一种猪疫苗用免疫增强剂、其制备方法及应用与流程

本发明涉及一种猪疫苗用免疫增强剂、其制备方法及应用，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术：

疫苗免疫一般认为是防治畜禽传染病最有效和最经济的手段之一。然而，传统疫苗和新型疫苗也遇到了一些难以解决的问题：疫苗对某些群体的免疫效力低下；需要反复免疫才能产生较好的免疫力；疫苗保护力易随时间推移而严重降低；甚至某些传染病尚无有效疫苗防治等。因此，很多疫苗，尤其是亚单位疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗等新型疫苗必须产生更强大和更持久的免疫反应才能满足需要。免疫增强剂可以调动、调节、提高动物机体整个免疫系统的功能，从而辅佐性的使疫苗起到更有效的保护作用。

细胞因子(cytokines，CK)是一类存在于人和高等动物体中的、由白细胞和其他细胞合成的异源性蛋白或糖蛋白，一般以小分子分泌物形式释放，可结合在靶细胞的特异受体上，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可使细胞间的各种信使分子连成一动态网络，借以发挥其激活和调节免疫系统的多种功能，以便对外来的病原体感染或抗原性异物迅速作出免疫应答和其他生理反应。

细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子在免疫应答中扮演重要角色，可影响抗原的激活、呈递、识别等过程,具有明显的免疫佐剂或免疫增强剂效应。目前研究发现的具有免疫佐剂效应的细胞因子有干扰素(Interferon，IFN)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏子因子(Tumor necrosis factor，TNF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)等，其中作为免疫增强剂效果最明显的为IFN和IL-2。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足之处，本发明提供了一种猪疫苗用免疫增强剂、其制备方法及应用，通过将猪干扰素α、重组猪干扰素γ、重组猪IL-2与冻干保护剂制成冻干产品，将其与猪疫苗联合应用可提高猪疫苗的体液和细胞免疫应答水平。

本发明的技术方案如下:

一种猪疫苗用免疫增强剂，所述猪疫苗用免疫增强剂包括猪基因工程细胞因子复合物和冻干保护剂；所述猪基因工程细胞因子复合物按照重量份数包括如下成分：重组猪干扰素α50～70份、重组猪干扰素γ15～25份、重组猪IL-2 15～25份。

所述猪干扰素α、重组猪干扰素γ、重组猪IL-2的编码基因的核苷酸序列分别如SEQUENCE LISTING<400>1、SEQUENCE LISTING<400>2和SEQUENCE LISTING<400>3所示。

所述冻干保护剂包括脱脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，三者在猪疫苗用免疫增强剂中的浓度依次为：脱脂奶粉5g/100ml、葡萄糖5g/100ml和血清白蛋白10g/100ml。脱脂奶粉可促进升华、加热灭菌，易取得均质产品；血清白蛋白可以增加总蛋白浓度，对蛋白质产品的冻融起到很好的保护作用，减少其活性丧失。葡萄糖与蛋白质活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置，对蛋白质活性起保护作用；

所述猪疫苗用免疫增强剂的添加量为猪疫苗质量的1～25％。

所述猪疫苗包括猪灭活疫苗、基因工程疫苗或减毒活疫苗。

一种猪疫苗用免疫增强剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

A.分别将所述重组猪干扰素α、重组猪干扰素γ、重组猪IL-2溶于PBS缓冲溶液中，分别配置成重组猪干扰素α的溶液、重组猪干扰素γ溶液、重组猪IL-2溶液；

B.将所述的重组猪干扰素α的溶液、重组猪干扰素γ溶液、重组猪IL-2溶液混合，混合液中按照重量份数包括如下成分：重组猪干扰素α50～70份、重组猪干扰素γ15～25份、重组猪IL-2 15～25份；

C.向步骤B得到的混合液中加入所述脱脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，混匀，每支2ml分装，置于冻干机冻干，即可得到猪疫苗用免疫增强剂。

所述PBS缓冲溶液的pH为7.2～7.4。

所述重组猪干扰素α的溶液、重组猪干扰素γ溶液、重组猪IL-2溶液的浓度均为1mg/mL。

本发明还提供了所述猪疫苗用免疫增强剂与猪疫苗联合使用的应用。

本发明的新型猪疫苗用免疫增强剂中：

重组猪干扰素α(IFN-α)能够激活活性蛋白C，增加抗体的表达，增强了细胞毒性T细胞的效应，促进Th1型细胞分化、单核细胞分泌IL-1、淋巴细胞的细胞毒性作用。

重组猪干扰素γ(IFN-γ)具有诱导机体合成多种阻断病毒复制功能的抗病毒酶和蛋白，是抗病毒感染的重要分子。IFN-γ还能增强机体Tn细胞和DTH的免疫应答。其机理是通过提高抗原递呈细胞膜表面MHCⅡ类抗原的表达。所以IFN-γ也是重要的免疫调节分子，在临床上常用作免疫佐剂。IFN-γ能显著增加抗原提呈细胞表达MHC-Ⅱ类抗原的数量，诱导单核细胞、巨嗜细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞等MHC II类抗原的识别过程，增强抗原提呈细胞与T细胞的相互作用并诱导B细胞的增殖和分化，与IL-2协同增加轻链合成。IFN-γ还可使静止的CD4+T细胞分化为Th1细胞，从而增强机体的体液免疫和细胞免疫。

重组猪IL-2可以促进T细胞生长、诱导或增强细胞毒性细胞的杀伤活性、协同刺激B细胞增值及分泌免疫球蛋白、增强活化的T细胞产生IFN和CSF、诱导淋巴细胞表达IL-2R、促进少突胶质细胞的成熟和增殖及增强吞噬细胞的吞噬杀伤能力等免疫生物学效应。

研究表明，体内的各种细胞因子之间并不是孤立存在的，而是有着复杂的相互作用，它们之间通过合成和分泌的相互调节，受体表达的相互调节、生物学效应的相互影响等组成一个复杂的细胞因子互作网络。这些相互调节作用建立在各细胞因子之间合适的比例用量的条件下，若某一组份含量过高会导致其他调节通路被抑制，从而导致免疫系统紊乱，过少则达不到预期效果。

该免疫增强剂能非特异性激活、增强猪的细胞免疫和体液免疫，增强动物的抗感染能力。在猪疫苗使用中添加该免疫增强剂，添加量为猪疫苗质量的1～25％，能有效地提高猪疫苗的细胞免疫应答与体液免疫应答水平；使用范围包括猪灭活疫苗、基因工程疫苗和减毒活疫苗。

本发明具有如下技术效果：

1)可提高猪疫苗的体液免疫应答水平：本免疫增强剂与疫苗合用后，疫苗保护期特异性抗体水平提高，抗体产生窗口期缩短30～50％，特异性体液免疫应答标志物IL-4分泌量较单独应用疫苗可提高1～5倍。

2)可提高猪疫苗的细胞免疫应答水平，细胞免疫应答标志物干扰素γ分泌量较单独应用疫苗可提高1～5倍。

3)安全性好，可制备成水溶性，解决了目前市场上疫苗免疫佐剂存在注射局部脓肿、结节、溃疡的形成而导致急性或慢性炎症反应等问题。

4)体内无残留。本免疫增强剂均为重组细胞因子蛋白质，正常猪体内亦含有，安全、体内无残留，并易于存贮。

附图说明

图1为实施例2-4的猪疫苗用免疫增强剂提高腹泻二联疫苗免疫后干扰素γ分泌水平的对比图；

图2为实施例2-4的猪疫苗用免疫增强剂提高腹泻二联疫苗免疫后干扰素IL-4分泌水平的对比图；

图3为实施例2的猪疫苗用免疫增强剂提高猪传染性胃肠炎病毒疫苗免疫后抗体水平；

图4为实施例3的猪疫苗用免疫增强剂提高猪传染性胃肠炎病毒疫苗免疫后抗体水平；

图5为实施例4的猪疫苗用免疫增强剂提高猪传染性胃肠炎病毒疫苗免疫后抗体水平。

具体实施方式

实施例1

制备重组猪干扰素α、重组猪干扰素γ、重组猪IL-2

重组猪干扰素α、重组猪干扰素γ、重组猪IL-2的制备，包括如下步骤：

1)重组猪干扰素α制备

构建含重组猪干扰素α目的基因的工程大肠杆菌→工程菌发酵→菌液破碎→离心取含目的蛋白上清→蛋白纯化→中间品检验；其制备方法具体参见2008年10月22日公开的中国专利CN101289666。

2)重组猪干扰素γ制备

构建含重组猪干扰素γ目的基因的工程大肠杆菌→工程菌发酵→菌液破碎→离心取含目的蛋白上清→蛋白纯化→中间品检验；

具体包括以下步骤：

(1)构建克隆载体

重组猪γ干扰素的目的基因为：

atgagttata caacttattt cttagctttt cagctttgcg tgactttgtg tttttctggc tcttactgcc aggcgccctt ttttaaagaa ataacgatcc taaaggacta ttttaatgca agtacctcag atgtacctaa tggtggacct cttttcttag aaattttgaa gaattggaaa gaggagagtg acaaaaaaat aattcagagc caaattgtct ccttctactt caaattcttt gaaatcttca aagataacca ggccattcaa aggagcatgg atgtgatcaa gcaagacatg tttcagaggt tcctaaatgg tagctctggg aaactgaatg acttcgaaaa gctgattaaa attccggtag ataatctgca gatccagcgc aaagccatca gtgaactcat caaagtgatg aatgatctgt caccaagatc taacctaaga aagcggaaga gaagtcagac tatgttccaa ggccagagag catcaaaa aa；

特异性PCR引物如下：上游：5'-GCA GGATCC ATGAGTTATACAAC-3’

下游：5'-AAC CTCG AG TTTTGATGCTCTCT-3’

利用设计的特异性引物进行PCR获得猪干扰素γ的目的基因，并将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector并转化至JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定，根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序；

(2)构建猪γ干扰素表达工程菌

鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET-32a进行连接，并相应转化至BL-21大肠杆菌，分别进行培养，鉴定出表达载体构建成功的重组表达工程菌进行放大培养。并加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导剂低温诱导表达，收集工程菌后，菌液在-20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率：400W，工作3S，间隔3S，超声6min，重复3-4次，离心12000r/min离心15min获得上清。

(3)纯化

上清液经亲和层析纯化、离子交换层析纯化和分子筛层析纯化后鉴定，即可得到重组猪干扰素γ的目的基因。

3)重组猪IL-2制备方法：构建含重组猪IL-2目的基因的工程大肠杆菌→工程菌发酵→菌液破碎→离心取含目的蛋白上清→蛋白纯化→中间品检验；

具体包括以下步骤：

(1)构建克隆载体

重组猪IL-2的目的基因为：

atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt gcacctactt caagctctac aaagaacaca aagaaacaac tggagccatt gctgctggat ttacagttgc ttttgaagga agttaagaat tacgagaatg ctgatctctc caggatgctc acatttaaat tttacatgcc caagcaggct acagaattga aacaccttca gtgtttagta gaagaactca aagctctgga gggagtgcta aatttaggtc aaagcaaaaa ctctgactca gcaaatatca aggaatcaat gaacaatatc aacgtaacag ttttggaact aaagggatct gaaacaagtt tcgaatgtga atatgatgat gagacagtaa ctgctgttga atttctgaac aaatggatta ccttttgtca aagcatctac tcaacactga ct；

特异性引物序列：上游：5'-CG GGATCC ATGGGTAAGATG-3’

下游：5'-CCG CTCGAG AGTCAGTGTTGA-3’

用特异性引物PCR扩增猪IL-2的目的基因后，并将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定，根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序；

(2)构建表达猪IL-2工程菌

鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET-32a进行连接，并相应转化至BL-21大肠杆菌，分别进行培养，鉴定出表达载体构建成功的重组表达菌进行放大培养。并加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导剂低温诱导表达，

收集工程菌后，菌液在-20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率：400W，工作3S，间隔3S，超声6min，重复3-4次，离心12000r/min离心15min获得上清。

(3)纯化

上清液经亲和层析纯化、离子交换层析纯化和分子筛层析纯化后鉴定，即可得到重组猪IL-2的目的基因。

实施例2

制备猪疫苗用免疫增强剂

本实施例的新型猪疫苗用免疫增强剂，包括猪基因工程细胞因子复合物和冻干保护剂。

猪基因工程细胞因子复合物，按照重量份数包括如下成分：重组猪干扰素α50重量份、重组猪干扰素γ25重量份、重组猪IL-2 25重量份，所述的重组猪干扰素α的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的重组猪干扰素γ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述的重组猪IL-2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

冻干保护剂包括脱脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，所述的各个成分在免疫增强剂的浓度如下：脱脂奶粉5g/100ml、葡萄糖5g/100ml和血清白蛋白10g/100ml。

本实施例的猪疫苗用免疫增强剂，配制方法如下：

1)配制1mg/ml的重组猪干扰素α溶液、1mg/ml重组猪干扰素γ溶液和1mg/ml重组猪IL-2溶液；

溶液配制方法：在pH＝7.2～7.4的PBS缓冲液中加入实施例1制备的蛋白配制而成；

2)取1mg/ml的重组猪干扰素α溶液50ml，取1mg/ml重组猪干扰素γ溶液25ml，取1mg/ml重组猪IL-2溶液25ml，混合后得到的100ml混合液(混合液中含有50mg重组猪干扰素α，25mg重组猪干扰素γ和25mg重组猪IL-2)；

3)向100ml混合液中加入5g脱脂奶粉、5g葡萄糖和10g血清白蛋白作为冻干保护剂，混匀，每支2ml分装，置于冻干机冻干。

使用时，将每支冻干产品用2ml pH＝7.2～7.4PBS缓冲溶液溶解后按比例加入疫苗中，免疫增强剂的添加量为猪疫苗质量的1％。

实施例3

制备猪疫苗用免疫增强剂

本实施例的新型猪疫苗用免疫增强剂，包括猪基因工程细胞因子复合物和冻干保护剂。

猪基因工程细胞因子复合物，按照重量份数包括如下成分：重组猪干扰素α60重量份、重组猪干扰素γ20重量份、重组猪IL-2 20重量份，所述的重组猪干扰素α的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的重组猪干扰素γ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述的重组猪IL-2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

冻干保护剂包括脱脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，所述的各个成分在免疫增强剂的浓度如下：脱脂奶粉5g/100ml、葡萄糖5g/100ml和血清白蛋白10g/100ml。

本实施例的猪疫苗用免疫增强剂，配制方法如下：

1)配制1mg/ml的重组猪干扰素α溶液、1mg/ml重组猪干扰素γ溶液和1mg/ml重组猪IL-2溶液；

溶液配制方法：在pH＝7.2～7.4的PBS缓冲液中加入实施例1制备的蛋白配制而成；

2)取1mg/ml的重组猪干扰素α溶液60ml，取1mg/ml重组猪干扰素γ溶液20ml，取1mg/ml重组猪IL-2溶液20ml，混合后得到的100ml混合液(混合液中含有60mg重组猪干扰素α，20mg重组猪干扰素γ和20mg重组猪IL-2)；

3)向100ml混合液中加入5g脱脂奶粉、5g葡萄糖和10g血清白蛋白作为冻干保护剂，混匀，每支2ml分装，置于冻干机冻干。

使用时，将每支冻干产品用2ml pH＝7.2～7.4的PBS缓冲溶液溶解后按比例加入疫苗中，免疫增强剂的添加量为猪疫苗质量的15％。

实施例4

制备猪疫苗用免疫增强剂

本实施例的新型猪疫苗用免疫增强剂，包括猪基因工程细胞因子复合物和冻干保护剂。

猪基因工程细胞因子复合物，按照重量份数包括如下成分：重组猪干扰素α70重量份、重组猪干扰素γ15重量份、重组猪IL-2 15重量份，所述的重组猪干扰素α的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的重组猪干扰素γ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述的重组猪IL-2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

冻干保护剂包括脱脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，所述的各个成分在免疫增强剂的浓度如下：脱脂奶粉5g/100ml、葡萄糖5g/100ml和血清白蛋白10g/100ml。

本实施例的猪疫苗用免疫增强剂，配制方法如下：

1)配制1mg/ml的重组猪干扰素α溶液、1mg/ml重组猪干扰素γ溶液和1mg/ml重组猪IL-2溶液；

溶液配制方法：在pH＝7.2～7.4的PBS缓冲液中加入实施例1制备的蛋白配制而成；

2)取1mg/ml的重组猪干扰素α溶液70ml，取1mg/ml重组猪干扰素γ溶液15ml，取1mg/ml重组猪IL-2溶液15ml，混合后得到的100ml混合液(混合液中含有70mg重组猪干扰素α，15mg重组猪干扰素γ和15mg重组猪IL-2)；

3)向100ml混合液中加入5g脱脂奶粉、5g葡萄糖和10g血清白蛋白作为冻干保护剂，混匀，置于冻干机冻干，每支2ml。

使用时，将每支冻干产品用2mlpH＝7.2～7.4的PBS缓冲溶液溶解后按比例加入疫苗中，免疫增强剂的添加量为猪疫苗质量的25％。

实施例5

检测实施例2-4的新型猪疫苗用免疫增强剂提高猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗免疫效果。

5.1猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗购自江苏南农高科技股份有限公司。

5.2实验动物分组

5.2.1方案1

将15头猪随机分为3组，每组5头。

1)试验组：实施例2的新型猪疫苗用免疫增强剂+猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗组；免疫增强剂的添加量为猪疫苗质量的1％。

2)对照组：单独猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗组对照组；

3)对照组：正常猪对照组。

5.2.2方案2

将15头猪随机分为3组，每组5头。

1)试验组：实施例3的新型猪疫苗用免疫增强剂+猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗组；免疫增强剂的添加量为猪疫苗质量的15％。

2)对照组：单独猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗组对照组；

3)对照组：正常猪对照组。

5.2.3方案3

将15头猪随机分为3组，每组5头。

1)试验组：实施例4的新型猪疫苗用免疫增强剂+猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗组；免疫增强剂的添加量为猪疫苗质量的25％。

2)对照组：单独猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗组对照组；

3)对照组：正常猪对照组。

5.3样品采集

免疫后1—4周，每周每头前腔静脉采血1ml，3000r/min离心去上清分离血清，-20℃冻存，分别检测每个方案中每组的血清细胞因子分泌水平和抗体水平。

5.4试验结果

5.4.1干扰素γ和IL-4分泌水平检测结果

采用ELISA试剂盒(购自Biorbyt公司)检测血清中干扰素γ和IL-4水平。

结果见图1和图2。

从图1和图2中，可以看出：

方案1试验组中细胞免疫应答标志物干扰素γ分泌量较单独应用疫苗的对照组提高3倍；试验组中体液免疫应答标志物IL-4分泌量较单独应用疫苗的对照组提高2.5倍；

方案2试验组中细胞免疫应答标志物干扰素γ分泌量较单独应用疫苗的对照组提高2倍；试验组中体液免疫应答标志物IL-4分泌量较单独应用疫苗的对照组提高1.5倍；

方案3试验组中细胞免疫应答标志物干扰素γ分泌量较单独应用疫苗的对照组提高2.5倍；试验组中体液免疫应答标志物IL-4分泌量较单独应用疫苗的对照组提高1.5倍。

5.4.2抗体水平检测结果

采用ELISA法检测血清中抗体水平。

结果见图3-5。从图3-5可以看出：使用方案1-3的新型猪疫苗用免疫增强剂+猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗试验组明显较单独应用疫苗对照组平台期抗体水平提高，以ELISA检测结果P/N＞2.1计算，方案1-3试验组中的抗体产生窗口期均从14天缩短为7天，均缩短50％。

上述参照实施例对猪疫苗用免疫增强剂、其制备方法及应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。