隆携带的高达330kb的人基因组插入物表现出遗传稳定。这些游离基因的维持需要特定的EBV核内蛋白、EBNA1、其在使用EBV感染过程中以组成型表达。此外，这些载体可用于转染，其中，在体外可以瞬时产生大量的蛋白质。还可以使用疱疹病毒扩增子系统包装>220kb的DNA片段以及感染能够稳定地保持DNA作为游离基因的细胞。其它有用的系统包括，例如，复制和宿主限制的非复制痘苗病毒载体。
非病毒载体包括质粒表达载体。质粒载体通常包括可以向其中插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。
在病毒和非病毒表达载体中，编码一个抗体或多个抗体的多核苷酸通常被设置在接近并朝向适当的转录控制序列(启动子，以及任选地，一种或多种增强子)以指导mRNA合成。也就是说，目的多核苷酸序列可操作地连接到适当的转录控制序列。这种启动子的实例包括：病毒启动子，如CMV、LTR或SV40启动子的立即早期启动子，杆状病毒的多角体启动子(polyhedron promoter)，大肠杆菌lac或trp启动子，T7噬菌体和λPL启动子，以及已知在真核细胞或它们的病毒中控制基因的表达的其他启动子。启动子可以是组织特异性启动子。
表达载体通常也包含用于翻译起始的核糖体结合位点，和转录终止子。载体任选包括用于扩大表达的适当序列。此外，表达载体任选地包含一种或多种可选择标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
表达载体还可包括另外的表达元件，例如，用于提高翻译效率。这些信号可以包括，例如，ATG起始密码子和相邻的序列。在某些情况下，例如，将翻译起始密码子和相关的序列元件与目的多核苷酸序列(例如，天然的起始密码子)一同插入到适当的表达载体中。在这种情况下，另外的翻译控制信号是不需要的。然而，在只插入多肽编码序列或其部分的情况下，外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子，要被提供。将起始密码子放在正确的读框中以确保目的多核苷酸序列的翻译。外源转录元件和起始密码子可以是不同来源的，包括天然和合成的。如需要，可以通过包含适于所用的细胞系统的增强子来进一步提高表达效率。
在一个实施方式中，所述表达载体包含诱导型或可调节的表达系统。可调节的表达系统的实例的简要说明如下：
蜕皮激素系统。蜕皮激素系统是基于在果蝇(Drosophila)中发现的蜕皮诱导系统，但是为了在哺乳动物细胞中可诱导地表达而进行了改造。该系统使用果蝇甾类激素蜕皮激素的类似物(muristerone A)通过异二聚核受体激活目的基因的表达。已报道表达水平超过基础水平200倍，同时对哺乳动物细胞生理机能没有影响。
孕酮系统。通常孕酮受体被刺激与特异性DNA序列结合并且通过与其激素配体相互作用而激活转录。相反，孕酮拮抗剂米非司酮(RU486)能够阻断激素诱导的核转运和随后的DNA结合。已经产生了能够被刺激经由与RU486的相互作用而结合的孕酮受体的突变体形式。为了产生特定的、可调节的转录因子，已将孕酮受体的RU486结合域融合到酵母转录因子GAL4的DNA结合域和HSV蛋白VP16的激活域。在没有RU486的情况下，嵌合因子无活性。然而，加入激素，诱导嵌合蛋白的构象变化，而这种变化允许结合到GAL4结合位点以及由含有GAL4结合位点的启动子的转录激活。
雷帕霉素系统。免疫抑制剂(如FK506和雷帕霉素)通过与特异的细胞蛋白质结合并促进它们的二聚而起作用。例如，雷帕霉素与FK506结合蛋白(FKBP)的结合导致其与另一种雷帕霉素结合蛋白FRAP的异二聚化，其可通过药物的移除而逆转。通过加入药物使两种蛋白质集合在一起的能力使许多生物过程(包括转录)的调节成为可能。嵌合的DNA结合域已被融合到FKBP，FKBP能够使融合蛋白结合到特异性DNA结合序列。转录激活域也已被融合到FRAP。当这两种融合蛋白在相同细胞中共表达时，可以通过由加入雷帕霉素介导的异二聚化来形成全功能的转录因子。然后二聚嵌合转录因子可以结合至包含合成DNA结合序列的拷贝的合成启动子序列。该系统已被成功地整合到腺病毒和AAV载体中。
抑制CCL25或CCR9的表达或活性的试剂用于治疗或预防癌症的用途
本申请的另一个方面涉及抑制CCL25或CCR9的表达或活性的试剂用于治疗或预防癌症的用途。在另一个实施方式中，所述用途包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的表达下列试剂的表达载体：(1)抑制CCL25和/或CCR9的表达的试剂、或(2)抑制CCL25和CCR9间的相互作用的试剂、或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的试剂。在一个实施方式中，CCL25和CCR9的生物活性包括CCL25和CCR9间的相互作用。
在另一个实施方式中，所述受试者被诊断患有导致癌细胞中的CCL25和/或CCR9表达升高的癌症。这种癌症的实例包括，但不限于，胚细胞瘤，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤，生殖细胞瘤，以及癌，例如，卵巢癌，阴道癌，子宫颈癌，子宫癌，前列腺癌，肛门癌，直肠癌，结肠癌，胃癌，胰腺癌，胰岛细胞瘤，腺癌，腺鳞癌，神经内分泌肿瘤，乳腺癌，肺癌，食道癌，口腔癌，脑癌，髓母细胞瘤，神经外胚层瘤，神经胶质瘤，垂体癌和骨癌。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括确定来自受试者的组织中的CCL25和/或CCR9表达的水平，以及只要检测到组织中CCL25和/或CCR9的水平提高，则向受试者施用所述试剂。
在一个实施方式中，所述表达载体是病毒载体。在另一个实施方式中，所述表达载体是非病毒载体。在另一个实施方式中，所述表达载体能够将编码CCL25和/或CCR9的核苷酸递送到靶细胞中以诱导宿主产生抗CCL25和/或CCR9抗体。
在另一个实施方式中，所述试剂是抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或它们的组合。
在又一个实施方式中，所述试剂是功能性核酸。功能性核酸是具有特定功能(如结合靶分子或催化特定反应)的核酸分子。该功能性核酸分子可以担当靶分子具有的特定活性的抑制剂。功能性核酸分子可以与任何大分子(如DNA、RNA和多肽)发生相互作用。因此，功能性核酸能够与CCL25或CCR9的mRNA或基因组DNA发生相互作用以抑制CCL25或CCR9蛋白的表达或相互作用从而抑制活性。通常，基于靶分子与功能性核酸分子之间的序列同源性，将功能性核酸设计成与其他核酸发生相互作用。在其他情况下，功能性核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于允许发生特异性识别的三级结构的形成。功能性核酸分子的实例包括siRNA，反义分子，适体，核酶，形成三联体的分子，和外在引导序列。
siRNA涉及RNA干扰(RNAi)，其包括两步机制：起始步骤和效应物步骤。在第一步骤中，所加入的双链(ds)RNA(siRNA)被加工成小片段，如21-23-核苷酸的‘指导序列’。RNA扩增发生在整个动物中。然后通常情况下，指导RNA可被纳入形成蛋白质RNA复合物，其能够降解RNA、核酸酶复合物，其已被称为RNA诱导的敲减复合物(RISC)。该RISC复合物在第二效应物步骤中起作用以破坏经由碱基配对相互作用由指导RNA识别的mRNA。RNAi涉及通过将双链RNA引入到细胞中，其触发引起靶RNA降解的事件。RNAi是转录后基因敲减的一种形式。除本文所披露的siRNA之外，还披露了能够在RNAi中起作用的RNA发夹。对于制造和使用RNAi分子的说明，参见，例如，Hammond et al.,Nature Rev Gen 2:110-119(2001)；Sharp,Genes Dev 15:485-490(2001),Waterhouse et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(23):13959-13964(1998)，其公开的全部内容在此通过引用的方式并入本文并且至少构成与递送和制造RNAi分子相关的材料。
RNAi已被证明在许多类型的细胞(包括哺乳动物细胞)中发挥作用。对于在哺乳动物细胞中的工作，优选的是，将在RISC复合物中被用作靶向序列的RNA分子较短。例如，长度小于或等于50或40或30或29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。相对于将要被裂解的靶RNA，这些RNA分子也可以在3'或5'端上具有悬突。这些悬突的长度可为至少或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个核苷酸。
反义分子被设计成通过规范或非规范的碱基配对而与靶核酸分子发生相互作用。反义分子与靶分子之间的相互作用被设计成通过例如RNA酶H介导的RNA-DNA杂合体降解来促进靶分子的破坏。或者，反义分子被设计成中断正常情况下会在靶分子上发生的加工功能，如转录或复制。反义分子可以基于靶分子的序列来设计。存在许多通过发现靶分子的最易接近区来优化反义效率的方法。示例性的方法是使用DMS和DEPC的体外筛选实验和DNA修饰研究。优选的是，反义分子结合靶分子的解离常数(kd)小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12。可以在下面的美国专利的非限定性列表中找到有助于反义分子的设计和使用的方法和技术的具有代表性的样本：5,135,917，5,994,320，6,046,319，和6,057,437，其公开的全部内容在此通过引用的方式并入本文。
适体是(优选以特定的方式)与靶分子相互作用的分子。典型地，适体是长度范围在15-50个碱基的小核酸，其折叠成定义的二级和三级结构，如茎环或G-四联体。适体能够结合趋化因子并阻断它的功能(参见，例如，Marro et al.,Biochem Biophys Res Commun.2006Oct 13；349:270-6)。在与靶分子的kd小于10-12M的情况下，适体可以非常紧密地结合。优选的是，适体结合靶分子的kd小于10-6、10-8、10-10或10-12。适体可以以非常高度的特异性结合靶分子。例如，适体已被分离，在靶分子与在分子上只有单一位置处不同的另一分子之间的亲合力具有大于10000倍的差异(美国专利5,543,293)。优选的是，适体与靶分子的kd比与背景结合分子的kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。可以在下面的美国专利的非限定性列表中找到如何制造和使用适体结合多种不同的靶分子的代表性实例：5,476,766、5,861,254、6,030,776和6,051,698，其公开的全部内容在此通过引用的方式并入本文。
核酶是能够催化(分子内或分子间)化学反应的核酸分子。因此核酶是催化的核酸。优选的是，核酶催化分子间反应。有很多不同类型的核酶，其基于在自然系统中发现的核酶，例如，如锤头核酶(参见，例如，美国专利：5,334,711和5,861,288，WO 9858058和WO 9718312)、发夹结构核酶(参见，例如，美国专利：5,631,115和6,022,962)以及四膜虫属核酶(参见，例如，美国专利：5,595,873和5,652,107)，催化核酸酶或核酸聚合酶型反应。也有一些在自然系统中没有被发现的核酶，但是其已被重新设计成催化特定反应的(参见，例如，美国专利：5,580,967和5,910,408)。优选的核酶切割RNA或DNA底物，且更优选地切割RNA底物。核酶通常通过对靶底物的识别和结合及随后切割而切割核酸底物。该识别往往是主要基于规范或不规范的碱基对相互作用。这种性质是核酶成为靶向特异性切割核酸的极好的候选者，因为靶底物的识别是基于靶底物序列。可以在美国专利：5,646,042、5,869,253、5,989,906和6,017,756中找到如何制造和使用核酶催化各种不同的反应的代表性实例，其公开的全部内容在此通过引用的方式并入本文。
形成三联体的功能性核酸分子是能够与双链或单链核酸相互作用的分子。当三联体分子与靶区域发生相互作用时，形成称为三联体的结构，其中，根据Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对，三链DNA形成复合物。三联体分子是优选的，这是因为它们能够以高亲和性和特异性结合靶区域。优选的是，形成三联体的分子结合靶分子的kd小于10-6、10-8、10-10或10-12。可以在美国专利：5,176,996、5,683,874、5,874,566和5,962,426中找到如何制造和使用形成三联体的分子以结合各种不同的靶分子，其公开的全部内容在此通过引用的方式并入本文。
外在引导序列(EGS)是结合形成复合物的靶核酸分子的分子，并且该复合物被RNA酶P识别，RNA酶P切割靶分子。EGS可被设计成特异性靶向所选的RNA分子。RNA酶P有助于在细胞内加工转移RNA(tRNA)。通过使用引起靶RNA:EGS复合物模拟天然tRNA底物的EGS，细菌RNA酶P可被募集来切割实际上任何RNA序列(参见，例如，Yale的WO 92/03566,和Forster and Altman,Science 238:407-409(1990))。
同样地，可以利用真核EGS/RNA酶P定向切割RNA来在真核细胞中切割所需的目标(Yuan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:8006-8010(1992)；Yale的WO 93/22434by；Yale的WO 95/24489by；Yuan and Altman,EMBO J 14:159-168(1995),和Carrara et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:2627-2631(1995))。可以在下面的美国专利的非限定性列表中找到如何制造和使用EGS分子来促进各种不同的靶分子的切割：5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162，其公开的全部内容在此通过引用的方式并入本文。
预防或抑制具有CCL25和/或CCR9表达升高的癌细胞的迁移或转移的方法
本申请的另一个方面涉及一种在受试者中预防或抑制具有CCL25和/或CCR9表达升高的癌细胞的迁移或转移的方法。
在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗CCL25抗体、或抗CCR9抗体、或它们的组合的步骤。
在另一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用在所述受试者中表达抗CCL25抗体、或抗CCR9抗体、或它们的组合的表达载体的步骤。
在另一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用表达能够抑制CCL25或CCR9的表达、或抑制CCL25或CCR9的生物活性、或抑制CCL25和CCR9间的相互作用的试剂的表达载体。在另一个实施方式中，所述表达载体能够将编码CCL25和/或CCR9的核苷酸递送到靶细胞中以诱导宿主产生抗CCL25和/或CCR9抗体。
可以使用本领域中众所周知的方法(例如，免疫染色或定量PCR)确定在癌细胞中的CCL25和/或CCR9的表达。已知过表达CCL25和/或CCR9的癌细胞包括，但不限于，黑素瘤细胞和上皮瘤细胞。癌的实例包括，但不限于，卵巢癌，阴道癌，子宫颈癌，子宫癌，前列腺癌，肛门癌，直肠癌，结肠癌，胃癌，胰腺癌，胰岛细胞瘤，腺癌，腺鳞癌，神经内分泌肿瘤，乳腺癌，肺癌，食道癌，口腔癌，脑癌，髓母细胞瘤，神经外胚层瘤，神经胶质瘤，垂体癌，和骨癌。
在一个实施方式中，所述癌细胞是脑癌细胞。在另一个实施方式中，所述癌细胞是骨癌细胞。在另一个实施方式中，所述癌细胞是垂体癌细胞。在又一个实施方式中，所述癌细胞是卵巢癌细胞。
提高化疗效果的方法
本申请的另一个方面涉及一种提高化疗效果的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用有效量的抗CCL25抗体、或抗CCR9抗体、或它们的组合。
在另一个实施方式中，所述方法包括向症在进行化疗以治疗癌症的受试者施用有效量的表达抗CCL25抗体、或抗CCR9抗体、或它们的组合的表达载体。
在另一个实施方式中，所述方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用表达能够抑制CCL25或CCR9的表达、或抑制CCL25或CCR9的生物活性、或抑制CCL25和CCR9间的相互作用的试剂的表达载体。在另一个实施方式中，所述表达载体能够将编码CCL25和/或CCR9的核苷酸递送到靶细胞中以诱导宿主产生抗CCL25和/或CCR9抗体。
在一个实施方式中，所述受试者正在进行化疗以治疗胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞肿瘤。在另一个实施方式中，所述受试者正在进行化疗以治疗脑癌。在另一个实施方式中，所述受试者正在进行化疗以治疗骨癌。在另一个实施方式中，所述受试者正在进行化疗以治疗垂体癌。在还一个实施方式中，所述受试者正在进行化疗以治疗卵巢癌。
治疗或预防癌症的组合物和试剂盒
本申请的另一个方面涉及用于治疗或预防癌症的组合物和试剂盒。在一个实施方式中，所述组合物包括：(1)抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或它们的组合，和(2)药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，所述组合物包括：(1)表达载体，其携带用于抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或它们的组合的编码序列，和(2)药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，所述组合物包括：(1)表达载体，其携带用于抑制CCL25或CCR9的表达、抑制CCL25或CCR9的生物活性或抑制CCL25和CCR9间的相互作用的试剂的编码序列，和(2)药学上可接受的载体。
在一个实施方式中，所述组合物和试剂盒用于治疗或预防母细胞瘤，癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤或生殖细胞瘤。在具体的实施方式中，所述癌选自卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌，胰腺癌、胰岛细胞瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脑癌、髓母细胞瘤、神经外胚层瘤、神经胶质瘤、垂体癌和骨癌中。
本申请的组合物可以包含单一类型的抗体(如单独的抗CCL25或抗CCR9抗体)或者同时包含两种类型的抗体。所述组合物还可包含治疗有效量的特异性针对如正在被治疗的特定适应症(优选那些不会彼此产生不利影响的互补活动的适应症)所需的如上所述的一种或多种另外的抗原的抗体。例如，在正被治疗的癌是卵巢癌的情况下，可取的是，制备在单一制剂中含有抗CCL25和/或抗CCR9抗体以及一种或多种另外的抗癌决定子抗体(如抗CEA、抗CA125或抗TA90)的治疗制剂。在本申请的一些实施方式中，治疗性抗体可以与化疗剂或细胞毒性剂组合使用。在本申请的其它实施方式中，治疗性抗体可以与抗炎剂或血栓溶解剂组合使用。在组合中，这些药剂以对预期目的有效的量适当地存在。
本文所用文字“药学上可接受的载体”意欲包括与药物施用可配合的任何及全部溶剂、增溶剂、填料、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱、缓冲剂、润滑剂、控制释放赋形物、稀释剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗吸收延迟剂等。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域众所周知的。会考虑任何常规介质或试剂在组合物中的使用，除非其与活性化合物不相容。还可以向组合物中加入补充的试剂。在某些实施方式中，药学上可接受的载体包括血清白蛋白。
将本申请的药物组合物配制成与其预定的施用途径具有生物相容性。施用途径的实例包括肠胃外，例如，鞘内，动脉内，静脉内，皮内，皮下，经口，经皮(局部)以及经粘膜施用。在某些实施方式中，将所述药物组合物直接施用到肿瘤组织中。
用于肠胃外、真皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包括下列成分：无菌稀释剂，例如，注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂，例如，苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如，抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，例如，乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如，醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如，氯化钠或葡萄糖。可以使用酸或碱(例如，盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散剂以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。就静脉内施用而言，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，可注射的组合物应当是无菌的并且应当为能达到易于溶液注射程度的流体。其在制造和贮藏条件下必须是稳定的并且必须针对如细菌和真菌的微生物污染行为进行防腐。载体可为溶剂或分散介质，例如，包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂的包衣、通过在分散的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)可以实现微生物行为的防止。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)和氯化钠。通过使组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝或凝胶)可以使可注射的组合物延长吸收。
在具有上述列举的成分的一种或组合的适当的溶剂中加入所需量的活性化合物(例如，抗CCL25或抗CCR9抗体)来制备无菌的可注射溶液，根据需要，之后再过滤灭菌。通常，可以通过将活性化合物加入到包含基础分散介质和所需的其他来自上述列举的那些成分中的成分的无菌载体中来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这样可以得到活性成分加任何附加的来自其预先过滤灭菌溶液中的所需成分的粉末。
经口的组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装在凝胶胶囊中或者压制成片剂。为了经口治疗施用，可以将活性化合物与赋形剂结合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。也可以使用用作嗽口水的流体载体来制备经口的组合物，其中，流体载体中化合物经口施用、发出嗖嗖声、咳出或吞咽。可以包含药学可配合的结合剂和/或辅剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以包含任何下列成分或相似性质的化合物：粘合剂，例如，微晶纤维素、黄蓍树胶或凝胶；赋形剂，例如，淀粉或乳糖；崩解剂，例如，藻酸、淀粉羟乙酸钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如，硬脂酸镁或Stertes；助流剂，例如，胶体二氧化硅；甜味剂，例如，蔗糖或糖精；或者调味剂，例如，薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
为了通过吸入施用，将化合物以来自加压容器或者包含适合的推进剂(例如，如二氧化碳的气体)的分配器或喷雾器中的喷雾剂的形式递送。
也可以通过经粘膜或经皮方式进行全身施用。就经粘膜或经皮施用而言，在制剂中使用适合透入将要穿过的屏障的渗透剂。这种渗透剂是本领域中通常已知的，并且包括，例如，就经粘膜施用而言，清洁剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。通过使用鼻腔喷雾或栓剂可以实现经粘膜施用。就经皮施用而言，将药物组合物配制成本领域中所熟知的软膏剂、油膏剂、凝胶或乳膏剂。
在某些实施方式中，药物组合物被配制成缓释或控释活性成分的。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。对本领域技术人员来说，这些制剂的制备方法将是明显的。还可以商购材料，例如，从Alza公司和Nova Pharmaceuticals,Inc。脂质体混悬液(包括靶向受感染细胞的脂质体，其携带有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可用作药学上可接受的载体。根据本领域技术人员已知的方法可以制备这些，例如，按照美国专利第4,522,811中所述。
为了易于施用和剂量统一，制成以剂量单位形式的经口或肠胃外的组合物是特别有利的。本文中所用的剂量单位形式包括适合作为要被治疗的受试者的单位剂量的物理上的离散单位；每个单位包含预定量的计算与所需药物载体结合产生所需治疗效果的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特性和所要实现的特定治疗效果以及在合成这种用于个体治疗的活性化合物的领域中的固有限制因素规定，或者直接取决于活性化合物的独特特性和所要实现的特定治疗效果以及在合成这种用于个体治疗的活性化合物的领域中的固有限制因素。
在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法可以确定这种化合物的毒性和治疗效能，例如，确定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且它可以表示为LD50/ED50比。优选具有大的治疗指数的化合物。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但是为了使对未受感染细胞的潜在损害减至最小并由此减少副作用，应当注意设计使这种化合物靶向受侵袭组织的部位的递送系统。
从细胞培养测定和动物研究中得到的数据可以用于配制在人体中使用的剂量的范围。这种化合物的剂量优选处于包括具有很少毒性或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。依据所利用的剂量形式和所采用的施用途径，所述剂量在该范围内可以变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，可以从细胞培养测定中最初估计治疗的有效剂量。在动物模型中配制剂量以得到包括在细胞培养中测定的IC50(即达到症状的半最大抑制的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用于更加精确地确定人体内的有用剂量。在某些实施方式中，单一剂量包含0.01μg至50mg的抗CCL25或抗CCR9抗体。所述药物组合物可以与用于施用的说明书一起被包含在容器、包装或分配器中。
本申请通过如下实施例进一步进行解释，其不应解释为对本申请的限制。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开专利申请以及图和表的内容在此以引用方式并入本文。
实施例1：各种癌中的CCL25和CCR9表达和活性的体外分析
如在图1中所示，乳腺癌组织表达CCL25。用同种型对照或抗CCL25抗体对乳腺癌组织染色。红紫色显示CCL25染色。具有40X物镜的Aperio ScanScope CS系统捕获数字图像。乳腺癌的典型实例显示了CCL25的免疫强度。
图2证实了CCL25抑制了顺铂诱导的乳腺癌细胞系生长的减少。随着增大顺铂浓度，用0或100ng/ml CCL25加同种型对照或抗CCR9Ab培养MDA-MB-231细胞24小时。通过BrdU合并测定细胞增殖，并且测定重复3次且平行进行三份。星号指示了在CCL25处理的和未处理的BrCa细胞之间的统计学显著性差异(p<0.01)。
图3A-B显示了CCL25保护乳腺癌细胞免受顺铂诱导的细胞凋亡。仅用5mg/ml顺铂或者用0或100ng/ml CCL25加1mg/ml抗人CCR9或同种型对照培养MDA-MB-231细胞24小时(A)。收获细胞并且用锚定蛋白(annexin V)和碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色。通过染色的细胞的流式细胞术分析区分凋亡(锚定蛋白阳性)细胞和生活(无荧光)细胞和坏死(PI阳性)细胞。星号指示在CCL25处理的和未处理的乳腺癌细胞之间的统计学显著性差异(p<0.01)。用5mg/ml顺铂或用0或100ng/ml CCL25加1mg/ml的抗人CCR9或同种型对照Ab培养MDA-MB-231细胞系24小时(B)。使用末端脱氧核苷酰酶酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)法进行凋亡细胞的检测。用标准荧光过滤盒(520±20nm)，凋亡细胞显示核绿色荧光。星号指示在顺铂CCL25处理的和未处理的乳腺癌细胞系之间的统计学显著性差异(p<0.01)。
图4A-B显示了在乳腺癌细胞系中CCL25-CCR9相互作用的PI3K和Akt活化。在用CCL25、顺铂和特定的激酶抑制剂(渥曼青霉素和PF-573,228)处理之后，测试MDA-MB-231细胞的活化PI3K和Akt的能力。在顺铂和激酶抑制剂存在下，在CCL25刺激之前(0分钟)或者之后(5或10分钟)，用基于快速活化细胞的ELISA定量了原位总的和磷酸化的PI3K和Akt水平。在平行进行三份的3个独立实验中提供活化(磷酸化)的PI3K(A)或Akt(B)与总的PI3K(A)或Akt(B)的比例±SEM。星号指示在未处理的和CCL25处理的细胞和CCL25+顺铂处理的细胞之间的统计学差异。
图5A-B显示了乳腺癌细胞系CCL25处理后的GSK-3β和FKHR磷酸化作用。在用CCL25、顺铂和特定的激酶抑制剂(渥曼青霉素和PF-573,228)处理之后，测试MDA-MB-231细胞的使GSK-3β和FKHR磷酸化的能力。在顺铂和激酶抑制剂存在下，在CCL25刺激之前(0分钟)或者之后(5或10分钟)，用基于快速活化细胞的ELISA定量了原位总的和磷酸化的GSK-3β和FKHR水平。在平行进行三份的3个独立实验中，以±SE的方式提供磷酸化的GSK-3β(A)或FKHR(B)与总的GSK-3β(A)或FKHR(B)的比值。星号指示在未处理的和CCL25处理的细胞和CCL25+顺铂处理的细胞之间的统计学差异(p<0.01)。
图6显示了卵巢癌组织CCR9和CCL25的表达。用同种型对照或者抗CCR9和CCL25抗体对源自非肿瘤的(n＝8)、浆液性腺癌(n＝9)、浆液性乳突状囊腺瘤(n＝1)、子宫内膜样腺癌(n＝5)、粘液腺癌(n＝2)、囊腺瘤(n＝3)、交界性粘液腺癌(n＝1)、透明细胞癌(n＝5)、粒层细胞瘤(n＝3)、无性细胞瘤(n＝3)、移行细胞癌(n＝3)、布伦纳瘤(n＝1)、卵黄囊瘤(n＝4)、腺癌(n＝1)和纤维瘤(n＝2)的卵巢癌组织进行染色。棕(DAB)色显示了CCR9染色并且红紫色显示了CCL25。用具有40X物镜的Aperio ScanScope CS系统捕获各玻片的数字图像。典型的实例显示了CCR9和CCL25的免疫强度。
图7A-B显示卵巢癌组织的CCL25表达的分析。用改进的箱线图(box plot)(A)分析和呈现CCL25表达。在箱线中，下线、中线和上线分别表示第一四分位数(Q1)、中值(Q2)和第三四分位数(Q3)。上和下触须线表示中值±1.5(Q3-Q1)。在下格中指示与非肿瘤的显著性差异。表(B)显示非肿瘤组织(NN)与浆液性腺癌(SA)、子宫内膜样腺癌(EC)、粘液腺癌(MA)、囊腺瘤(C)、交界性粘液腺癌(MBA)、透明细胞癌(CCC)、粒层细胞瘤(GCT)、无性细胞瘤(D)、移行细胞癌(TCC)、布伦纳瘤(BT)、卵黄囊瘤(YST)、腺癌(A)和纤维瘤(F)间的各p值或显著性差异。
图8A-B显示卵巢癌组织的CCR9表达的分析。用改进的箱线图(box plot)(A)分析和呈现CCR9表达。在箱线中，下线、中线和上线分别表示第一四分位数(Q1)、中值(Q2)和第三四分位数(Q3)。上和下触须线表示中值±1.5(Q3-Q1)。在下格中指示与非肿瘤的显著性差异。表(B)显示非肿瘤组织(NN)与浆液性腺癌(SA)、子宫内膜样腺癌(EC)、粘液腺癌(MA)、囊腺瘤(C)、交界性粘液腺癌(MBA)、透明细胞癌(CCC)、粒层细胞瘤(GCT)、无性细胞瘤(D)、移行细胞癌(TCC)、布伦纳瘤(BT)、卵黄囊瘤(YST)、腺癌(A)和纤维瘤(F)之间的各p值或显著性差异。
图9A-B显示卵巢癌细胞系的CCR9和CCL25表达。将卵巢癌细胞用荧光素(FITC)结合的抗CCR9或FITC结合的同种型对照抗体染色并通过FACS分析(A)。卵巢癌细胞用FITC结合的抗CCR9染色，细胞内CCL25用藻红蛋白(PE)结合的抗CCL25抗体染色，以及细胞核用Draq-5染色(B)。归并数据(merged data)显示CCR9在表面表达而CCL25在核中表达。
图10A-B显示卵巢癌细胞的缺氧调节的CCR9mRNA和表面蛋白表达。从处于含氧量正常的条件和含氧量低的条件下的SKOV-3细胞系中分离总RNA，或者从正常的初级卵巢组织中分离总RNA。CCR9mRNA表达的定量RT-PCR分析平行进行三份。转录物的拷贝数被表示为相对于18S rRNA+SE的实际拷贝数(A)。将处于常氧和缺氧的SKOV-3细胞用PE结合的同种型对照抗体(Ab)(实心直方图)或PE结合的抗CCR9单克隆Ab(空心直方图)染色并且通过流式细胞计量术定量(B)。显示PE阳性细胞的平均荧光强度。符号表示在正常组织或同种型对照与OvCa细胞(@)之间或者在含氧量正常的细胞和含氧量低的细胞之间的CCR9表达的统计学上的显著性(p<0.01)差异(*)。
图11A-B显示SKOV-3细胞缺氧介导的和CCL25介导的迁移和侵入。测试SKOV-3细胞的向趋化梯度的CCL25迁移的能力(A)。在迁移实验过程中，在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，使用100ng/ml的CCL25，将细胞与1.0μg/ml小鼠抗CCR9抗体(Ab)或同种型对照Ab共培养。此外，测试SKOV-3细胞的在含氧量低的条件或含氧量正常的条件下应答100ng/ml的CCL25而侵入或转移穿过MatrigelTM基质的能力(B)。在侵入实验过程中，在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，使用使用100ng/ml的CCL25，将细胞与1.0μg/ml的抗CCR9的单克隆抗体共培养。用符号显示迁移或侵入的细胞数(+SE)，该符号表示在CCL25处理的和未处理的含氧量正常的细胞(#)、CCL25处理的和未处理的含氧量低的细胞(@)、或同样地处理的含氧量正常的和含氧量低的细胞(*)之间的显著性(p<0.01)差异。
图12A-B显示SKOV-3细胞的CCL25诱导的胶原酶表达。测试细胞表达胶原酶(MMP-1,MMP-8,和MMP-13)mRNA和活性蛋白质的能力。在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，将SKOV-3细胞单独、使用100ng/ml的CCL25+1μg/ml的同种型对照抗体(Ab)、或者使用CCL25+1μg/ml的小鼠抗CCR9Ab来培养24小时。分离总RNA，并对胶原酶的mRNA表达进行定量RT-PCR分析，并且转录物拷贝数被表示为相对于18S rRNA的实际拷贝数(A)。在条件培养基中通过Fluorokine和Biotrak实验定量活性胶原酶(B)。符号表示在CCL25处理的和未处理的含氧量正常的细胞(#)、CCL25处理的和未处理的含氧量低的细胞(@)、或同样地处理的含氧量正常的和含氧量低的细胞(*)之间的显著性(p<0.01)差异。
图13A-B显示SKOV-3细胞的CCL25诱导的明胶酶表达。测试细胞的表达明胶酶(MMP-2和MMP-9)mRNA和活性蛋白质的能力。在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，将SKOV-3细胞单独、使用100ng/ml的CCL25+1μg/ml的同种型对照抗体(Ab)、或者使用CCL25+1μg/ml的小鼠抗CCR9Ab来培养24小时。分离总RNA，并对明胶酶的mRNA表达进行定量RT-PCR分析，并且转录物拷贝数被表示为相对于18S rRNA的实际拷贝数(A)。在条件培养基中通过Fluorokine和Biotrak实验定量活性明胶酶(B)。符号表示在CCL25处理的和未处理的含氧量正常的细胞(#)、CCL25处理的和未处理的含氧量低的细胞(@)、或同样地处理的含氧量正常的和含氧量低的细胞(*)之间的显著性(p<0.01)差异。
图14A-B显示SKOV-3细胞的CCL25诱导的基质降解酶表达。测试细胞的表达基质降解酶(MMP-3,MMP-10,和MMP-11)mRNA和活性蛋白质的能力。在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，将SKOV-3细胞单独、使用100ng/ml的CCL25+1μg/ml的同种型对照抗体(Ab)、或者使用CCL25+1μg/ml的小鼠抗CCR9Ab来培养24小时。分离总RNA，并对基质降解酶的mRNA表达进行定量RT-PCR分析，并且转录物拷贝数被表示为相对于18S rRNA的实际拷贝数(A)。在条件培养基中通过Fluorokine和Biotrak实验定量活性基质降解酶(B)。符号表示在CCL25处理的和未处理的含氧量正常的细胞(#)、CCL25处理的和未处理的含氧量低的细胞(@)、或同样地处理的含氧量正常的和含氧量低的细胞(*)之间的显著性(p<0.01)差异。
图15显示前列腺癌细胞系的CCR9表达。将前列腺癌细胞系(C4-2B、LNCaP、和PC3)和正常的前列腺细胞(RWPE-1)用FITC结合的抗人CCR9(绿色)和7AAD(核染剂；红色)染色。通过Amnis ImageStream使阳性染色细胞成像和定量。右图显示CCR9染色的平均荧光强度。
图16A-D显示前列腺组织的CCR9表达。组织微阵列(TMA)得自国立卫生研究院(National Institutes of Health(NIH))、国立癌症研究所(National Cancer Institute(NCI))和在伯明翰的阿拉巴马大学并且针对CCR9进行染色。具有40X物镜的Aperio Scan Scope系统捕获各载玻片的数字图像。指出前列腺癌(CaP)(A)、匹配的良性前列腺组织(MB)(B)和阴性对照的代表性实例，并且使用ImageScope软件(v.6.25)对扫描和分析的全部组织的CCR9的强度进行定量。图27D显示在MB、良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCa)之间的CCR9免疫强度(immunointensity)。星号表示在MB、BPH和PCa组织之间的免疫强度的显著性(p<0.01)差异。
图17A-D显示前列腺癌组织的CCL25表达。内分泌-旁分泌细胞表型的神经内分泌分化频繁地出现在前列腺恶性肿瘤中并且具有潜在的预后和治疗含意。旁泌性细胞表型可被认为是前列腺和前列腺癌中雄激素不敏感的有丝分裂期后的亚群。图17A图示前列腺上皮内瘤变内的旁泌性模式中的CCL25的表达。双头箭头指向产生CCL25的多重旁泌性细胞(红色)；棕色箭头指表达CCR9的细胞(棕色)。图17B显示对CCL25染色成红色的细胞。棕色箭头指细胞NSE。图17A和C分别是图17D和B高倍放大图。
图18显示正常的健康供体或患有前列腺疾病的患者的血清CCL25水平。ELISA用于定量来自正常的健康供体、前列腺癌(PCa)、前列腺上皮内瘤(prostate interepithelial neoplasia,PIN)和良性前列腺增生(BPH)的血清中的CCL25。星号表示与正常的健康供体相比CCL25水平的显著性差异(p<0.05)。
图19A-C显示小鼠骨髓细胞的CCL25表达。将来自非荷瘤(A)小鼠和荷瘤(B)小鼠的骨髓细胞用抽吸装置抽吸并用FITC结合的抗CCL25抗体染色。用Amnis ImageStream定量阳性染色细胞(C)。使用IDEAS软件进行基于图像的分析并且表明在前列腺肿瘤攻击后骨髓细胞的CCL25表达增加1.6倍。
图20A-B显示CCR9介导的前列腺癌细胞迁移(A)和侵入(B)。测试LNCaP细胞、PC3细胞和C4-2b细胞的迁移到无添加(空心柱)、100ng/mL的CCL25(散列柱(hashed bar))或100ng/mL的CCL25+1μg/mL抗CCL25抗体(实心柱)的能力。应答CCL25(其来自用于接种迁移和侵入室的最初的104个细胞)而迁移和侵入的细胞数(±SEM)，显示迁移是CCL25依赖性的并且被抗CCL25抗体封闭抑制。星号表示在无添加与CCL25处理的细胞之间的显著性差异(p<0.01)。
图21显示CCL25诱导的LNCaP、PC3和C4-2b前列腺癌细胞系的活性基质金属蛋白酶(MMP)表达。在没有(空心箱)或具有100ng/mL CCL25(实心箱)的情况下培养细胞24小时。通过MMP活性测定法确定培养上清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10和MMP-11的蛋白水平。星号显示CCL25处理的细胞系与未处理的细胞系相比MMP分泌的显著性(P<0.05)增加或减少。
图22A-F显示CCR9基因敲减(knockdown)对PC3前列腺癌细胞系的骨转移的抑制。用表达萤光素酶-和多西环素(doxycyclene)-可诱导CCR9-特异性shRNA的PC3细胞系攻击小鼠(A、D)。通过心内注射用该细胞系攻击小鼠。随后，小鼠接受饮料中无添加或添加多西环素(0.2mg/mL)21天。使用Caliper Xenogen 100体内成像系统监测转移和肿瘤生长。在攻击后24小时没有变化(B、E)，但是攻击后三周，与CCR9阳性PC3细胞(C)相比，CCR9基因敲减PC3(F)细胞生长为骨转移显著减少。
图23显示肺癌患者的血清CCL25水平。进行CCL25ELISA以定量来自诊断患有腺癌(Adeno Ca；n＝14)、鳞状细胞癌(SSC；n＝17)的患者和正常的健康供体(对照；n＝9)的血清的CCL25水平。ELISA能够检测>5pg/mL的CCL25。实心圆表示个体的血清CCL25水平，而线表示各组的中值浓度。星号表示在对照组和肺癌组之间的显著性差异(p<0.01)。
图24A-C显示非肿瘤肺和肺癌组织的CCR9表达。来自非肿瘤(n＝8)(A)、腺癌(n＝54)(B)和鳞状细胞癌(n＝24)(C)用同种型对照或抗CCR9抗体染色。棕(DAB)色显示CCR9染色。
图25A-C显示结肠癌组织的CCR9-CCL25表达。来自肺肿瘤(n＝8)和腺癌(n＝16)的结肠组织用同种型对照(A)、抗CCR9(B)或抗CCL25(C)抗体染色。棕色(DAB)染色表示CCR9阳性，而红紫色染色说明CCL25阳性。
实施例2：使用实时PCR分析检测趋化因子表达水平
引物设计
CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1的信使RNA序列得自NIH-NCBI基因库数据库。使用BeaconJ 2.0计算机程序设计引物。使用计算机程序:Primer PremierJ和MIT Primer 3进行引物的热力学分析。针对整个人基因组比较所得到的引物组从而确定特异性。
实时PCR分析
在附加有非必需氨基酸、L-谷氨酸和丙酮酸钠的含有10％胎牛血清的RMPI-1640(完全培养基)中培养癌细胞系(ATCC,Rockville,MD)。原发性肿瘤和正常配对的匹配组织得自临床分离物(Clinomics Biosciences,Frederick,MD and UAB Tissue Procurement,Birmingham,AL)。使用TriReagent(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)按照制造商的说明从106个细胞中分离信使RNA(mRNA)。通过用10U/Fl的无RNA酶的DNA酶(Invitrogen,San Diego,CA)在37℃处理15分钟而从这些样本中除去可能的基因组DNA污染。然后将RNA沉淀并重悬在RNASecure(Ambion,Austin,TX)中。通过使用Taqman7反转录试剂(Applied Biosystems,Foster City,CA)按照制造商的说明反转录大约2μg的总RNA。随后，使用SYBR7Green PCR master mix试剂(Applied Biosystems)按照制造商的说明用针对CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1的特异性的人cDNA引物扩增cDNA。使用BioRad Icycler和软件(Hercules,CA)，通过实时PCR分析评价这些目标的mRNA的拷贝水平。
使用CXCL1-、CXCL2-、CXCL3-、CXCL4-、CXCL5-、CXCL6-、CXCL7-、CXCL8-、CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL12-、CXCL13-、CXCL14-、CXCL15-、CXCL16-、CXCR1-、CXCR2-、CXCR3-、CXCR4-、CXCR5-、CXCR5a-、CXCR5b-、CXCR6-、CXCR7-、CCL1-、CCL2-、CCL3-、CCL4-、CCL5-、CCL6-、CCL7-、CCL8-、CCL9-、CCL10-、CCL11-、CCL12-、CCL13-、CCL14-、CCL15-、CCL16-、CCL17-、CCL18-、CCL19-、CCL20-、CCL21-、CCL22-、CCL24-、CCL25-、CCL25-1-、CCL25-2-、CCL27-、CCL28-、CCR1-、CCR2-、CCR3-、CCR4-、CCR5-、CCR6-、CCR7-、CCR8-、CCR9-、CCR10-、CCR11-、XCL1-、XCL2-、XCR1-、CX3CR1-或CX3CL1特异性引物组得到的RT-PCR产物，由于排除了与宿主序列(NIH-NCBI基因库)退火的引物，不会与其他基因目标发生交叉反应。相对于导致CXCR5a对CXCR5b以及CCL25、CCL25-1对CCL25-2的多态性，引物产生不同尺寸的扩增子产物。为此，腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤细胞系及肿瘤组织的RT-PCR分析显示癌细胞区别地表达趋化因子和趋化因子受体。
实施例3：抗趋化因子和抗趋化因子受体抗体在体外和体内抑制肿瘤细胞生长
抗血清制品
将来自CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCR9、CX3CR1和CX3CL1(SEQ ID NOS:1-SEQ ID NO:21)的15种氨基酸肽合成(Sigma Genosys,The Woodlands,TX)并结合鸡卵溶菌酶(Pierce,Rockford,IL)以产生用于产生抗血清制品或单克隆抗体的后续免疫的抗原。通过显色的鲎阿米巴样细胞溶解物测定法(Cape Cod,Inc.,Falmouth,MS)定量趋化因子肽结合物的内毒素水平并显示为<5EU/mg。对于第一次免疫，以终体积为1.0ml，连同完全弗氏佐剂Ribi佐剂系统(RAS)一起使用100μg的抗原作为免疫原。将该混合物以100ml等分皮下地施用到兔子后背的两个位置上并且将400ml肌内地施用到各后腿肌肉中。三至四周后，对于后续3次免疫，除不完全弗氏佐剂之外，兔子还接受100μg的抗原。当抗CXCR1抗体、抗CXCR2抗体、抗CXCL1抗体、抗CXCL2抗体、抗CXCL3抗体、抗CXCL5抗体、抗CXCL6、抗CXCL7抗体、抗CXCL8抗体、抗CXCL12抗体、抗CXCR5a抗体、抗CXCR5b抗体、抗CXCL13抗体、抗CXCR6抗体、抗CXCL16抗体、抗CCL16抗体、抗CCL25抗体、抗CCL25-1抗体、抗CCL25-2抗体、抗CCR9抗体、抗CX3CR1抗体和抗CX3CL1抗体滴度达到1:1,000,000时收集抗血清。随后，将正常或抗血清热灭活并在PBS中以1:50稀释。
单克隆抗体制品
将来自CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCR9、CX3CR1和CX3CL1的15种氨基酸肽合成(Sigma Genosys)并结合鸡卵溶菌酶(Pierce)以产生用于产生抗血清制品或单克隆抗体的后续免疫的“抗原”。通过显色的鲎阿米巴样细胞溶解物测定法(Cape Cod,Inc.,Falmouth,MS)定量趋化因子肽结合物的内毒素水平并显示为<5EU/mg。对于第一次免疫，以终体积为200ml，连同完全弗氏佐剂Ribi佐剂系统(RAS)一起使用100μg的抗原作为免疫原。将该混合物以100ml等分皮下地施用到大鼠、小鼠或免疫球蛋白-人化的小鼠的后背的两个位置处。两周后，对于后续3次免疫，除不完全弗氏佐剂之外，动物还接受100μg的抗原。收集血清并且当抗CXCR1抗体、抗CXCR2抗体、抗CXCL1抗体、抗CXCL2抗体、抗CXCL3抗体、抗CXCL5抗体、抗CXCL6、抗CXCL7抗体、抗CXCL8抗体、抗CXCL12抗体、抗CXCR5a抗体、抗CXCR5b抗体、抗CXCL13抗体、抗CXCR6抗体、抗CXCL16抗体、抗CCL16抗体、抗CCL25抗体、抗CCL25-1抗体、抗CCL25-2抗体、抗CCR9抗体、抗CX3CR1抗体和抗CX3CL1抗体滴度达到1:2,000,000时，处死宿主，并分离脾细胞，以产生杂交瘤。简言之，将来自免疫宿主的脾或淋巴结的B细胞与不死的骨髓瘤细胞系(例如，YB2/0)融合。接着在选择性培养条件(即，HAT补充培养基)和限定杂交瘤克隆的稀释方法之后分离杂交瘤。使用ELISA选择产生具有所需特异性的抗体的细胞。使用通常使用的分子生物学技术使来自正常大鼠或小鼠的杂交瘤人化。在克隆高亲和力和丰产的杂交瘤后，从腹水或培养上清中分离抗体以及调节至1:2,000,000的滴度并在PBS中以1:50稀释。
抗血清或单克隆抗体处理
免疫缺陷的裸NIH-III小鼠(8至12周龄,Charles River Laboratory,Wilmington,MA)(缺乏T细胞、B细胞和NK细胞)皮下地接受1x 106癌细胞，从而建立肿瘤。然后，将所建立的实体瘤从宿主中移除，用于立即移植或为随后移植而储存在液氮中。使用外科手术将新近分离或液氮冷冻的肿瘤组织(1g)移植在肠内脂肪组织中以产生肿瘤。一旦异种移植肿瘤生长达到5mm大小，就使NIH-III小鼠每三天接受200μl腹腔内注射抗血清或单克隆抗体并且监测肿瘤生长的进展和退化。
数据分析
使用SigmaStat 2000(Chicago,IL)软件分析和确认数据的统计显著性。随后，使用双因子不成对检验，通过史蒂顿特氏t检验(Student's t-test)分析数据。在该分析中，比较处理的样本和未处理的对照。显著性水平设定为p<0.05。
体外生长研究
在具有或没有特异性针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体的存在下，在完全培养基中使腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤细胞系生长。CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7或CXCL8的抗体抑制表达CXCR1和/或CXCR2的癌细胞系的生长。同样地，CXCR4或CXCL12的抗体抑制表达CXCR4的癌细胞系的生长。CXCR5a、CXCR5b或CXCL13的抗体抑制表达CXCR5a或CXCR5a的癌细胞系的生长。CXCR6或CXCL16的抗体抑制表达CXCR6的癌细胞系的增殖。CCR9、CCL25、CCL25-1或CCL25-2的抗体抑制表达CCR9的癌细胞系的生长。CX3CR1或CXC3L1的抗体抑制表达CX3CR1的癌细胞系的繁殖。有兴趣的是，抗可溶性配体、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2或CX3CL1的抗体，它们针对膜受体，在生长抑制方面更加有效。
体外血管发生研究
在血管发生的体外测定法中(BD-Biocoat,Hercules,CA)，在具有或没有特异性针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体的存在下，按照供应商的说明使微血管内皮细胞细胞(Cell Systems,Kirkland,WA)生长并且使其形成微血管小静脉。抗CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR6或CXCL16的抗体抑制血管发生。
体内生长研究
将癌细胞系或原发性肿瘤组织继承性(adoptively)转移到NIH-III小鼠中并使其形成目的异种移植肿瘤。针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CLl的抗体有区别地影响肿瘤大小的进展和退化。在某些情况下，针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR6或CXCL16的抗体有效地导致肿瘤生长退化并阻止肿瘤生长的进展。针对CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体有效地抑制肿瘤尺寸的增加。
在NIH-NCBI基因库中记录了本文中所用的趋化因子的蛋白质序列如下：(1)CXCR1(ACCESSION#NP 000625),SEQ ID NO:1，(2)CXCR2(ACCESSION#NP 001548)，SEQ ID NO:2，(3)CXCL1(ACCESSION#NP 001502)，SEQ ID NO:3，(4)CXCL2(ACCESSION#NP 002080)，SEQ ID NO:4，(5)CXCL3(ACCESSION#NP 002081)，SEQ ID NO:5，(6)CXCL5(ACCESSION#NP 002985)，SEQ ID NO:6，(7)CXCL6(ACCESSION#NP 002984)，SEQ ID NO:7，(8)CXCL7(ACCESSION#NP 002695)，SEQ ID NO:8，(9)CXCL8(IL-8，ACCESSION#NP 000575)，SEQ ID NO:9，(10)CXCR4(ACCESSION#NP 003458)，SEQ ID NO:10，(11)CXCL12(ACCESSION#NP 000600)，SEQ ID NO:11，(12)CXCR5A(ACCESSION#NP 116743)，SEQ ID NO:12，(13)CXCR5B(ACCESSION#NP 001707)，SEQ ID NO:13，(14)CXCL13(ACCESSION#NP 006410)，SEQ ID NO:14，(15)CXCR6(ACCESSION#NP 006555)，SEQ ID NO:15，(16)CXCL16(ACCESSION#NP 071342)，SEQ ID NO:16，(17)CCL16(ACCESSION#NP 004581)，SEQ ID NO:17，(18)CCL25(ACCESSION#NP-005615.2)，SEQ ID NO:18，(19)CCL25-1(ACCESSION#NP 005615)，SEQ ID NO:19，(20)CCL25-2(ACCESSION#NP 683686)，SEQ ID NO:20，(21)CX3CR1(ACCESSION#NP 001328)，SEQ ID NO:21，和(22)CX3CL1(ACCESSION#NP 002987)，SEQ ID NO:22。
cDNA序列是已知的并且可以在NIH-NCBI基因库中得到，以下列登录号：(23)CXCR1(ACCESSION#NM 000634)，SEQ ID NO:23，(24)CXCR2(ACCESSION#NM 001557)，SEQ ID NO:24，(25)CXCL1(ACCESSION#NM 001511)，SEQ ID NO:25，(26)CXCL2(ACCESSION#NM 002089)，SEQ ID NO:26，(27)CXCL3(ACCESSION#NM 002090)，SEQ ID NO:27，(28)CXCL5(ACCESSION#NM 002994)，SEQ ID NO:28，(29)CXCL6(ACCESSION#NM 002993)，SEQ ID NO:29，(30)CXCL7(ACCESSION#NM 002704)，SEQ ID NO:30，(31)CXCL8(IL-8，ACCESSION#NM 000584)，SEQ ID NO:31，(32)CXCR4(ACCESSION#NM 003467)，SEQ ID NO:32，(33)CXCL12(ACCESSION#NM 000609)，SEQ ID NO:33，(34)CXCR5A(ACCESSION#NM 032966)，SEQ ID NO:34，(35)CXCR5B(ACCESSION#NM 001716)，SEQ ID NO:35，(36)CXCL13(ACCESSION#NM 006419)，SEQ ID NO:36，(37)CXCR6(ACCESSION#NM 006564)，SEQ ID NO:37，(38)CXCL16(ACCESSION#NM 022059)，SEQ ID NO:38，(39)CCL16(ACCESSION#NM 004590)，SEQ ID NO:39，(40)CCL25(ACCESSION#NM_005624.3)，SEQ ID NO:40，(41)CCL25-1(ACCESSION#NM 005624)，SEQ ID NO:41，(42)CCL25-2(ACCESSION#NM 148888)，SEQ ID NO:42，(43)CX3CR1(ACCESSION#NM 001337)，SEQ ID NO:43，和(44)CX3CL1(ACCESSION#NM 002996)，SEQ ID NO:44。
如下表所示，大多数的所有肿瘤表达的特定趋化因子可以变化。本申请的方法可专门用于特定患者，这取决于患者自身肿瘤过表达的趋化因子。可以使用本申请的方法识别肿瘤中过表达的特定趋化因子并且施用对抗过表达的趋化因子的抗体。为癌症患者量身定制的治疗是新颖的，并且应用特别有价值。
表1显示在所研究的特定肿瘤中过表达的特定趋化因子的不同数量。
表1.趋化因子、趋化因子受体和癌症联系(取决于疾病的阶段)。
实施例4：与PCa化学抗性相关的CCR9-CCL25诱导的抗细胞凋亡和/或存活信号
在使用或不使用CCL25的情况下以及在使用或不使用多柔比星(1μM/2μM/4μM)、依托泊苷(20μM/40μM)、雌莫司汀(4μM/10μM)或多西他赛(10nM/20nM/40nM)的情况下，使LNCaP(激素应答，野生型p53表达)，PC3(激素不应，p53null)和DU145(激素不应，p53突变的)细胞系生长4、8、12和24小时。通过实时PCR和蛋白质印迹来评价细胞存活、促细胞凋亡和抗细胞凋亡信号(Akt、Src、CamKII、FAK、FKHR、FOXO、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun Apaf1、Bax、Bcl2、BclXL、BaK、Bad、Bik、Bim、TP53、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、存活素、玻璃体结合蛋白、β-连环蛋白)和造成耐药性或新陈代谢的分子(Twist-1、Snail-1、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、p53、拓扑异构酶I、IIα、IIβ、和ABC药物转运体)。简言之，细胞处理后，使用实时PCR测试基因表达的变化。此外，使用磷酸化特异性抗体(即，蛋白质印迹分析)测试信号分子的激活。为了进一步证实活化的信号分子的作用，在CCL25处理后，使用化学抑制剂或siRNA抑制候选分子的表达或活性，并且通过实时PCR分析目标基因。随后，通过Vybrant细胞凋亡测定(Molecular probes)试剂盒评价处理的细胞对化学治疗药物的反应。
RNA分离和实时PCR
使用Trizol TM(Invitrogen)方法分离总RNA并通过UV分光光度测定法定量。通过电泳分析RNA的品质。使用iScriptTM cDNA synthesis kit(BioRad)按照制造商的说明完成cDNA合成。按照制造商的说明使用IQTM SYBR green supermix(BioRad)和针对FAK、FKHR、FOXO、Apaf1、Bax、Bcl2、BclXL、BaK、Bad、Bid、XIAP、Bik、Bim、TP53、细胞色素C、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、存活素、核纤层蛋白、CamKII、玻璃体结合蛋白、β-连环蛋白、钙粘素、Twist-1、Snail-1、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun、β-肌动蛋白和GAPDH设计的引物进行实时PCR。通过△Ct计算结果以定量与未处理组相比mRNA的倍数变化。
蛋白质印迹法
将细胞收集并重悬浮在裂解缓冲液中以提取总蛋白质。裂解缓冲液包含50mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,1％Triton X-100,1％脱氧胆酸盐,0.1％SDS,附加有蛋白酶抑制剂的5mM EDTA,1mM苯基甲基磺酰氟化物,1mM苄脒,10μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂,50μg/mL亮肽酶素,1μg/mL胃酶抑素和20μg/mL抑肽酶。将细胞溶解产物在冰上保持30分钟，在4℃离心(14000xg)20分钟，并且将上清液用于基因的蛋白质印迹分析，证明在mRNA水平上的显著性调变。同样地，磷光体特异性抗体用于测试Akt1/2/3、mTOR、FAK、FKHR、FOXO和GSK-3β的磷酸化(phophorylation)水平的变化。此外，使用特异性抗体评价裂解之后半胱天冬酶和PARP的活化。使用Image J图像分析软件(NIH)，针对β-肌动蛋白和/或GAPDH，对X光片上的通过ECL加试剂(Pharmecia)对蛋白质带进行化学发光检测之后得到的结果进行归一化处理。
细胞色素C释放的检测
将细胞收集，在PBS中洗涤，并重悬浮在含有220mM甘露醇,68mM蔗糖,50mM PIPES-KOH,pH 7.4,50mM KCl,5mM EGTA,2mM MgCl2,1mM DTT,和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液中。冰上孵育30分钟后，使用Glass-Teflon匀浆器匀化细胞，并且匀浆将以14,000g被旋转15分钟。细胞溶质提取物用于使用抗细胞色素C单克隆抗体(PharMingen)的蛋白质印迹分析。
siRNA转染、化学抑制剂、和细胞凋亡检测
使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)用基因特异性和非特异性对照siRNA(Dharmacon)转染前列腺癌细胞系。最佳的基因敲减时间和siRNA浓度是通过蛋白质印迹分析而被确认，并且进一步在使用或没有使用CCL25、抗CCL25抗体、对照抗体和/或抗CCR9抗体进行药物处理之后评价细胞存活。评价生活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的检测如下：使用FACScan流式细胞仪和CellQuestTM软件(BD Pharmingen)，按照制造商的说明用Vybrant细胞凋亡测试细胞存活。使用实时PCR和蛋白质印迹法测试在基因敲减之后的下游基因表达的变化。
用CCL25处理的细胞显示出细胞存活和药物转运体蛋白的表达的增强，这显示在激素应答和不应答细胞中的它们的表达图形的不同。抗CCL25Abs有效地逆转PCa细胞中CCL25的作用。在没有进行CCL25处理(或CCR9封闭)的情况下，多柔比星、雌莫司汀、依托泊苷和多西他赛诱导PCa细胞的凋亡。
实施例5：CCR9-CCL25诱导ABC药物转运体的改变
如前所述，在使用或没有使用CCL25、抗CCL25抗体、对照抗体和/或抗CCR9抗体连同使用或没有使用多柔比星、雌莫司汀、依托泊苷或多西他赛的情况下，使LNCaP细胞、PC3细胞和DU145细胞生长4小时、8小时、12小时或16小时。处理后，使用针对ABC和Twist-1cDNA的特异性引物，如上所述，通过实时PCR定量ABC转运体和Twist-1mRNA表达的变化。进一步通过蛋白质印迹分析测试证明mRNA表达的显著性改变的基因。通过染色质免疫沉淀(ChIP)测定评价经处理的细胞的核提取物以确定由CXCL16诱导的转录因子是否结合ABC转运体和Twist-1的启动子区。
染色质免疫沉淀(ChIP)
实施例4的结果提供了关于被调节的基因以及可调节通过CCR9-CCL25相互作用而被活化的转录因子的基因的信息。基于这些结果，选择目标转录因子和基因。针对这些含有转录因子的结合位点的基因的启动子区设计特异性PCR引物。PCR引物用于扩增与转录因子一起被沉淀的DNA。在20mM丁酸盐的存在下，通过胰蛋白酶消化收获细胞。将50,000个细胞重悬浮在500μl PBS/丁酸盐中。将蛋白质和DNA在室温下用1％甲醛交联8分钟并且在5分钟内用125mM甘氨酸使交联停止。将细胞在4℃使用温和减速设置在甩平式转头中以470g离心10分钟，并在0.5ml冰冷PBS/丁酸盐中通过涡旋接着离心洗涤两次。通过加入裂解缓冲液(50mM Tris–HCl,pH 8,10mM EDTA,1％SDS,蛋白酶抑制剂混合剂(Sigma-Aldrich),1mM PMSF,20mM丁酸盐使细胞裂解，涡旋以及随后离心。已知该操作产生500bp的染色质片段。将超声处理的溶解产物在含有蛋白酶抑制剂混合剂,1mM PMSF和20mM丁酸盐(RIPAChIP缓冲液)的RIPA缓冲液中稀释8倍。将RIPA ChIP缓冲液(330μl)加入到沉淀物中并通过涡旋使其混合。通过使用针对特异性转录因子的抗体完成ChIP物质的免疫沉淀和洗涤。将染色质等分到含有抗体-珠复合物的管中。将加入样本置于用于酚氯仿异戊醇分离的管中。将免疫沉淀的物质洗涤三次并转移到具有TE的新管中。在68℃在单一步骤中在2小时内进行在1％SDS中的DNA洗脱、交联逆转和蛋白酶K消化。DNA使用酚氯仿异戊醇提取，在丙烯酰胺载体(Sigma-Aldrich)存在下乙醇沉淀，并溶解在TE中。通过实时PCR分析来自3–4个独立ChIP的免疫沉淀的DNA。实时PCR数据被表示为在三次独立重复进行的ChIP测定中相对于所加入的DNA沉淀的(抗体-结合的)DNA的百分比(±SD)。
经由CXCR6-CXCL16信号的如CREB、Fos、Jun和NFkB的转录因子的磷酸化和活化随后导致ABC转运体和Twist-1的表达的增加。如果在相同启动子中存在负调控元件，观察基因表达的下降。因为激素依赖的和不应的PCa细胞具有不同的这些细胞内信号分子的表达，所以它们显示了将要通过激素依赖的和不应的状态而被调节的基因的变化。基因表达的调变显示了在CXCL16存在下和在没有CXCL16处理情况下使用药物处理的不同。
实施例6：CCL25-定向治疗的体内评价
用表达萤光素酶的雄激素敏感(LNCaP-Luc)和非敏感(PC3-Luc)细胞皮下攻击雄性裸小鼠。通过使用体内成像系统非侵入地测定肿瘤发展。在可测定的肿瘤建立之后，将小鼠分为治疗组(A、B、C、D和E)和对照组(F、G、H、I、J和K)。“A”组每隔一天接受CCL25中和抗体(12.5mg/kg/天)并且对照(F组)接受同种型对照抗体(12.5mg/kg/天)。“B”组、“C”组、“D”组和“E”组分别在多柔比星的腹腔内注射(在第1～3天，5mg/kg/天，随后在第15～17天施用)、依托泊苷的静脉注射(10mg/kg/天；在第1、5、9、14、19和24天)、雌莫司汀的静脉注射(4mg/kg/天在第1-5天和第26-31天)、或者多西他赛的腹腔内注射(8mg/kg/天，4周，每周2次)的情况下，接受CCL25中和抗体(12.5mg/kg/天)。使用同种型对照抗体(12.5mg/kg/天)，采用相似的浓度和注射方案，使这些处理组的对照接受这些药物。“K”组接受PBS且作为对照剂。在治疗和对照中肿瘤增长和退化通过体内非侵入成像评价。对来自处理组和未处理对照组的肿瘤进行分离并通过免疫组织化学评价细胞存活和耐药性蛋白质方面的变化。在此所使用的上下文中，术语“CCL25中和抗体”是指抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体。
统计学(显著性)和样品尺寸
样品尺寸(或者放大率)计算与初步研究设计相关并且确定了对于建议试验的要求。为了解释我们的结果，显著性检验和统计分析也是重要的。使用常规α-值，即，p＝0.01来评价这一研究的统计显著性。建议的试验将需要每组10只小鼠的最小量。将数据表示为均值±SEM并通过使用用于常规分布样品的两尾配对(或不配对)史蒂顿特氏t检验或者用于非常规分布样品的不成对Mann Whitney U检验(Mann Whitney U test)进行比较。使用SYSTAT(Systat software Inc.)统计程序分析结果。单因子和双因子方差ANOVA分析分别用于评价组和亚组。因此，如果p值<0.05，结果被认为是统计显著的。
动物
六到八周龄成年雄性裸鼠皮下注射PCa细胞。简要地，将5x106个表达荧光素酶的PC3细胞在100μl无菌PBS中再悬浮并且在异氟烷麻醉下注射进裸鼠的侧腹。表达荧光素酶的LNCaP细胞(5x106细胞)与50％基质胶(Becton Dickinson)混合并且在异氟烷麻醉下注射进裸鼠的侧腹。
体内肿瘤生长分析
在成像之前15分钟，使用25x5/8”计量注射针，通过腹膜内注射，荷肿瘤裸鼠接受150mg/kg D-萤光素(Xenogen)。使用IVIS100体内成像系统使小鼠成像，并且结果以光子/秒/cm2/sr表示。肿瘤体积通过使用测径器测量，并且通过公式(较大直径)x(较小直径)2x 0.5来计算。
细胞存活、细胞凋亡和耐药基因表达分析
在处理方案完成后三天，切除所有组的肿瘤。将肿瘤固定在4％PFA中，并且埋入石蜡中。将石蜡切片(厚度为7μm)置于载玻片上，去石蜡化，并且再水化(二甲苯处理5分钟；纯的、95％和70％乙醇各自处理1分钟)。再水化的切片用于对于药物转运体、PI3K、Akt、FAK、FKHR、FOXO、Apaf1、Bax、Bcl2、BclXL、BaK、Bad、Bid、XIAP、Bik、Bim、TP53、细胞色素C、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、存活素、核纤层蛋白、CamKII、玻璃体结合蛋白、β-连环蛋白、钙粘素、Twist-1、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun、CCR9和CCL25的基于过氧化物酶的免疫组织化学染色。在染色之后，用Aperio scanscope(Aperio)系统扫描载玻片并且分析。
CCL25中和导致降低了对药物响应的细胞存活，从而减小肿瘤体积。但是，这种响应在由激素敏感(LNCaP)和激素不应(PC3细胞)形成的肿瘤中也发生变化。此外，化学治疗药物在具有功能性CCR9-CCL25轴线(可以提高已知将这些药物转运到细胞之外的ABC蛋白的表达)的肿瘤中具有较低功效。
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