百里香酚在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用的制作方法

本发明涉及百里香酚在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，属于医药领域。

背景技术：

沙门氏菌是引发人类和动物食物中毒的首要食源性病原菌之一，也是在全球公共卫生学上有重要意义的人兽共患病原菌。该病原菌在自然界有广泛的宿主谱，绝大多数对人和动物均适应。沙门氏菌感染动物后常导致严重的疾病，主要侵害低龄动物，导致伤寒、败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症，并可引起怀孕母畜流产和死胎等致死性感染，其中危害比较严重的有鸡白痢、猪败血症、肠炎及副伤寒，给畜禽养殖业带来严重的经济损失，甚至严重威胁公共健康和食品安全。

目前针对沙门氏菌感染，普遍采用抗生素进行治疗，但由于抗生素的长期使用和滥用及其不可避免的易诱导耐药性等因素导致了沙门氏菌耐药性日益严重，耐药谱逐渐加宽。这一现象对于临床上沙门氏菌感染的治疗更是雪上加霜。因此临床上迫切需要寻求新的抗感染策略及药物来预防和治疗沙门氏菌感染。

近年来研究发现病原菌的致病力与其分泌的各种毒力蛋白或效应蛋白密切相关，但上述蛋白分子不是细菌生命所必需成分。因此，以细菌特异性用于感染宿主细胞的蛋白或者蛋白复合物为靶标的药物，不仅可发挥抗感染作用，且其对细菌产生的选择压力小，不易诱导耐药性。Ⅲ型分泌系统(T3SS)广泛的分布于革兰氏阴性细菌中，其主要功能是分泌和转运病原菌毒力因子。对于沙门氏菌，其致病力便是通过两套T3SS系统分泌效应蛋白，分别介导细菌侵入和在胞内的增殖，在其致病过程中起着决定性作用。

本研究以沙门氏菌Ⅲ型分泌系统为药物靶标，发现天然化合物百里香酚显著抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的分泌功能。从体内外研究发现，百里香酚显著抑制沙门氏菌内化入细胞的水平并且对沙门氏菌感染小鼠保护率高达70％。为畜禽养殖降低或替代抗生素的应用和临床上有效防治沙门氏菌及其它革兰氏阴性菌感染提供新的研发策略和先导化合物。

百里香酚(Thymol)，主要存在于百里香草、麝香草、牛至全草、香青兰全草等植物中，具有多种药理学活性，如局麻、祛痰、抗炎、驱虫等药理作用。在临床医学占用重要的地位。但是目前国内外未见百里香酚通过抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能而达到抗沙门氏菌感染的报道。

技术实现要素：

百里香酚(Thymol)的分子结构如下：

本研究以沙门氏菌Ⅲ型分泌系统为药物靶标，发现天然化合物百里香酚显著抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的分泌功能。从体内外研究发现，百里香酚显著抑制沙门氏菌内化入细胞的水平并且对沙门氏菌感染小鼠保护率高达70％。为畜禽养殖降低或替代抗生素的应用和临床上有效防治沙门氏菌及其它革兰氏阴性菌感染提供新的研发策略和先导化合物。

本发明通过人宫颈癌细胞(Hela)损伤的保护性试验以及小鼠沙门氏菌感染模型证实其在抗沙门氏菌感染中的作用。

附图说明

附图1：百里香酚对沙门氏菌生长的影响(横轴为细菌的生长时间，纵轴为细菌的OD_600nm值)附图2：百里香酚显著抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能(WT为野生型沙门氏菌，Δinva为Ⅲ型分泌系统缺失株，WT+0.2mM thymol为用0.2mM的药物浓度处理后的沙门氏菌)

附图3：百里香酚显著抑制沙门氏菌内化宿主细胞(WT为野生型沙门氏菌，Δinva为Ⅲ型分泌系统缺失株，ΔsipA为效应蛋白sipA缺失后的菌株，WT+0.2mM thymol为用0.2mM的药物浓度处理后的沙门氏菌)

附图4：百里香酚沙门氏菌感染小鼠有显著的保护作用(横轴为感染的时间，纵轴为死亡率。thymol单纯的药物组，Δinva为感染Ⅲ型分泌系统缺失株，WT+thymol为百里香酚治疗组，WT为感染野生型沙门氏菌)

附图5：百里香酚抑制沙门氏菌感染小鼠引起的体重下降(横轴为感染时间，纵轴为体重变化)

附图6：百里香酚缓解沙门氏菌感染小鼠的盲肠组织病变(上图：眼观病理变化；下图：病理组织切片观察；)

附图7：百里香酚对沙门氏菌感染小鼠靶器官菌落定殖量计数的检测(横轴为盲肠、肝脏和脾脏的不同的处理组，纵轴为菌落定殖情况)

附图8：百里香酚对沙门氏菌感染小鼠肠道炎症因子检测(横轴为不同的处理组，纵轴为不同细胞因子的含量)

附图9：蛋白质谱方法分析百里香酚对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的影响

附图10：体外生化手段验证百里香酚影响沙门氏菌Ⅲ型分泌系统多种效应蛋白

附图11：点击化学方法验证百里香酚直接结合于效应蛋白SipA的两部分区域

附图12：圆二色谱分析百里香酚影响了效应蛋白SipA二级构像(横轴吸收波长，纵轴为毫度)

附图13：体外生物化学方法验证蛋白酶Lon酶解了二级构像发生变化的效应蛋白SipA

具体实施方式

1.沙门氏菌III型分泌系统抑制剂的筛选

以β-内酰胺酶-SipA融合及其荧光底物CCF-4检测受试化合物对Ⅲ型分泌系统功能的影响。

2.百里香酚对沙门氏菌生长的影响

将沙门氏菌于LB(含0.3M NaCl)液体培养基内过夜培养(37℃，200rpm),1:100扩大培养至OD_600nm值为0.1左右，分别设定阳性组和不同浓度的药物处理组。继续培养，并且没隔30min测定其各个样品的光密度值，直至平台期。实验结果表明：百里香酚在0.6mM的药物浓度下出现亚抑菌的想象，但是0.4mM药物浓度下并不影响细菌的生长。(见附图1)。

3.验证百里香酚抑制Ⅲ型分泌系统分泌功能

将含有报告系统的菌株和百里香酚共同孵育培养4h，以Hela细胞为载体，以MOI＝20感染宿主细胞30min，使用PBS清洗细胞三次，随后加入CCF4荧光底物观察感染细胞的颜色变化，并且使用流式细胞仪定量眼观结果。分别设定为野生株组(WT)、药物处理组(WT+0.2mMthymol)、阴性对照Ⅲ型分泌系统缺失株组(Δinva)。实验结果表明：百里香酚显著抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能。从流式细胞图可知，百里香酚处理后，沙门氏菌Ⅲ型分泌系统执行分泌的功能显著下降(从88％降致3.03％)(见附图2)。

4.百里香酚对沙门氏菌感染宿主细胞的保护作用

将百里香酚与沙门氏菌共同孵育培养4h，分别设定沙门氏菌野生株组、ΔsipA缺失株组、ΔinvA缺失株组和药物处理组。以相同方式感染细胞大约30min，4％甲醛固定细胞，荧光标记胞外细胞，透化处理后，荧光标记胞内和胞外细胞。激光共聚焦显微镜下观察，不同处理组细胞内化的菌量变化(即胞内和胞外染色实验)。实验结果表明：药物处理后沙门氏菌侵染宿主细胞的能力显著下降并且呈现药物梯度性，在0.2mM的药物浓度下其几乎丧失了侵染细胞的能力与ΔinvA缺失株组相当(见附图3)。

5.百里香酚对小鼠沙门氏菌感染的保护作用

5.1建立小鼠沙门氏菌感染模型

应用链霉素处理6-8周龄小鼠，感染前对其禁水6h，采用口服感染的方式灌服沙门氏菌，建立小鼠感染沙门氏菌肠炎模型。

5.2保护率实验

应用链霉素处理6-8周龄小鼠，并于感染前1天给予百里香酚(100mg/kg)。感染前对预处理小鼠禁水6h，以10⁶的菌量感染小鼠同时给予百里香酚(100mg/kg)进行药物治疗，分别于感染后1-10天内统计不同处理组小鼠的体重变化。分别设定为沙门氏菌感染组(WT)、药物治疗组(WT+thymol)、Ⅲ型分泌系统缺失株感染组(Δinva)和药物对照组(thymol)。实验结果表明：沙门氏菌感染小鼠在第五天开始出现死亡，在第六天和第七的死亡率分别为80％和100％。而药物处理组小鼠在第七天开始出现死亡，在感染后十天的保护率为70％(见附图4)。

5.3测定体重指标

应用链霉素处理6-8周龄小鼠，并于感染前1天给予百里香酚(100mg/kg)。感染前对预处理小鼠禁水6h，以5*10⁷的菌量感染小鼠同时给予百里香酚(100mg/kg)进行药物治疗，分别于感染后1-10天内统计感染后小鼠的死亡个数及死亡率。分别设定为沙门氏菌感染组(WT)、药物治疗组(WT+thymol)、Ⅲ型分泌系统缺失株感染组(Δinva)和药物对照组(thymol)。实验结果表明：沙门氏菌感染小鼠与其他组小鼠的体重在第四天表现出显著差异，第六天表现出极显著差异(见附图5)。

5.4组织病理学研究

选取小鼠的盲肠组织，甲醛固定，HE染色，于电子显微镜下观察百里香酚治疗前后小鼠结肠的组织病理学变化。实验结果表明:阳性感染组盲肠组织重量与其他处理组有显著差异。组织切片观察发现阳性感染组小鼠基底膜增厚、上皮细胞损害严重、杯状细胞和中性粒细胞低于5％。而药物治疗组小鼠，组织切片显示仅有轻微的上皮细胞损害和杯状细胞减少的现象(见附图6)。

5.5靶器官菌落定殖量计数

感染后第五天摘取不同处理组小鼠的盲肠、肝脏和脾脏组织，称重研磨制备10％的组织匀浆液，倍比稀释后涂于含有链霉素的平板并计数。实验结果表明：药物治疗后，小鼠靶器官菌落定殖量显著减少，与阳性组小鼠表现出显著的差异(见附图7)。

5.6肠道炎症因子测定

将10％的盲肠组织匀浆液，离心去匀浆液取上清，使用ELISA试剂盒检测器官裂解液中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量。实验结果表明：药物治疗后，小鼠盲肠的细胞因子含量显著减少，与阳性组小鼠表现出显著的差异(见附图8)。

5.7蛋白质谱分析

将沙门氏菌在LB(含0.3M NaCl)液体培养基培养至OD_600nm＝0.9。百里香酚的作用浓度为0.2mM。通过蛋白质谱仪分析药物处理后沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的蛋白量的变化。实验结果表明：百里香酚处理后，沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的主要效应蛋白sipABCD和调控蛋白HilA出现显著减少的现象(见附图9)。

5.8体外生化验证百里香酚影响沙门氏菌Ⅲ型分泌系统多种毒力蛋白

将过夜培养的沙门氏菌以1:20的比例扩大培养同时加入0.2mM的百里香酚，共同孵育培养4h。取10⁹的菌量，离心收集菌体，使用100μl SDS-PAGE Buffer垂悬菌体，煮沸5min。跑SDS-PAGE凝胶，通过Western-Blot检测药物处理后效应蛋白的量。实验结果表明：药物处理后效应蛋白sipAB调控蛋白HilA的量显著减少(见附图10)。

5.9点击化学方法验证百里香酚结合于效应蛋白sipA的两个结构区域

应用点击化学(Click chemistry)的方法，以铜催化叠氮炔环加成反应，制备炔烃-百里香酚荧光探针，将荧光标记后的百里香酚与沙门氏菌野生株裂解上清冰浴作用，通过蛋白组化学分析的方法，应用多功能激光扫描成像系统分析百里香酚与SipA是否发生互作。体外构建sipA(27-270)和sipA(497-669)重组质粒，将其转入BL21(DE3)表达菌株中。挑取BL21(DE3)-sipA(27-270)和BL21(DE3)-sipA(497-669)单菌落，过夜培养。以1:50的比例扩大培养2h，加入0.2mM修饰后的百里香酚作用1h，加入1mM的IPTG 20℃诱导16h。收集菌体，超声裂解菌体，离心取上清通过亲和层析的方法纯化未用药物处理和用药物处理蛋白。分别吸取0.4mg的不同处理组蛋白做点击化学反应，运用Typhoon 7000检测蛋白上的荧光强度。实验结果表明：百里香酚直接作用于效应蛋白sipA的两个不同区域(见附图11)。5.10圆二色谱分析百里香酚对效应蛋白sipA的二级结构影响

挑取BL21(DE3)-sipA(27-270)和BL21(DE3)-sipA(497-669)单菌落，过夜培养。以1:50的比例扩大培养2h，加入0.2mM百里香酚作用1h，加入1mM的IPTG 20℃诱导16h。收集菌体，超声裂解菌体，离心取上清通过亲和层析的方法纯化未用药物处理和用药物处理蛋白。分别吸取0.2mg的不同处理组蛋白用于圆二色谱分析。实验结果表明：百里香酚处理后，效应蛋白sipA的不同区域，在208nm处有显著变化(见附图12)。

5.11体外生化方法验证lon蛋白酶降解发生构像变化的sipA

挑取BL21(DE3)-sipA(27-270)和BL21(DE3)-sipA(497-669)单菌落，过夜培养。以1:50的比例扩大培养2h，加入0.2mM百里香酚作用1h，加入1mM的IPTG 20℃诱导16h。收集菌体，超声裂解菌体，离心取上清通过亲和层析的方法纯化未用药物处理和用药物处理蛋白。分别吸取0.2mg的不同处理组蛋白与0.2mg的lon蛋白酶共同孵育作用30min同时加入ATP。实验结果表明：lon蛋白酶降解了发生构像变化的蛋白sipA(见附图13)。

综上所述，本研究以沙门氏菌感染哺乳动物细胞，建立细胞感染水平的药物保护效果评价模型。以口服感染沙门氏菌的方式成功建立了沙门氏菌动物感染模型，并且发现百里香酚可显著降低沙门氏菌感染小鼠的死亡率，缓解沙门氏菌感染小鼠的肠道炎症并抑制感染小鼠体重的下降，表明百里香酚治疗后可明显改善沙门氏菌感染小鼠的肠道炎症反应。进一步的机制研究发现，百里香酚通过改变效应蛋白sipA的二级结构，而使其易被蛋白酶lon降解。