G蛋白信号调节因子6及其抑制剂在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种G蛋白信号调节因子6(Regulator of G protein signaling 6，RGS6)作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中应用。

背景技术：

随着老龄人口的增加，都市化的生活以及生活方式的改变，肥胖、非酒精性脂肪肝病、代谢综合征和糖尿病等代谢异常人群剧增，现已经成为全球性的公众健康的重要危害。

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染和精神因素等多种因素引发的机体胰岛功能减退、胰岛素抵抗，最终导致糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。据统计，全球糖尿病患者已超过3亿人，其中Ⅱ型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)占90％以上，到2030年，患病人数将超过4亿，这意味着在全球20-79岁成年人中将会有7.7％是糖尿病患者。随着发病人群的扩大，防治难度将会不断增加。糖尿病慢性并发症是导致糖尿病患者致死致残的主要原因，不仅累及心脑血管、肾脏、视网膜、神经等重要脏器和组织，肝脏也是其重要的靶器官之一。

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损伤肝因素造成的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病例综合征，对人群的健康造成巨大的威胁，成为西方国家最常见的肝脏疾病。亚洲国家中NAFLD的发病率也在逐年攀升，在城镇地区的发生率甚至高达60％。非酒精性脂肪肝进一步发展成为非酒精性脂肪肝炎，约20％的非酒精性脂肪肝炎最终发展为肝硬化甚至肝脏衰竭^[1]。

现阶段，T2DM合并NAFLD的患病率正逐年增加。研究结果显示，在糖尿病人群中，NAFLD患病率可高达80％^[2]。在有些患者中肝脏脂肪沉积可能是影响其T2DM发展的主要因素^[3]。另一方面，如果T2DM控制不佳或充分发展，不仅促进脂肪肝生成，而且使肝损伤加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维变性、肝硬化及肝细胞癌。T2DM合并NAFLD将大大增加由于肝硬化、肝细胞癌和心血管并发症导致的死亡风险^[4]。目前，虽然控制高脂血症在T2DM伴NAFLD患者中的治疗作用仍有待探究，但是NAFLD的治疗主要包括针对糖尿病和心血管风险因子的积极控制。研究表明，在合并T2DM和NAFLD的患者中，只有噻唑烷二酮类药物吡格列酮显示出肝脏组织学的明显改善。因此未来我们应该制定特异的筛选标准以及治疗方案以期应用于临床T2DM和NAFLD患者，尤其是T2DM和NAFLD合并的患者。

RGS6(Regulator of G protein signaling 6)是一种调节G蛋白信号的蛋白，属于RGS家族中的R7亚家族，能够调控包括神经系统、心血管系统及淋巴细胞活性在内的多种信号通路^[5]，RGS6基因位于人的14号染色体上，RGS6蛋白具有GTP酶活性，能够结合Gα亚单位抑制通过G蛋白偶联受体依赖的信号通路^[6]。研究发现，RGS6蛋白能够抑制细胞分化和增殖，使细胞从细胞分裂周期暂停，从而产生抑制癌症的作用，RGS6与膀胱癌的发病风险相关^[5]，能够抑制乳腺癌的发生及进展^[7]，并与胰腺癌的预后相关^[8]。另外有研究发现RGS6能够通过促进Nox酶的活性增加活性氧的产生，加重酒精诱导的心脏病及酒精性脂肪肝的发生发展^[9]。

参考文献

[1]Perry R J,Samuel V T,Petersen K F,et al.The role of hepatic lipids in hepatic insulin resistance and type 2diabetes[J].Nature,2014,510(7503):84-91.

[2]Fan JG,Farrell GC.Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in china.J Hepatol.2009；50:204-210

[3]Loria P,Lonardo A,Anania F.Liver and diabetes.A vicious circle.Hepatol Res.2013；43:51-64

[4]Cusi K.Treatment of patients with type 2diabetes and non-alcoholic fatty liver disease:Current approaches and future directions.Diabetologia.2016；59:1112-1120

[5]Berman D M,Wang Y,Liu Z,et al.A functional polymorphism in RGS6modulates the risk of bladder cancer[J].Cancer Res,2004,64(18):6820-6826.

[6]Seki N,Hattori A,Hayashi A,et al.The human regulator of G-protein signaling protein 6gene(RGS6)maps between markers WI-5202and D14S277on chromosome 14q24.3[J].J Hum Genet,1999,44(2):138-140.

[7]Maity B,Stewart A,O'Malley Y,et al.Regulator of G protein signaling 6is a novel suppressor of breast tumor initiation and progression[J].Carcinogenesis,2013,34(8):1747-1755.

[8]Jiang N,Xue R,Bu F,et al.Decreased RGS6expression is associated with poor prognosis in pancreatic cancer patients[J].International Journal of Clinical&amp；Experiment...,2014.

[9]Stewart A,Maity B,Anderegg S P,et al.Regulator of G protein signaling 6is a critical mediator of both reward-related behavioral and pathological responses to alcohol[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2015,112(7):E786-E795.

技术实现要素：

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种RGS6基因的表达与脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一种RGS6作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用，进而提供一种RGS6的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现

本发明以野生型C57小鼠与RGS6基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究RGS6基因的功能，结果发现与野生型WT小鼠对比，RGS6基因敲除小鼠表现出体重减轻，其体重明显低于同种饲料饲养的WT小鼠，并且RGS6基因敲除小鼠的空腹血糖水平低于对照组WT小鼠，RGS6基因敲除小鼠的肝功能明显优于WT小鼠。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现RGS6基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显改善。从小鼠肝脏大体外观，肝脏重量及肝脏/体重比以及肝功能相关酶活性测定结果等均说明HFD组(High fat diet，高脂饮食)RGS6-KO小鼠脂肪肝病变明显减轻，脂质蓄积显著减少。这表明RGS6基因敲除会缓解脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生，RGS6基因能够促进脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生。

因此，RGS6基因可作为药物靶点，构建RGS6基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物；RGS6基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的目的。例如以RGS6为靶基因，设计可干扰RGS6表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使XX基因沉默来治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病；还可以设计并构建RGS6的突变体，注射后进入细胞，竞争RGS6原形的作用底物，从而抑制RGS6的功能，起到治疗目的；此外，还可以以RGS6为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用RGS6基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制RGS6的分子，从而为脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的治疗提供新的治疗性分子。

针对RGS6的上述功能，提供RGS6作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。

针对RGS6的上述功能，提供RGS6作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

针对RGS6的上述功能，提供RGS6的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物，包含RGS6的抑制剂。

所述的RGS6的抑制剂优选为RGS6基因的siRNA、RGS6基因的RNA干扰载体，RGS6的抗体及其他能够抑制RGS6表达的抑制剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现RGS6的新功能，即RGS6具有恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用。

(2)基于RGS6在恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物提供靶标。

(3)RGS6的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。

附图说明

图1是构建RGS6条件性敲除小鼠的打靶策略图。

图2是WT和RGS6-KO小鼠的体重、空腹血糖结果图；

A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图3是WT和RGS6-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；

A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area under the curve，AUC)比较图(**：p＜0.01vs WT NC组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图4是RGS6-KO和WT小鼠的肝脏重量结果图；

A为肝脏重量统计柱状图，B为肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图(##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图5是WT和RGS6-KO小鼠的肝功测量结果图；

分别采取AST、ALT和ALP对小鼠肝功进行检测。(##：p＜0.01vs WT HFD组)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实验用动物及饲养：

实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6小鼠(WT)和RGS6肝脏特异性基因敲除(RGS6-KO)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，RGS6肝脏特异性基因敲除小鼠(RGS6-KO)由RGS6-floxed小鼠与受蛋白启动子控制、肝细胞特异性表达的Cre转基因小鼠Albumin-Cre(购自The Jackson Laboratory，货号003574)杂交得到。

肝脏特异性RGS6基因敲除小鼠的构建：

根据基因信息，利用CRISPR Design(网址：http://crispr.mit.edu/)分别在内含子4和5中各设计一个CRISPR的打靶位点。靶序列分别为：

RGS6-sRNA 1：GGTCACAGCATCATGCTGTAGGCGA TGG

RGS6-sRNA 2：ggAGTGGACACCACCCGTCTTACAA AGG

此外还设计了一个用于同源修复的供体质粒(Donor Vector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子5、以及两个同向的loxp序列，构建策略见图1。

①打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。

②供体载体(Donor Vector)的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp中，得到Donor Vector。

表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点

③打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体(pST1374-Cas9)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGE mMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscript^TMKit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)进行纯化。

④RGS6-floxed条件性敲除小鼠的制作

将上述成熟的mRNA产物与供体质粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得RGS6-floxed纯合小鼠。

⑤肝脏特异性RGS6基因敲除小鼠的制作

将上述RGS6-floxed小鼠与肝脏特异性Albumin-Cre转基因小鼠交配，筛选得到RGS6^{floxed/floxed}/Albumin-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到肝脏细胞特异性RGS6基因敲除小鼠。

实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。

饲养环境及条件：SPF级实验动物中心，室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

【实施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)获得

(1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和RGS6-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。

(2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：

采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确RGS6基因对脂肪肝、Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和RGS6-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔4周检测1次。实验第14周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第16周终末取材。

【实施例2】小鼠体重、血糖水平测定

(1)小鼠空腹体重，食量检测

1)体重检测。

①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。

②称重：分别在第0周、4周、8周、12周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测：待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。

(2)空腹血糖水平检测实验

将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。

①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。

Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，体重、血糖变化结果如图1所示，给与RGS6-KO小鼠12周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第2周开始HFD组的RGS6-KO小鼠体重明显低于HFD组的WT小鼠体重，一直持续到第12周(见图2A)；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第4周的空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的RGS6-KO小鼠空腹血糖水平也明显低于WT组小鼠空腹血糖水平(见图2B)。表明RGS6基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，RGS6基因能显著降低小鼠的糖代谢能力，表明RGS6基因在高脂诱导引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。

【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

实验第12周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。

(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。

(2)先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。

进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第12周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和RGS6-KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后30分钟，KO组小鼠血糖水平稍微下降，60分钟后WT组小鼠血糖水平开始下降，但二者仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且RGS6-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于低于WT小鼠的血糖水平(图3A)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(area under the curve，AUC)，发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，RGS6-KO HFD组的AUC显著小于WT HFD组的AUC(图3B)，表明RGS6对维持糖代谢稳态具有强大的调控能力。

【实施例4】肝脏大体外观及肝脏组织脂质成分测定

(1)终末肝脏组织取材

1)小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。

2)用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。

(2)肝功能测定

1)开启电脑labman软件，打印机，再开启生化分析仪；

2)选择并清洗检测探针、比色杯等，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；

3)将待检测的血清标本从-80℃冰箱中找出；将待检测的血清在室温下复融至液态，准备检测；

4)在labman软件上检查所需检测指标试剂是否足够，设定检测指标和检测顺序等；

5)加入待检血清样品50μl，开始检测；

6)待检测完毕后记录检测数值。

肝脏重量及肝脏重量与小鼠体重比值结果见图4所示，在HFD组的RGS6-KO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠低(如图4)。进一步肝功能检测表明，HFD组小鼠肝功明显较NC组差，而RGS6-KO小鼠的三种肝酶(AST(谷草转氨酶)、ASLT(谷丙转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶))均较HFD组的WT小鼠更低(如图5)。这些结果说明RGS6基因敲除小鼠的脂肪肝明显好转。

上述结果显示RGS6-KO小鼠在HFD的诱导下发生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病变显著减轻。这些结果表明RGS6基因对加重Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明RGS6基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着重要的促进作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> G蛋白信号调节因子6及其抑制剂在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> RGS6-sRNA1

<400> 1

ggtcacagca tcatgctgta ggcgatgg 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> RGS6-sRNA2

<400> 2

ggagtggaca ccacccgtct tacaaagg 28

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> RGS6 LA-F

<400> 3

tcgagtgccc accatgagca gagggagtca tcatcggtgc catcggacgt 50

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> RGS6 LA-R

<400> 4

ccgatggcac cgatgatgac tccctctgct catggtgggc ac 42

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> RGS6 M-F

<400> 5

ccggaattcc ctacagcatg atgctgtgac 30

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> RGS6 M-R

<400> 6

cgggatccta agacgggtgg tgtccact 28

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> RGS6 RA-F

<400> 7

cgcgtcaaag gagagctggg gcactcagag aatggcctcg gctttgc 47

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> RGS6 RA-R

<400> 8

ggccgcaaag ccgaggccat tctctgagtg ccccagctct cctttga 47