安石榴苷作为PTP1B抑制剂的应用及医药用途的制作方法

本发明涉及糖尿病领域，具体而言，涉及安石榴苷作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂的应用。

背景技术：

糖尿病(DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。DM的患病率在全球不断增加。据国际糖尿病联合会(IDF)的最新统计数据，截止到2013年，全球有3.82亿人患有糖尿病，预计到2035年，这一数字将上升至5.92亿。II型糖尿病(T2DM)是糖尿病中最常见的形式，大约占全世界糖尿病的90％左右，其特点是高血糖症，血脂异常，以及代谢靶组织的胰岛素抵抗。II型糖尿病可导致严重的并发症，包括肾功能衰竭，失明，缓慢的伤口愈合和心血管疾病等。

糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍，目前尚无根治糖尿病的方法，但通过多种治疗手段可以控制好糖尿病。主要包括5个方面：糖尿病患者的教育，自我监测血糖，饮食治疗，运动治疗和药物治疗。

药物治疗包括口服药物治疗和胰岛素治疗。

1.口服药物治疗

(1)磺脲类药物

II型DM患者经饮食控制，运动，降低体重等治疗后，疗效尚不满意者均可用磺脲类药物。因降糖机制主要是刺激胰岛素分泌，所以对有一定胰岛功能者疗效较好。对一些发病年龄较轻，体形不胖的糖尿病患者在早期也有一定疗效。但对肥胖者使用磺脲类药物时，要特别注意饮食控制，使体重逐渐下降，与双胍类或α-葡萄糖苷酶抑制剂降糖药联用较好。

(2)双胍类降糖药

降血糖的主要机制是增加外周组织对葡萄糖的利用，增加葡萄糖的无氧酵解，减少胃肠道对葡萄糖的吸收，降低体重。该药适应证肥胖型II型糖尿病，单用饮食治疗效果不满意者；II型糖尿病单用磺脲类药物效果不好，可加双胍类药物；I型糖尿病用胰岛素治疗病情不稳定，用双胍类药物可减少胰岛素剂量；II型糖尿病继发性失效改用胰岛素治疗时，可加用双胍类药物，能减少胰岛素用量。

不良反应一是胃肠道反应。最常见、表现为恶心、呕吐、食欲下降、腹痛、腹泻，发生率可达20％。为避免这些不良反应，应在餐中、或餐后服药。二是头痛、头晕、金属味。三是乳酸酸中毒，多见于长期、大量应用降糖灵，伴有肝、肾功能减退，缺氧性疾病，急性感染、胃肠道疾病时，降糖片引起酸中毒的机会较少。

(3)α葡萄糖苷酶抑制剂

I型和II型糖尿病均可使用，可以与磺脲类，双胍类或胰岛素联用。伏格列波糖餐前即刻口服。阿卡波糖餐前即刻口服。主要不良反应有：腹痛、肠胀气、腹泻、肛门排气增多。

(4)胰岛素增敏剂

有增强胰岛素作用，改善糖代谢。可以单用，也可用磺脲类，双胍类或胰岛素联用。有肝脏病或心功能不全者者不宜应用。

(5)格列奈类胰岛素促分泌剂

瑞格列奈为快速促胰岛素分泌剂，餐前即刻口服，每次主餐时服，不进餐不服。那格列奈作用类似于瑞格列奈。

2.胰岛素治疗

胰岛素制剂有动物胰岛素、人胰岛素和胰岛素类似物。根据作用时间分为短效、中效和长效胰岛。

上述药物治疗具有明显的毒副作用，例如磺酰类药物会引起低血糖和体重增加，双胍类药物和α葡萄糖苷酶抑制剂会引起胃肠道不适，具体如上所述。因此，人们开始寻找新作用机制的抗II型糖尿病的药物。

II型糖尿病的发病机理主要是基因缺陷，存在胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍，体现为胰岛素分泌不足。目前的研究表明，胰岛素抵抗是II型糖尿病最重要的的病理基础或危险因子。随着胰岛素生理学和胰岛素外周作用机理的研究，特别是对胰岛素作用于其受体后的信号传导通路的研究，揭示了一些寻找糖尿病药物的新靶点。近年来，在遗传学的研究发现，几种蛋白酪氨酸磷酸酶(ProteinTyrosine Phosphatase，PTP)基因越来越引起人们的注目。他们在胰岛素作用的信号传导途径中起到重要的负调节作用，其中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的作用尤其显著。近年来，以PTP1B为抗II型糖尿病和肥胖症的新靶点。

1988年Tonks等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化了第一个37kDa的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteinTyrosine Phosphatase-1B，PTP1B)。PTP1B是一种胞内PTP，位于内质网，在人体的各种组织中都有表达；其与蛋白酪氨酸激酶(ProteinTyrosineKinases，PTK)共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。

1990年Cicirelli等首次提出PTP1B与胰岛素信号转导有关，向爪蟾卵母细胞中注射微量的PTP1B后，阻碍了胰岛素对S6肽的磷酸化，并延迟了胰岛素促进卵母细胞的成熟作用。这项具有里程碑标志的研究揭示出了PTP1B在胰岛素信号转导中的负调节作用。PTP1B专一水解芳香族磷酸，如磷酸化酪氨酸(phosphotyrosyl，pTyr)残基上磷酸根的酶，通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，组织细胞中PTP1B过表达都会降低PTK的活性，使胰岛素受体无法与胰岛素结合，进而引起胰岛素抵抗，最终导致II型糖尿病。

Elchebly等利用基因敲除技术，对PTP1B敲除的小鼠进行胰岛素耐受性和敏感性的研究，明确了PTP1B与II型糖尿病和肥胖症疾病之间的关系。研究发现，在PTP1B敲除小鼠的骨骼肌和肝脏中，胰岛素受体的自身磷酸化增加，对胰岛素的敏感性提高，并能抵抗体重的增加。该研究明确了PTP1B是治疗II型糖尿病和肥胖症的靶点，说明PTP1B抑制剂通过提高胰岛素的敏感性，可有效治疗II型糖尿病和肥胖症。

蛋白酪氨酸磷酸酶为使参与多种调控过程的底物去磷酸化的跨膜或分子内酶的大家族(Fischer et al.,1991,Science 253:401-406)。蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)为大量存在于各种人体组织中的约50kD细胞内蛋白(Charbonneau et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5252-5256；Goldstein,1993,Receptor 3:1-15)。

许多蛋白是PTP1B的底物。一种重要的底物是胰岛素受体。胰岛素与其受体的结合导致受体的自磷酸化，尤其是对激酶催化域中的酪氨酸1146、1150，和1151(White&Kahn,1994,J.Biol.Chem.269:1-4)。这引起胰岛素受体酪氨酸激酶的激活，使得各种胰岛素受体底物(IRS)蛋白磷酸化，所述蛋白使胰岛素信号传导事件进一步向下游传播，以介导胰岛素的各种生物学效应。

Kennedy et al.,1999,Science 283:1544-1548显示蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B是胰岛素信号传导途径的负调节剂，提示这种酶的抑制剂可有益于治疗II型糖尿病。缺失PTP1B的小鼠对糖尿病和肥胖症二者有抗性。

通过在II型糖尿病的动物模型中使用对PTP1B有特异性的反义寡核苷酸，提供了使用PTP1B抑制剂以治疗II型糖尿病和相关疾病的进一步支持。在动物模型中用反义寡核苷酸抑制PTP1B导致血糖和胰岛素水平的正常化：Zinker et al.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:11357。

因此认为抑制PTP1B的化合物具有在有需要的患者中治疗和/或控制II型糖尿病和改进葡萄糖耐受性的效用。也认为PTP1B的抑制剂可用于在前驱糖尿病患者中延缓糖尿病的发生并防止前驱糖尿病患者发展成糖尿病。PTP1B抑制剂也可具有治疗肥胖症和血脂障碍的效用。因此存在对新的抑制PTP1B的化合物的需求。

在几种癌症细胞系，包括慢性骨髓性白血病(CML)、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中已观察到升高水平的PTP1B，表明PTP1B在控制这些和其它癌症细胞中的激酶活性的调节作用。参见例如，Liu,et al.,J Biol.Chem.,1996,271:31290-31295；Kenneth et al.,Mol Cell Biol,1998,18:2965-2975；Weiner et al.,J Natl.Cancer Inst.,1996,86:372-378。因此抑制PTP1B活性可构成用于治疗或预防这些和其它癌症的重要靶标。PTP1B抑制剂因此可用于治疗或预防癌症和用于在癌症一旦发生时减慢其进展。

通过免疫组织化学在各种人类癌症，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌、鳞状细胞癌和前列腺癌中也已检测到升高水平的PTP1B并且这种过表达与不良预后相关。参见例如，Zhai et al.,Cancer Res.1993,53:2272-2278；Weiner et al.,J Natl.Cancer Inst.；Wiener,et al.,Am.J.Obstet.Gynecol.,1994,170:1177-1183；Zhu et al.,Cancer Res.2007,67:10129-10137；Wang et al.,Med Oncol.2011Mar 27.[Epub ahead of print；DOI:10.1007/s12032-011-9911-2]；Nanney et al.,J.Cutan.Pathol.,1997,24:521-532；Wu et al.,Prostate,2006,66:1125-1135；Lessard et al.,Cancer Res,.2012Jan 26.[Epub ahead of print]。PTP1B在人类癌症中的过表达及其与肿瘤分期的相关性提示PTP1B抑制剂可用于预防这些人类癌症的进展。

Julien et al,Nat.Genet.,2007,39:338-346，显示缺乏一个或两个拷贝的PTP1B基因的NDL2小鼠比具有正常拷贝数的基因的那些小鼠在显著更长的时间段内没有肿瘤。而且，用PTP1B抑制剂处理的NDL2小鼠在哺乳动物肿瘤的形成中也显示出显著的延迟。

此外，Balavenkatraman et.al.,Mol Cancer Res.,2011,9:1377-1384,证实PTP1B活性促成人类乳腺癌的发生，这提示抑制PTP1B在乳腺瘤预防中可为有效的。

PTP1B抑制剂主要有以下几种：钒酸盐类化合物、肽类抑制剂、二氟甲基磷酸类化合物、萘醌类化合物、苯并呋喃、苯并噻吩联苯类化合物、哒嗪类化合物等。这些合成的化合物，在体内具有较好的降糖效果，但至今还没有临床研究。相对于合成的化合物，存在的植物中的天然活性化合物，在药物后期的研究开发过程中有较高的成功机率。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明一方面涉及安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂的应用。

本发明另一方面涉及安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药在制备用于预防或治疗与蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)相关的病症的药物中的应用。

发明人首次发现安石榴苷是一种PTP1B的抑制剂。安石榴苷作为植物中的天然活性化合物，在药物后期的研究开发过程中有较高的成功机率。

附图说明

图1示出了通过对硝基苯磷酸二钠(pNPP)法检测安石榴苷对PTP1B活性的抑制作用的结果。

图2示出了通过AutoDock 4.0对安石榴苷和PTP1B之间相互作用计算结果。

图3A示出了差异对中所有表达基因火山图。X、Y坐标轴均取筛选条件值的对数形式，图中每个点代表一个差异表达基因。上部灰色代表显著差异基因，下部黑色代表非显著差异基因。

图3B示出了差异基因数量统计图(安石榴苷显著下调725个基因，显著上调108个基因)。

图3C示出了差异基因的GO功能显著性富集分析。

图3D示出了差异基因pathway富集统计散点图。

图4A和图4B示出了通过Western Blot的方法检测安石榴苷对LPS诱导下促炎因子(IL-1/IL-6和TNF-a)的抑制作用(图4A为电泳图，图4B为统计图)。

图4C和图4D示出了通过Western Blot的方法检测安石榴苷对代表巨噬细胞分型的指标iNOS(M1)和arg(M2)的调节，表明安石榴苷可以抑制巨噬细胞激活(M1)，并促进其向M2型转化(图4C为电泳图，图4D为统计图)。

图4E、4F示出了通过流式细胞术的方法进一步验证安石榴苷对巨噬细胞分型的影响(a：阴性对照；b：对照组；c脂多糖模型组；d：安石榴苷+脂多糖处理组)。结果发现安石榴苷抑制M1型巨噬细胞表面标记(CD11c)表达(图4E)，同时促进M2型标记(CD206)表达(图4F)，表明其确实抑制M1型巨噬细胞生成，并促进M2型巨噬细胞生成。

图5A示出了ELISA法检测安石榴苷对LPS诱导的IL-4蛋白释放量的影响。

图5B示出了ELISA法检测安石榴苷对LPS诱导的IL-10蛋白释放量的影响。

图5C示出了PCR检测安石榴苷对LPS诱导的IL-4mRNA的调节。

图5D示出了PCR检测安石榴苷对LPS诱导的IL-10mRNA的调节。

图5E、5F示出了通过Western Blot方法监测安石榴苷对不同STAT亚型蛋白活性的调节(图5E为电泳图，图5F为统计图)。

具体实施方式

安石榴苷是传统中药石榴皮的主要成分，占其多酚总量的65.75％。近年来，关于安石榴苷活性的报道逐年增加，其治疗炎症疾病、抵抗病原感染和改善肥胖并发症等作用被揭示。

然而，药物在进入细胞内发挥调节作用时需要有至少一个直接作用靶点，进而调节相关生物学进程，虽然已有大量文献报道安石榴苷的良好临床疗效，但其直接靶点仍未见有相关研究报道。

发明人通过反向药效团预测、活性抑制试验和3D Docking等技术，证明PTP1B是安石榴苷的直接靶点，即安石榴苷是一类PTP1B抑制剂。

发明人通过Pharmmapper反向药效团预测首次发现：安石榴苷可能与PTP1B存在直接靶向结合作用(Submission ID:151026075307)。为了验证该结论，发明人通过进行对硝基苯磷酸二钠(pNPP)检测实验，发现安石榴苷确实可以有效抑制纯化的活性PTP1B蛋白对底物pNPP的去磷酸化作用，IC50＝1.04μM。通过Docking计算机模拟发现，安石榴苷可以与PTP1B通过氢键和疏水作用等进行非共价键结合，作用位点位于Cys215、Arg221、Asp181和Ser216等已知的关键活性位点。因此，安石榴苷在体外可以靶向结合PTP1B蛋白，抑制其去磷酸化能力。

因此，安石榴苷是一种PTP1B的抑制剂，IC50＝1.04μM。安石榴苷可以与PTP1B通过氢键和疏水作用等进行非共价键结合，作用位点位于Cys215、Arg221和Asp181等已知的关键活性位点。

因此，本发明一方面涉及安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药作为PTP1B抑制剂的应用。该应用可以是体内应用或体外应用。

本发明还涉及安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药在预防或治疗与PTP1B相关的病症或由PTP1B介导的疾病中的应用。

本发明还涉及安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药在预防或治疗通过PTP1B抑制剂调节的疾病中的应用。

本发明还涉及安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药在制备用于预防或治疗通过PTP1B抑制剂调节的疾病的药物中的应用。

本发明还涉及预防或治疗与PTP1B相关的病症的方法，包括向需要其的主体(subject)给予安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

本发明还涉及预防或治疗与PTP1B相关的病症的药物，该药物包括(a)安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药以及(b)可选的药用辅料。

本发明另一方面涉及安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药在制备用于预防或治疗与PTP1B相关的病症的药物中的应用。

在一些实施方式中，与PTP1B相关的病症包括糖尿病、胰岛素抵抗、脂质病症、肥胖症、代谢综合症、癌症、非酒精性脂肪肝、高胰岛素血症、阿尔茨海默病、脓毒症、内毒素血症和慢性阻塞性肺疾病。

在一些实施方式中，与PTP1B相关的病症包括胰岛素抵抗、胰岛素抵抗相关的疾病、非酒精性脂肪肝、高胰岛素血症、肝细胞癌、阿尔茨海默病、脓毒症、内毒素血症、慢性阻塞性肺疾病、以及非小细胞性肺癌。

在一些实施方式中，与PTP1B相关的病症为胰岛素抵抗相关的疾病。

在一些实施方式中，与PTP1B相关的病症为II型糖尿病。

在一些实施方式中，与PTP1B相关的病症为胰岛素抵抗。胰岛素抵抗可以为原发性胰岛素抵抗或继发性胰岛素抵抗。

在一些实施方式中，与PTP1B相关的病症为代谢综合症。

PTP1B的抑制剂改进胰岛素敏感性并可具有在以下方面的效用：在所有的需要这样的治疗或可从这样的治疗受益的哺乳动物，包括人类中预防或治疗糖尿病，改进葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性(当存在胰岛素抵抗时)，和治疗或预防肥胖症。本发明化合物更通常可用于治疗II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病，或NIDDM)。本发明化合物也可引起甘油三酯和脂质的有益减少。

因此，本发明的一个方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中治疗高血糖症、糖尿病或胰岛素抵抗的方法，其包括给予所述患者有效量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

本发明的第二个方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中治疗非胰岛素依赖性糖尿病(II型糖尿病)的方法，其包括给予患者抗糖尿病有效量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

本发明的第三个方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中治疗肥胖症的方法，其包括给予所述患者有效治疗肥胖症的量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

本发明的第四个方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中治疗代谢综合征及其后遗症的方法，其包括给予所述患者有效治疗代谢综合征及其后遗症的量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。代谢综合征的后遗症包括高血压、升高的血糖水平、高甘油三酯，和低水平的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇。

本发明的第五个方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中治疗脂质病症的方法，所述脂质病症选自血脂障碍、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL和高LDL，该方法包括给予所述患者有效治疗所述脂质病症的量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

本发明的第六个方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中治疗动脉粥样硬化的方法，其包括给予所述患者有效治疗动脉粥样硬化的量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

本发明的第七个方面涉及治疗伴随II型糖尿病的其它病况的方法，包括胰腺炎、脂肪细胞肿瘤、脂肪细胞癌例如脂肪肉瘤、炎性肠病、一般炎症，和其中存在胰岛素抵抗的其它病症。通过保持高血糖症受到控制，本发明化合物也可有效延缓或预防血管再狭窄和糖尿病性视网膜病。

本发明的第八个方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中治疗癌症的方法，其包括给予所述患者有效治疗癌症的量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。过度表达和升高水平的PTP1B已在几种癌症系，包括慢性骨髓性白血病(CML)、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中观察到，提示PTP1B在这些和其它癌症细胞中控制激酶活性的调节作用。因此抑制PTP1B活性可构成用于治疗或预防这些和其它癌症的重要靶标。因此可使用本发明化合物以治疗或预防癌症，例如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤，白血病，黑色素瘤，淋巴瘤、肾癌、胃癌和膀胱癌。

本发明的进一步的方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中治疗选自以下病况的方法：(1)高血糖症，(2)低葡萄糖耐受性，(3)胰岛素抵抗，(4)肥胖症，(5)脂质病症，(6)血脂障碍，(7)高脂血症，(8)高甘油三酯血症，(9)高胆固醇血症，(10)低高密度脂蛋白(HDL)水平，(11)高低密度脂蛋白(LDL)水平，(12)动脉粥样硬化及其后遗症，(13)血管再狭窄，(14)胰腺炎，(15)腹部肥胖，(16)神经退行性疾病，(17)视网膜病，(18)肾病，(19)神经病，(20)非酒精性脂肪性肝病或肝脂肪变性，(21)非酒精性脂肪性肝炎，(22)多囊性卵巢综合征，(23)睡眠-呼吸障碍，(24)代谢综合征，(25)肝纤维化，(26)肝硬化；和(27)其中存在胰岛素抵抗的其它病况和病症，该方法包括给予患者有效治疗所述病况的量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

本发明的更进一步的方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中延缓选自以下的病况起始的方法：(1)高血糖症，(2)低葡萄糖耐受性，(3)胰岛素抵抗，(4)肥胖症，(5)脂质病症，(6)血脂障碍，(7)高脂血症，(8)高甘油三酯血症，(9)高胆固醇血症，(10)低HDL水平，(11)高LDL水平，(12)动脉粥样硬化及其后遗症，(13)血管再狭窄，(14)胰腺炎，(15)腹部肥胖症，(16)神经退行性疾病，(17)视网膜病，(18)肾病，(19)神经病，(20)非酒精性脂肪性肝病或肝脂肪变性，(21)非酒精性脂肪性肝炎，(22)多囊性卵巢综合征，(23)睡眠-呼吸障碍，(24)代谢综合征，(25)肝纤维化，(26)肝硬化；和(27)其中存在胰岛素抵抗的其它病况和病症，该方法包括给予患者有效延缓所述病况起始的量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

本发明的更进一步的方面涉及在需要这样的治疗的哺乳动物患者中降低发展选自以下的病况的风险的方法：(1)高血糖症，(2)低葡萄糖耐受性，(3)胰岛素抵抗、(4)肥胖症、(5)脂质病症，(6)血脂障碍，(7)高脂血症，(8)高甘油三酯血症，(9)高胆固醇血症，(10)低HDL水平，(11)高LDL水平，(12)动脉粥样硬化及其后遗症，(13)血管再狭窄，(14)胰腺炎，(15)腹部肥胖症、(16)神经退行性疾病，(17)视网膜病，(18)肾病，(19)神经病，(20)非酒精性脂肪性肝病或肝脂肪变性，(21)非酒精性脂肪性肝炎，(22)多囊性卵巢综合征，(23)睡眠-呼吸障碍，(24)代谢综合征，(25)肝纤维化，(26)肝硬化；和(27)其中存在胰岛素抵抗的其它病况和病症，该方法包括给予患者有效降低发展所述病况的风险的量的安石榴苷、或其药用盐、溶剂化物、水合物、前药。

除了灵长类动物，例如人之外，多种其它哺乳动物也可依据本发明的方法进行治疗。例如，哺乳动物包括，但不限于，牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它牛科动物、羊类、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物(例如小鼠)物种可被治疗。然而，所述方法也可在其它物种中实施，例如鸟类物种(例如，鸡)。

本发明还涉及制备用于在人和动物中抑制PTP1B酶活性的药物的方法，其包括将本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂混合。更特别地，本发明涉及本发明化合物在制备用于在哺乳动物中治疗选自以下病况的药物中的用途：癌症、高血糖症、II型糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖症，和脂质病症，其中脂质病症选自血脂障碍、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL和高LDL。

以本方法治疗的受试者通常为其中抑制PTP1B酶活性为需要的哺乳动物，优选人类，包括雄性或雌性。

在一些实施方式中，癌症包括，但不限于，慢性骨髓性白血病、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、胃癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、肝癌、肝细胞癌。

在一些实施方式中，病症不包括肥胖症、肥胖并发症、炎症疾病、病原感染、缺氧性肺动脉高压、非酒精性脂肪肝、氧化应激导致的睾丸损伤、高糖诱导的神经管缺陷、心肌损伤、抗沙门氏菌感染、急性呼吸窘迫综合征、抗动脉粥样硬化、脑缺血再灌注损伤、抗突变、抗滋养层细胞凋亡、抗病毒(人巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、登革病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒71、1型单纯疱疹病毒)、阿尔茨海默病、抗念珠菌感染、或保肝作用。

药物可以为经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型，优选口服剂型。

经胃肠道给药剂型，是指药物制剂经口服用后进入胃肠道，起局部或经吸收而发挥全身作用的剂型，如散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、以及混悬剂等。

非经胃肠道给药剂型，是指除口服给药途径以外的所有其他剂型，这些剂型，可在给药部位起局部作用或被吸收后发挥全身作用。非经胃肠道给药剂型可以包括：

(1)注射给药剂型：如注射剂，包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等多种注射途径。

(2)呼吸道给药剂型：如喷雾剂、气雾剂、粉雾剂等。

(3)皮肤给药剂型：如外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等。

(4)粘膜给药剂型：如滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂等。

(5)腔道给药剂型：如栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂及滴丸剂等，用于直肠、阴道、尿道、鼻腔、耳道等。

药物的给药剂型按照分散形式，包括以下剂型：

(1)溶液型：药物以分子或离子状态(质点的直径小于1nm)分散于分散介质中所形成的均匀分散体系，也称为低分子溶液，如芳香水剂、溶液剂、糖浆剂、甘油剂、醑剂、注射剂等。

(2)胶体溶液型：主要以高分子(质点的直径在1～100nm)分散在分散介质中所形成的均匀分散体系，也称高分子溶液，如胶浆剂、火棉胶剂、涂膜剂等。

(3)乳剂型：油类药物或药物油溶液以液滴状态分散在分散介质中所形成的非均匀分散体系，如口服乳剂、静脉注射乳剂、部分搽剂等。

(4)混悬型：固体药物以微粒状态分散在分散介质中所形成的非均匀分散体系，如合剂、洗剂、混悬剂等。

(5)气体分散型：液体或固体药物以微粒状态分散在气体分散介质中所形成的分散体系，如气雾剂。

(6)微粒分散型：药物以不同大小微粒呈液体或固体状态分散，如微球制剂、微囊制剂、纳米囊制剂等。

(7)固体分散型：固体药物以聚集体状态存在的分散体系，如片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂等。

药物可以为注射剂型。注射剂型包括但不限于皮下注射剂型、肌肉注射剂型和静脉注射剂型。

药用辅料可以选自以下一种或多种：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、以及释放阻滞剂。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实验部分

I.检测安石榴苷对PTP1B活性的抑制作用

(1)试验方法：

将PTP1B溶解于酶活缓冲液中(50mM HEPES,PH＝7.2)，配置成200nM的PTP1B蛋白溶液。将底物pNPP溶于酶活缓冲液中，配置成12mM的底物储备液。将待测化合物标记，溶于95％的DMSO中，配置成10mM待测液，用DMSO进行1/2梯度稀释，共11个浓度梯度。于96孔板中依次加入50μL PTP1B蛋白溶液，及10μL待测化合物溶液，震荡1min，30℃孵育30min。然后加入50μL pNPP底物储备液，震荡10sec。阴性对照加入50μL PTP1B蛋白溶液，及10μL 95％DMSO，震荡1min，30℃孵育30min。于酶标仪405nm检测中产物吸光度。利用软件SPSS11.5进行probit非线性回归分析，以抑制率为纵坐标，化合物浓度为横坐标绘制曲线(如图1所示)，计算IC50。

(2)实验结果：

安石榴苷对PTP1B有显著的抑制作用，IC50＝1.04μM。

II.安石榴苷和PTP1B之间相互作用、结合位点计算

1.计算方法

(1)配体处理：利用Chenmidraw 11.0软件绘制小分子的结构，然后经过能量优化后保存成mol2格式，然后用Autodock 4.0软件处理小分子，通过加氢、计算电荷、合并非极性氢后保存成pdb,最后保存成pdbqt。

(2)受体处理：参考客户提供文献获得的pdb文件进行分子对接，删除水分子和固有配体，然后用Autodock 4.0处理蛋白结构，通过加氢、计算电荷、合并非极性氢后保存成pdbqt文件。

(3)Autogrid处理：打开大小分子的pdbqt文件，然后以蛋白的活性位点(参考客户提供文献及pdb结构)为中心，构建一个60*60*60的盒子，保存成gpf文件，通过autogrid运算生成glg文件。

(4)Autodock运算：打开大小分子的pdbqt文件，利用默认的软件参数，小分子结构采取柔性方式，运算30次，保存成dpf文件，通过Autodock运算生成D8042.dlg文件。

2.计算结果：

(1)结合对接图片来看，小分子配体通过疏水作用进入蛋白表面形成的疏水空腔，靶向结合了黄PTP1B蛋白受体(图2)。

(2)具体的作用位点，小分子通过与蛋白的Arg24、Tyr46、Asp48、Val49、Lys116、Phe182、Gly183、Cys215、Ser216、Ala217、Ile219、Arg221、Met258、Thr263、Gln266等氨基酸相互作用，进而更好的作用于受体蛋白。

(3)预测关键氨基酸位点：小分子通过其结构上的羰基氧原子与Ser216、Ile219，Gly220氨基酸残基氨基上的氢原子形成氢键，氢键的形成增强了小分子靶向蛋白的能力。

表1

III.安石榴苷对潜在靶位点的基因表达调控检测(图3A至图3D)

1.试验方法：

(1)实验对象：小鼠RAW264.7巨噬细胞系。

(2)分组处理分为两组：对照组和安石榴苷处理组，处理条件为50μM安石榴苷作用于RAW264.7巨噬细胞6h。

(3)实验步骤：

(a)Trizol法提取总RNA并使用DNaseI消化DNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，向得到的mRNA中加入适量打断试剂高温条件下使其片断化，再以片断后的mRNA为模板，合成cDNA，经过磁珠纯化、末端修复、3’末端加碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。

(b)构建好的文库用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlusReal-Time PCR System进行质量和产量检测，文库质控合格后进行测序。

(c)得到原始测序列数据后，使用Illumina平台进行上机测序。

(d)质控后，经过滤得到的干净读取(clean reads)比对到参考序列。比对完，通过统计比对率、读取(reads)在参考序列上的分布情况等，判断比对结果是否通过第二次质控(QC of alignment)。若通过，则进行基因定量分析、基于基因表达水平的各项分析(主成分、相关性、条件特异表达、差异基因筛选等等)，并对筛选出的样品间差异表达基因，进行GO功能显著性富集分析(图3C)、pathway显著性富集分析(图3D)、聚类、蛋白互作网络和转录因子等更深入的挖掘分析。

2.实验结果：

发现安石榴苷作为PTP1B抑制剂处理RAW264.7巨噬细胞后，共显著上调基因108个，显著下调基因725个(变化倍数>2)(图3B)。明显改变巨噬细胞内的相关生物学进程(GO功能分析和Pathway富集分析)，主要集中于急慢性炎症、心血管疾病和感染免疫等生物学进程(图3C和图3D)。

差异基因的Pathway显著性富集分析。在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，基于Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。我们以KEGG公共数据库对差异基因作Pathway富集分析。图3D示出了差异基因pathway富集统计散点图。富集因子(RichFactor)指差异表达的基因中位于该pathway条目的基因数目与所有有注释基因中位于该pathway条目的基因总数的比值，富集因子(RichFactor)越大，表示富集的程度越大。Q值(Qvalue)是做过多重假设检验校正之后的P值(Pvalue)，取值范围为0到1，越接近于零，表示富集越显著。图中只展示富集程度排名前20的pathway条目。

IV.安石榴苷抑制巨噬细胞炎症进程(图4A至图4F)

1.试验方法：

(1)通过Western Blot的方法检测安石榴苷对LPS诱导下促炎因子(IL-1/IL-6和TNF-a)的抑制作用，及对代表巨噬细胞分型的指标iNOS(M1)和arg(M2)的调节(图4A至图4D)。

(a)实验对象：小鼠RAW264.7巨噬细胞系。

(b)分组处理分为五组：对照组、LPS刺激组、安石榴苷(0、25、50、100μM)处理组，处理方法为安石榴苷提前处理1h后，LPS进一步刺激12h后提取总蛋白检测。

(c)Western Blot方法

使用25cm²培养瓶培养细胞。将处理完成后的巨噬细胞收集，离心分离并洗涤3次，通过使用蛋白提取试剂盒提取巨噬细胞的总蛋白。BCA法检测总蛋白的浓度后，使用Loading Buffer按比例与蛋白混合煮沸，-20℃保存备用。利用相应一抗抗体和荧光二抗对硝酸纤维膜上的蛋白进行测定，GAPDH作为参比蛋白，检测信号经Odssey远红外成像仪进行分析。

(2)通过流式细胞术的方法进一步验证安石榴苷对巨噬细胞分型的影响(图4E、4F)

(a)实验对象：小鼠RAW264.7巨噬细胞系。

(b)分组处理分为三组：对照组、LPS刺激组、安石榴苷(50μM)处理组，处理方法为安石榴苷提前处理1h后，LPS进一步刺激12h。

(c)使用6孔板培养瓶培养细胞，各组试验处理如分组所述，采用流式细胞术检测表面标记。胰酶消化细胞后离心并洗涤三次。用300μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，调整细胞浓度大约为1×10⁶细胞/mL。在细胞悬浮液中分别相应加入5μL APC-CD 86、FITC-CD 68和PE-CD 206进行标记，轻轻混匀后置于4℃冰箱中，避光孵育15min。在1h内用流式细胞仪进行检测。

2.实验结果：

图4A至4D表明：安石榴苷显著抑制LPS诱导的M1型巨噬细胞促炎产物IL-1β、IL-6和TNF-α、和iNOS，同时显著上调M2型巨噬细胞标志物Arg-1的含量。

图4E和图4F表明:安石榴苷会显著降低M1型巨噬细胞表面分子标记CD86，同时显著提高M2型标记CD206的含量。表明安石榴苷可以抑制巨噬细胞炎症进程。

V.安石榴苷分子机制研究(图5A至图5F)

1.实验步骤：

(a)实验对象：小鼠RAW264.7巨噬细胞系。

(b)分组处理分为五组：对照组、LPS刺激组、安石榴苷(0、25、50、100μM)处理组，处理方法为安石榴苷提前处理1h后，LPS进一步刺激12h后提取总蛋白检测。

(c)ELISA方法检测细胞因子表达

通过夹心法ELISA的手段检测安石榴苷对抗炎因子IL-4和IL-10的调节。

(d)Western Blot方法

使用25cm²培养瓶培养细胞。将处理完成后的巨噬细胞收集，离心分离并洗涤3次，通过使用蛋白提取试剂盒提取巨噬细胞的总蛋白。BCA法检测总蛋白的浓度后，使用Loading Buffer按比例与蛋白混合煮沸，-20℃保存备用。利用相应一抗抗体和荧光二抗对硝酸纤维膜上的蛋白进行测定，GAPDH作为参比蛋白，检测信号经Odssey远红外成像仪进行分析。

2.实验结果

(a)安石榴苷抑制抗炎因子IL-4生成，但显著上调抗炎因子IL-10的生成。图5A至图5D分别为ELISA法和PCR检测安石榴苷对LPS诱导的IL-4和Il-10释放和mRNA的调节，结果显示安石榴苷不影响IL-4，主要作用是促进IL-10生成。

(b)安石榴苷显著抑制STAT1的磷酸化水平，同时显著上调STAT3的磷酸化水平。通过Western Blot方法发现安石榴苷主要调控STAT3的磷酸化，抑制STAT1的磷酸化，对STAT6磷酸化没有明显调节作用(图5E、5F)。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。