一种磁性纳米杀菌剂的制备方法和应用与流程

本发明涉及杀菌剂，具体涉及一种磁性纳米杀菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

四环素类抗生素，在化学结构上属氢化并四苯环衍生物，具有杀菌范围较广、价格便宜等优点，作为杀菌药物而被广泛应用于人和动物的疾病治疗，同时长期添加于饲料中以预防疾病和促进生长发育。我国是抗生素生产和消费大国，但对抗生素的生产和使用缺乏科学的管理，抗生素的滥用情况非常严重。因此我国环境中抗生素的残留浓度较高，存在严重的抗生素污染问题。为减少抗生素用量，防止抗生素滥用，我们设计了一种安全高效的磁纳米杀菌剂。

磁性纳米材料是近年来新兴的功能型材料，Fe₃O₄磁性纳米粒子因其高比表面积、生物相容性好、粒径可控、易制备和在外部磁场下快速响应等特性得到人们的特别关注，广泛应用于生物医药、材料化学、分离科学等领域，尤其是在磁靶向给药方面的应用引起了研究者们持续而广泛的关注。

胆酸由一个刚性的甾环和一个脂肪侧链组成，是胆汁中一大类胆烷酸的总称。研究表面胆酸与药物结合可以提高药物的细胞膜渗透性和药效。鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholicacid，简称CDCA)是胆酸的一种，1848年首次从鹅胆汁中提取得到，具有平喘、化痰、镇咳和抗炎的作用。鹅去氧胆酸分子的甾环上连有两个羟基和一个羧基易于进行化学修饰，并具有较好的细胞膜渗透性和较高的转运能力，以其衍生物与磁纳米通过共价缩合做载体，赋予药物包合物细胞膜渗透性和磁靶向性，能够实现药物的高效的灭菌活性，减少抗生素用量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效的磁性纳米杀菌剂及其制备方法。该磁性纳米杀菌剂，具有较好的杀菌活性，可减少用量，防止抗生素滥用。

本发明所提供的磁性纳米杀菌剂，通过包括如下步骤的方法制备得到：

(1)酯化鹅去氧胆酸的制备：将鹅去氧胆酸溶解在甲酸溶液中，在50-60℃下，机械搅拌反应5-6小时后，产物旋转蒸发去除溶剂，所得固体过柱提纯；40-70℃真空干燥12小时，得到甲酸修饰的酯化鹅去氧胆酸(CDCA)，密封保存；

(2)酯化鹅去氧胆酸/Fe₃O₄磁性纳米复合体(CDCA-APTES-Fe₃O₄–MNPs)的制备：将酯化鹅去氧胆酸溶解于无水二氯甲烷中，加入缩水剂二环己基碳二亚胺、催化剂4-二甲氨基吡啶，机械搅拌10min，所述酯化鹅去氧胆酸、缩水剂和催化剂的摩尔比为1∶0.9-1.2∶0.8-1.2；同时称取酯化鹅去氧胆酸质量18-22％的修饰了氨基的Fe₃O₄-MNPs溶于无水二氯甲烷溶液中，超声使其均匀分散后加入到上述酯化鹅去氧胆酸混合溶液中，室温反应过夜；所得产物过滤，用二氯甲烷漂洗，再依次用二次水、饱和碳酸氢钠、二次水洗涤；40-70℃真空干燥12小时，得到复合体CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs；

(3)磁性纳米杀菌剂的制备：将复合体CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs加入浓度为10^-2mol/L的pH 5-9的磷酸缓冲溶液中，超声混匀，再加入浓度为10^-3mol/L的四环素类抗生素药物，缓冲溶液和药物的体积比1∶0.5-3，复合体与药物的质量比为2-5∶1；在室温下超声10min，振荡3-6小时；磁滞分离，沉淀在40-70℃下真空干燥12小时，得到CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs与四环素类抗生素的包合物，即磁性纳米杀菌剂。

步骤(1)中，所述机械搅拌转速800r/min；反应温度为55℃下，搅拌反应时间为5-6小时；过柱提纯的展开剂为乙醇∶二氯甲烷＝2∶98。

步骤(2)中，所述氨基化的Fe₃O₄-MNPs的量为酯化胆酸质量的20％。

步骤(1)、(2)、(3)中真空干燥温度优选为60℃。

步骤(3)中，所述的四环素类抗生素优选盐酸土霉素(OTC)或盐酸金霉素(CTC)。

与现有技术相比本发明的有益效果：

本发明在Fe₃O₄磁性纳米粒子上接枝了鹅去氧胆酸，并与四环素类抗生素包合，合成了一种新型磁性纳米杀菌剂。该磁性纳米杀菌剂细胞膜渗透性好、杀菌活性高，在减少抗生素用量、防止抗生素污染方面有重要应用价值。由于鹅去氧胆酸是一种天然胆酸，原料易得，生物相容性好，化学结构易于修饰，并具有较好的细胞膜渗透性和较高的转运能力，以其衍生物作为载体，赋予杀菌剂良好的细胞膜渗透性，提高了杀菌剂的杀菌效果。本发明还通过改变缓冲液的pH值研究了磁性纳米杀菌剂在细胞外的释放能力，并通过与单纯的抗生素杀菌活性对比，对其进行了杀菌活性评价。得出的结论是：该磁性纳米杀菌剂具有较高的杀菌活性，可减少用量，防止抗生素滥用。

附图说明

图1 CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的分离过程。图中：(a)制备的CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs分散在水溶液中；(b)CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs完全被磁铁分离。

图2 APTES-Fe₃O₄-MNPs(a)和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs(b)的红外光谱图。

图3 APTES-Fe₃O₄-MNPs(a)和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs(b)的透射电镜照片。

图4 CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的X-射线衍射图。

图5 CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的磁滞回线图。

图6 APTES-Fe₃O₄-MNPs(a)和CDCA–APTES-Fe₃O₄-MNPs(b)的热重分析图。

图7 pH对CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs与CTC和OTC负载作用的影响，F：CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs吸附后上清液中CTC和OTC的荧光强度，F₀：CTC和OTC的荧光强度。

图8不同pH条件下CTC磁性纳米杀菌剂的体外释放曲线。

图9不同pH条件下OTC磁性纳米杀菌剂的体外释放曲线。

图10 OTC磁性纳米杀菌剂杀菌活性效果图。

图11 CTC磁性纳米杀菌剂杀菌活性效果图。

具体实施方式

实施例1：磁性纳米杀菌剂的制备

(1)鹅去氧胆酸衍生物的制备：称取1.0012g鹅去氧胆酸，将其溶解在10mL甲酸溶液中；55℃下，磁力搅拌5小时后，产物通过旋转蒸发仪去除溶剂，所得固体过柱提纯(展开剂：乙醇∶二氯甲烷＝2∶98)。60℃真空干燥12小时，得到甲酸修饰的酯化鹅去氧胆酸(CDCA)，密封保存。

(2)酯化鹅去氧胆酸/Fe₃O₄磁性纳米复合体(CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs)的制备：称取酯化鹅去氧胆酸1g溶解于20mL无水二氯甲烷中，加入缩水剂二环己基碳二亚胺0.58g、催化剂4-二甲氨基吡啶0.24g，搅拌10min。同时称取0.2g的修饰的氨基化的Fe₃O₄-MNPs溶于20mL无水二氯甲烷溶液中，超声待其均匀分散后加入酯化鹅去氧胆酸混合溶液中，室温反应过夜。所得产物用二氯甲烷漂洗，再分别用二次水、饱和碳酸氢钠、二次水洗涤。60℃真空干燥12小时，得到CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs。

(3)磁性纳米杀菌剂的制备：称取5mg CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs加入2mL浓度为10^-2mol/L的pH＝6的磷酸缓冲溶液中，超声混匀，再加入4mL浓度为10^-3mol/L的抗生素OTC，在室温下超声10min，振荡6小时；磁滞分离，沉淀在60℃下真空干燥12小时，得到CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs与抗生素OTC的包合物。

称取5mg CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs加入2mL浓度为10^-2mol/L的pH＝9的磷酸缓冲溶液中，超声混匀，再加入4mL浓度为10^-3mol/L的抗生素CTC，在室温下超声10min，振荡3小时；磁滞分离，沉淀在60℃下真空干燥12小时，得到CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs与抗生素CTC的包合物。

从图2红外光谱图显示：a谱线588cm^-1处的吸收峰为Fe₃O₄-MNPs中Fe-O四面体的特征吸收，3420cm^-1处为Fe₃O₄-MNPs表面-OH的伸缩振动峰，1630cm^-1为-NH和-NH₂的伸缩振动峰。表明：APTES成功修饰到Fe₃O₄-MNPs表面。b谱线为CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的红外谱线，1077cm^-1为酯化胆酸中C-C(＝O)-O的强吸收峰，此峰强且宽，在酯的红外光谱中常为第一强峰。1716cm^-1为酯中C＝O伸缩振动，1635cm^-1为酰胺中C＝O的伸缩振动峰，1556cm^-1为N-H的弯曲振动，1412cm^-1为酰胺中C-N的伸缩振动，以上特征峰的出现证实了鹅去氧胆酸衍生物成功修饰到APTES-Fe₃O₄-MNPs上。

图3的透射电镜照片显示：图中a和b分别为APTES-Fe₃O₄-MNPs和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的TEM照片。从图中可看到APTES-Fe₃O₄-MNPs和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs形状近似球形或椭球形,分散性良好,没有明显的团聚现象。APTES-Fe₃O₄-MNPs和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的平均粒径分布在14±2nm,在Fe₃O₄-MNPs超顺磁性粒径要求范围内(粒径小于20nm)，酯化鹅去氧胆酸的修饰对平均粒径影响不大。

图4为CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的X-射线衍射图谱(XRD)。图中2θ位于30.12,35.58,43.35,53.62,57.13，62.,89相应的衍射峰分别对应于Fe₃O₄面心立方的(220),(311),(400),(422),(511)和(440)衍射面。上述结果与JCPDS(No.85-1436)标准卡片中赤铁矿的图谱一致,表明合成的CDCA-Fe₃O₄-MNPs具有立方尖晶石结构。选取CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的最强衍射峰(311)用于粒径估算,由Scherrer公式(1)计算出CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的平均粒径为15nm，与TEM测得的粒径数据接近。

D＝0.89λ/Bcosθ (1)

其中，D为粒子的平均直径/nm，0.89为Scherrer常数，λ为0.154nm，是X-射线波长，B为衍射峰的半高宽，θ为衍射角/rad。

图5为CDCA–APTES-Fe₃O₄-MNPs的磁滞回线图。横坐标为外加磁场强度,纵坐标为单位质量磁性物质在外加磁场存在时的感应磁性大小。从图中可以看到，该曲线经过原点，当外加磁场为0时，磁感应强度为0，符合超顺磁的概念，说明该物质是超顺磁性的。根据磁力矩实验得到结果为：CDCA–APTES-Fe₃O₄-MNPs的饱和磁化值可达到59emu/g。鹅去氧胆酸修饰后，没有明显弱化Fe₃O₄-MNPs的磁性。

采用热重分析(TGA)进一步证实鹅去氧胆酸修饰到Fe₃O₄-MNPs表面，并测定了表面修饰剂的含量。Fe₃O₄-MNPs和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的热重曲线如图6所示。Fe₃O₄-MNPs在120℃左右出现了首次失重，这是Fe₃O₄-MNPs表面吸附的溶剂(水或乙醇)挥发造成的。CDCA-APTES-Fe3O4-MNPs的失重曲线在155℃-301.92℃之间的失重(2.75％)归结为3-氨基丙基的热分解失重；在301.92℃-600℃之间存在一个显著的失重(3.4％)过程，这是由于修饰到磁纳米材料上的鹅去氧胆酸等有机结构的热分解造成的。CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的失重曲线没有出现增重的过程,说明CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs包覆Fe₃O₄-MNPs后不容易被氧化，稳定性有了很大提高。通过分析及计算表明，酯化鹅去氧胆酸成功修饰到Fe₃O₄-MNPs表面，修饰量为34.75mg/g。

由于抗生素对pH较敏感，故研究了不同pH下CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的载药性能。配置0.2mg/mL的CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs溶液，超声混匀，分别加入不同pH(3-11)磷酸缓冲液和浓度为1×10^-5mol/L的抗生素CTC或OTC。超声10min，溶液在室温下振荡3-6小时。反应完毕后，磁滞分离，取上清液测定其荧光强度。处理数据，如图7所示，CTC在pH≤9时，CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs对CTC的负载量随着pH的增大而增大，且在pH＝9时，负载量明显增加。pH为9-11时，负载量又逐渐下降。故碱性条件(pH＝9)更有利于CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs对CTC的负载；OTC在pH≤6时，CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs对OTC的负载量随着pH的增大而增大，pH在7-11时，负载量又逐渐下降，因此选用pH＝6来负载抗生素OTC。

实施例2：磁性纳米杀菌剂的体外释放实验

称取2份2mg的CTC包合物和2份2mg的OTC包合物，分别加入浓度10^-2mol/LpH＝7和pH＝9的PB缓冲溶液各30mL。在37℃的水浴中计时释放，每隔一定时间取上清液测其荧光，计算其累计释放率。如图8、9所示，pH＝7和pH＝9时，CTC的累计释放率分别达到14％和23％；OTC的累计释放率分别为9％和12％。对比释放数据可以看出，药物释放具有一定的pH依赖性。CTC和OTC的释放过程均分为两个阶段。CTC在60min内释放曲线的斜率很大；说明此时释放速率较快，这可能是由于吸附在载体表面的CTC由于浓度差产生扩散引起的，之后变化较缓慢，4小时左右达到平台。说明载体外围吸附的CTC达到了扩散平衡；OTC在40min内释放曲线的斜率很大，说明此时释放速率较快，之后变化较缓慢，2小时左右达到平台，说明载体外围吸附的OTC达到了扩散平衡。可见，该杀菌剂释放速率较快，实用性较强。

实施例3：磁性纳米杀菌剂杀菌活性的实验

土霉素OTC磁性纳米杀菌剂杀灭大肠杆菌实验，每支试管取7.5mL牛肉膏蛋白冻培养基，各加100μL浓度为10⁸CFU/mL的大肠杆菌液，分别配置浓度为1mg/mL、3μg/mL、5μg/mL、7μg/mL、11μg/mL、20μg/mL的OTC磁性纳米杀菌剂(实验组)和磁性纳米复合体、裸药OTC(对照组)，于37℃恒温摇床培养24h。如图10所示，最上层为磁性纳米复合体，六支试管全是浑浊的，说明大肠杆菌大量繁殖，磁纳米没有杀菌能力；中间层为裸药OTC，前两只试管是浑浊的，说明细菌大量繁殖，之后试管澄清透亮，说明可有效杀死细菌，其最小抑菌浓度在5μg/mL；最下层为OTC磁性纳米杀菌剂，从第二支试管就开始澄清透亮，其最小抑菌浓度在3μg/mL。可知磁性纳米杀菌剂杀菌活性明显高于裸药。

金霉素CTC磁性纳米杀菌剂杀灭金葡萄球菌实验，每支试管取6mL牛肉膏蛋白冻培养基，各加100μL浓度为10⁸CFU/mL的金葡萄球菌液，分别配置浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL的CTC磁性纳米杀菌剂(实验组)和磁性纳米复合体、裸药CTC(对照组)，于37℃恒温摇床培养24h。如图11所示，最上层为磁性纳米复合体，六支试管全是浑浊的，说明金葡萄球菌大量繁殖，磁纳米没有杀菌能力；中间层为CTC磁性纳米杀菌剂，前两只试管是浑浊的，说明细菌大量繁殖，之后试管澄清透亮，说明可有效杀死细菌，其最小抑菌浓度在0.3μg/mL；最下层为裸药CTC，从第四支试管才开始澄清透亮，其最小抑菌浓度在0.4μg/mL。可知磁性纳米杀菌剂杀菌活性高于裸药。

综上所述，磁性纳米粒子和四环素类抗生素结合有协同作用，可提高抗生素的杀菌能力，可见磁性纳米杀菌剂是安全高效的抗生素替代品，可以作为实用型杀菌剂。