一种野马追有效部位的制备方法与流程

本发明属于中药及天然药物技术领域，具体涉及一种野马追有效部位的制备方法。

背景技术：

野马追为菊科植物轮叶泽兰(Eupatorium lindleyanum DC.)的干燥地上部分，又名白鼓钉、化食草、毛泽兰。具有清热解毒、祛痰定喘、降血压、利尿消肿等功效，主要用于治疗慢性气管炎、支气管炎、高血压病，由其制成的野马追糖浆在临床上应用广泛，对一般咳嗽、慢性气管炎、支气管炎具有十分良好的效果。

现代研究表明，野马追中活性部位主要为野马追内酯A、野马追内酯B等倍半萜内酯类成分。

图1野马追代表性成分结构图（1:野马追内酯A;2:野马追内酯B）

已有专利“野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用”（申请号：201410239824.4）公开了一种野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用，即采用大孔树脂吸附及ODS反相硅胶色谱柱从野马追中分离获得野马追倍半萜部位，该部位中含有野马追内酯F、野马追内酯G、野马追内酯H、野马追内酯I和野马追内酯K，并采用药理实验证实了其具有抗急性肺损伤的活性。但该专利中存在的主要不足在于，一是申请公开的野马追倍半萜部位制备方法是采用大孔树脂吸附及ODS反相硅胶色谱联用，这种制备方法中不仅采用了甲醇等有毒有机溶剂，而且反相硅胶色谱技术生产成本昂贵（填料成本约6000-10000元/kg），大型设备缺乏，后续难以实现产业化；二是制得的野马追有效部位中未见《中国药典》要求必须含有的倍半萜内酯成分—野马追内酯A，亦有文献表明野马追中倍半萜内酯类成分主要为野马追内酯A和野马追内酯B，因而该有效部位的组成存在一定的缺陷。

综上，虽然野马追药材及其制剂在临床已有广泛应用，但相对简便、绿色的有效部位制备方法并未有相关研究，这也限制了野马追药材的的深入开发及应用。

本发明充分考虑了野马追中萜内酯成分与其它杂质类型成分（糖、蛋白、水溶性色素、黄酮、生物碱）结构与理化特征的差异，采用了绿色、简便、宜于产业化的大孔树脂-超临界萃取联用的制备工艺，其主要原理在于：野马追萜内酯类成分极性相对较弱，但由于结构中又含有多羟基，因此具有一定的水溶性，这类成分可被非极性至弱极性大孔树脂很好地吸附精制，这一过程可除去水溶性大分子物质如糖、蛋白、水溶性色素等（黄酮类、生物碱等因可被树脂吸附无法去除）；进一步利用该类成分的分子结构相对较小，极性较弱的特性，适宜于超临界萃取，因此在大孔树脂精制的基础上，进一步以超临界萃取分离技术，可除去一些黄酮、生物碱类成分，获得理想的野马追萜内酯有效部位，可为野马追临床应用及制剂开发提供依据。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题，是提供一种野马追有效部位的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种野马追有效部位的制备方法，包括如下步骤：

（1）取野马追药材，经0～60%乙醇提取，减压回收提取液，再加水使药液中每毫升含生药量0.1～1.0g，通过大孔树脂色谱柱，先以1～3倍柱体积水洗脱，再以1～3倍柱体积60～95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.20～1.35稠膏；

（2）取稠膏，加入5～20倍重量的吸附剂，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力15～40MPa，萃取温度35～55℃，夹带剂用量为5%～50%，分离压力4～10MPa，分离斧温度30～40℃，萃取时间1～5小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即野马追有效部位，该部位以HPLC法测得的倍半萜内酯总含量为50～85%。

以上所述的野马追有效部位的制备方法，其特征在于：

（1）取野马追药材，经30%乙醇提取，减压回收提取液，再加水使药液中每毫升含生药量0.5g，通过大孔树脂色谱柱，先以2倍柱体积水洗脱，再以2倍柱体积85%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25稠膏；

（2）取稠膏，加入10倍重量的吸附剂，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力25MPa，萃取温度55℃，夹带剂用量为25%，分离压力6MPa，分离斧温度30℃，萃取时间3小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即野马追有效部位，该部位以HPLC法测得的倍半萜内酯总含量为55～75%。

以上所述的野马追有效部位的制备方法，其特征在于，所用大孔树脂的类型为非极性或弱极性型大孔树脂，与野马追药材的重量比为2∶1～4。

以上所述的野马追有效部位的制备方法，其特征在于，所述吸附剂为常规粉末状吸附剂硅胶、氧化铝、硅藻土或活性炭的一种。

以上所述的野马追有效部位的制备方法，其特征在于，所述夹带剂为60～100%乙醇。

有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优点：

（1）本发明采用的大孔树脂吸附—超临界CO₂萃取联用技术制备野马追有效部位，是充分利用了野马追倍半萜内酯与其它类型成分的结构性质差异，即该类成分为含多羟基的倍半萜类成分，具有被非极性及弱极性大孔树脂吸附的性质，同时该类成分结构较小、极性较弱，可进一步通过超临界CO₂萃取纯化，两种技术联用可去除黄酮、三萜、糖类等多种杂质成分，获得倍半萜内酯部位。

（2）制备方法中大孔树脂柱可重复使用，超临界CO₂萃取生产成本相对较低，且工艺过程中仅使用水或乙醇作为溶剂，不使用有毒有机溶剂，生产工艺绿色，非常适宜于规模化生产。

为了更好地理解本发明的有益效果，下面以相应的实验作为进一步的说明。

a.大孔树脂对野马追萜内酯的静态吸附及解吸附实验

目的：以野马追内酯A和B为指标，采用静态吸附及解吸附法考察不同大孔树脂对野马追提取液中萜内酯的吸附及解吸附情况，优选适宜的大孔树脂。

材料：取野马追1000g，加50%乙醇水提取2次（10+8倍量），合并，过滤，回收乙醇，再加水至2L（含生药量为0.5g/mL），即得野马追药液；乙醇（食用级）；大孔树脂类型如下：

表1不同大孔树脂类型理化性质

方法和结果：称取各类型大孔树脂5g，共11份，分别加入野马追药液50mL，置25℃水浴振荡器中，吸附12小时，分别取吸附前药液和吸附后的药液，HPLC法测定野马追内酯A和野马追内酯B，计算吸附量（mg）及吸附率(%)，再分别滤过，在各大孔树脂中加入50mL浓度为95%的乙醇溶液，置25℃水浴振荡器中，解吸附12小时，HPLC法测定野马追内酯A和野马追内酯B，计算药液中的解吸附量（mg）及解吸附率（%）。

吸附率（%）=（吸附前药液中野马追内酯A和野马追内酯B含量—吸附后药液中野马追内酯A和野马追内酯B含量)/吸附前药液中野马追内酯A和野马追内酯B含量*100%

解吸附率（%）=野马追内酯A和野马追内酯B的解吸附量/野马追内酯A和野马追内酯B的吸附量*100%

表2不同大孔树脂对野马追药液中倍半萜内酯类成分的吸附及解吸附

结果显示不同大孔树脂对野马追萜内酯的吸附影响较大，总体上看，吸附及解吸附效果以弱极性大孔树脂及非极性大孔树脂为好，中等极性及弱极性树脂的效果相对较差，不宜使用。其中以非极性D101、弱极性ZGDM130的吸附及解吸附效果最佳，HPD300、ZGDM11、HPD722、AB-8次之，其余各类型树脂效果均不太理想。

结论：从吸附及解吸附效率上看，可选用非极性及弱极性树脂对野马追倍半萜内酯进行吸附。

b.不同浓度乙醇下野马追倍半萜内酯在大孔树脂上的解吸附实验

目的：考察不同醇浓度下野马追内酯A、野马追内酯B在D101和ZGDM130大孔树脂上的解吸附情况，优选合适的洗脱溶剂。

材料：a中野马追药液（含生药量为0.5g/mL），D101和ZGDM130大孔树脂，乙醇（食用级）。

方法和结果：称取大孔树脂（D101和ZGDM130）各5份，分别加入野马追药液50mL，置25℃水浴振荡器中，吸附12小时，分别取吸附前药液和吸附后的药液，HPLC法测定野马追内酯A和野马追内酯B吸附量(mg)，再分别滤过，在各大孔树脂中加入50mL不同浓度的乙醇水溶液，置25℃水浴振荡器中，解吸附12小时，测定药液中的解吸附量（mg）。计算其解吸附率。

解吸附率（%）=野马追内酯A和野马追内酯B解吸附量/野马追内酯A和野马追内酯B吸附量*100%

表3不同醇浓度下野马追倍半萜内酯在大孔树脂上的解吸附率（%）

结果显示，随着醇浓度的增加，野马追内酯A和B的解吸附率呈现逐步提高的趋势，当醇浓度在大于40%时，野马追倍半萜内酯即可被解吸附下，当醇浓度大于60%时，其解吸附率超过80%，解吸附效果较好。

结论：野马追内酯半萜内酯类成分在大孔树脂柱上的洗脱溶剂选择为60-95%乙醇。

c.超临界CO2萃取工艺研究

目的：以野马追内酯A、野马追内酯B为指标，采用正交试验法考察超临界CO2萃取工艺。

1.仪器与材料：

超临界CO₂萃取装置及萃取用气体：FY230-40-11型超临界流体萃取装置（南通飞宇石油科技开发有限公司）；CO₂气体为食品级（南京市通广特种气体厂）；Agilent1100高效液相色谱仪；VWD紫外-可见检测器。

取野马追5kg，加50%乙醇水提取2次（10+8倍量），合并，过滤，回收乙醇，再加水至10L（含生药量为0.5g/mL），即得野马追药液，通过D101树脂（树脂量：药材量=1：1），先以2倍柱体积水洗脱，再以2倍柱体积85%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30稠膏，得480g，加入100目硅胶4.8kg，混匀，50℃烘干，粉碎，即得超临界提取前样品。

2.方法与结果

取样品，装入超临界CO₂萃取罐（体积1L），按下表中条件萃取，其余萃取时间为3h，分离压力为6Mpa，分离温度为40℃。考虑到超临界提取时，萃取压力，温度这三个因素最为关键，因此选用L9（3⁴）正交表，以野马追萜内酯中主要成分（野马追内酯A和野马追内酯B）为考察指标，进行了9次试验，优选最佳萃取条件，各因素水平见表4。

表4超临界CO₂提取因素水平表

根据表4，若试验因素水平为A₁B₁C₁，即表示该试验号以萃取压力15Mpa，萃取温度35℃，夹带剂用量为0，萃取时间为3h，解析压力和温度分别为6Mpa和40℃收集萃取物，HPLC测定，计算相对提取率。其余依此类推。

表5超临界CO₂提取正交表

2.2指标的选择

本正交试验选用野马追倍半萜内酯中含量较高、具有活性的成分——野马追内酯A和B为考察对象，HPLC测定，各正交试验萃取物与样品比较，计算相对提取率，将其作为提取是否理想的考核指标。

相对提取率（%）=（萃取液中野马追内酯A+B总含量÷样品中野马追内酯A+B总含量）×100%

2.3结果及分析

根据正交设计表，共进行9次试验，相关试验数据及其计算见下表。

表6超临界CO₂提取正交试验结果表

表7超临界CO₂提取正交方差分析表

由表7的方差分析可以看出，萃取压力与萃取温度对萃取效果影响并不显著，而夹带剂对萃取效果有显著性影响。

由表6的简单计算可以看出，K_2a>K_3a>K_1a，故因素A选择水平2为最佳，即最佳萃取压力为25Mpa；K_3b>K_2b>K_1b，因素B选择水平3，即萃取温度选择为55℃；K_2c>K_3c>K_1c，因素C选择水平2，即夹带剂适宜用量为25%。

2.4结论

从正交试验结果来看，超临界萃取工艺可选择为：以萃取压力15～40MPa，萃取温度35～55℃，夹带剂用量为5%～50%，分离压力4～10MPa，分离斧温度30～40℃，萃取时间1～5小时，从分离斧中收集萃取液，即得。

最佳萃取工艺为：以萃取压力25MPa，萃取温度55℃，夹带剂用量为25%，分离压力6MPa，分离斧温度30℃，萃取时间3小时，从分离斧中收集萃取液，即得。

d.野马追倍半萜内酯部位化痰、止咳、平喘的药理作用实验

1、实验材料

1.1动物

昆明种小鼠，体重18～22g,雌雄各半；豚鼠,雌雄各半，体重200～240g，均购于南京青龙山动物养殖场。

1.2试药

野马追倍半萜内酯部位提取物：实施例一样品。

野马追糖浆：浙江康恩贝制药股份有限公司，批号140513。

复方甘草合剂，广州星群药业股份有限公司，批号140416；浓氨水：AR级,批号140413，西陇化工股份有限公司；苯酚红，AR级,上海化学试剂三厂，批号081220;氨茶碱注射液，每2mL内含氨茶碱0.25g，批号110214，上海现代哈森（商丘）药业有限公司；磷酸组胺：每1mL内含1mg，批号670311，中国医药工业公司上海第十制药厂。

2、实验方法

2.1小鼠呼吸道祛痰实验

取小鼠50只，分为空白组(蒸馏水20g/kg)，阳性药复方甘草合剂对照组(20g/kg)和野马追糖浆组(20g/kg，折合生药量120g/kg)，野马追倍半萜内酯部位小剂量组(0.9g/kg，折合生药量60g/kg)、中剂量组(1.8g/kg，折合生药量120g/kg)、大剂量组(3.6g/kg，折合生药量240g/kg)，连续给药7天，末次用药1h后，每鼠腹腔注射酚红溶液0.5ml/只，30min后脱颈椎处死，仰位固定，解剖分离出气管，并在气管下穿一根丝线以备固定气管插管用。用磨平的9号针头从甲状软骨处插入气管内约0.3cm，用备好的丝线结扎、固定，用1mL注射器吸取5%NaHCO₃溶液0.5ml推注入气管内，反复推抽3次，灌洗呼吸道，最后将灌洗液抽出注入试管中，如此反复操作3次，共冲洗呼吸道9次，吸取5%NaHCO₃溶液，合并灌洗液约1.5ml，1000rpm离心5min后取上清液，在分光光度计波长560nm处测定光密度(OD)，根据酚红的标准曲线计算出分泌液中的酚红含量。

2.2小鼠止咳试验

取小鼠50只，分为空白组(蒸馏水20g/kg),阳性药复方甘草合剂对照组(20g/kg)和野马追糖浆组(20g/kg，折合生药量120g/kg)，野马追倍半萜内酯部位小剂量组(0.9g/kg，折合生药量60g/kg)、中剂量组(1.8g/kg，折合生药量120g/kg)、大剂量组(3.6g/kg，折合生药量240g/kg)，连续给药7天，末次给药后1h将各组小鼠分别置喷雾箱内，用超声波雾化器以相同强度喷入浓氨水气雾，喷雾15s后，立即观察动物咳嗽潜伏期(在吸入氨水气雾后至发生咳嗽所需时间)，并记录2min内的咳嗽次数。

2.3组胺致豚鼠哮喘实验

取豚鼠50只，随机分为5组，空白组(蒸馏水10g/kg)，阳性药氨茶碱对照组(0.125g/kg，ip)和野马追糖浆组(10g/kg，折合生药量60g/kg，ig)，野马追倍半萜内酯部位小剂量组(0.45g/kg，折合生药量30g/kg，ig)、中剂量组(0.9g/kg，折合生药量60g/kg，ig)、大剂量组(1.8g/kg，折合生药量120g/kg，ig)，连续用药7d。末次给药后1h进行引喘实验，将豚鼠置5000mL的密闭钟罩内，以4000～5000mmHg压力喷入2mg/mL磷酸组胺1mL，动物吸入后经过一定的潜伏期，可产生“哮喘”反应。记录喷雾开始至症状出现的时间(以喘吸性抽搐为准)作为潜伏时间，观察5min(300s)，无喘吸性抽搐者引喘潜伏期以300s计算。

2.4数据分析

所有数据均采用t检验，用表示。

3、实验结果

祛痰实验结果显示，与空白组相比，野马追糖浆及野马追倍半萜内酯部位均具有明显的祛痰作用，增强呼吸道排痰功能，同时与野马追糖浆组相比，野马追倍半萜内酯部位中、大剂量效果更好，并具有显著性差异。

表8野马追倍半萜内酯部位对小鼠祛痰作用的影响(n=10)

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与野马追糖浆组比较，^ΔP＜0.05

镇咳实验结果显示，与空白组相比，野马追糖浆及野马追倍半萜内酯部位均具有明显的镇咳作用，能延长咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，同时与野马追糖浆组相比，野马追倍半萜内酯部位小、中、大剂量的效果更佳，并具有显著性差异。

表9野马追倍半萜内酯部位对浓氨水致小鼠咳嗽的止咳作用(n=10)

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与野马追糖浆组比较，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01

平喘实验结果显示，与空白组相比，野马追糖浆及野马追倍半萜内酯部位均具有明显的平喘作用，同时与野马追糖浆组相比，野马追倍半萜内酯部位中、大剂量效果更好，并具有显著性差异。

表10野马追倍半萜内酯部位对豚鼠的平喘作用(n=10)

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与野马追糖浆组比较，^ΔP＜0.05

3、结论

野马追倍半萜内酯具有显著的化痰、止咳、平喘作用，是野马追药材的主要有效部位，同时也发现该有效部位的药理效果比相同生药量的野马追糖浆更强，这可能是由于糖浆生产过程中采用水提取、浓缩、滤过等制备工艺，使得制剂中极性相对较小的倍半萜内酯类成分含量较低所致

附图说明

图1实施例1中野马追药材50%提取液HPLC图

图2实施例1中野马追萜内酯部位精制物HPLC图

图3实施例4中野马追内酯野马追内酯F、K、H、A、B混合对照品HPLC图

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1野马追有效部位制备（一）

（1）提取

取野马追药材5kg，加50%乙醇提取2次，滤过，滤液减压回收，再加水使药液中每毫升含生药量0.5g，备用；HPLC检测图见附图1。

（2）大孔树脂精制

将以上药液通过AB-8型大孔树脂色谱柱（5L），先以2倍柱体积水洗脱，再以2倍柱体积85%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30（50℃）稠膏280g；

（3）超临界萃取精制

取稠膏280g，加入10倍重量的吸附剂，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力30MPa，萃取温度45℃，夹带剂（乙醇）用量为25%，分离压力6MPa，分离斧温度35℃，萃取时间2小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即得53.8g野马追萜内酯有效部位，HPLC检测图见附图2。

实施例2野马追有效部位制备（二）

（1）提取

取野马追药材3kg，加水煎煮醇提取2次，滤过，滤液减压回收至每毫升含生药量1g，备用；

（2）大孔树脂精制

将以上药液通过HPD-400型大孔树脂色谱柱（4L），先以2倍柱体积水洗脱，再以2倍柱体积60%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.28（50℃）稠膏215g；

（3）超临界萃取精制

取稠膏215g，加入5倍重量的吸附剂，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力35MPa，萃取温度50℃，夹带剂（乙醇）用量为20%，分离压力7MPa，分离斧温度30℃，萃取时间3小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即野马追萜内酯有效部位，共30.4g。

实施例3野马追有效部位制备（三）

（1）提取

取野马追药材5kg，加30%乙醇提取2次，滤过，滤液减压回收至每毫升含生药量0.5g，备用；

（2）大孔树脂精制

将以上药液通过D101型大孔树脂色谱柱（8L），先以2倍柱体积水洗脱，再以3倍柱体积70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.31（50℃）稠膏283g；

（3）超临界萃取精制

取稠膏283g，加入15倍重量的吸附剂，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力40MPa，萃取温度40℃，夹带剂（80%乙醇）用量为10%，分离压力7MPa，分离斧温度35℃，萃取时间4小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即野马追萜内酯有效部位，共45.1g。

实施例4野马追有效部位HPLC含量测定

采用HPLC法，对野马追有效部位中主要5个成分进行HPLC含量测定。

（1）材料与仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BP-211D电子天平（赛多利科学仪器有限公司）

野马追对照品：野马追内酯A，野马追内酯B、野马追内酯H、野马追内酯K、野马追内酯F为自制，纯度﹥98%。

野马追萜内酯有效部位：实施例1-3自制的野马追萜内酯部位。

（1）检测方法

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪，VWD检测器，全自动进样器，Agilent工作站

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，水为流动相B，按照下表中规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm。理论塔板数野马追内酯A峰计不少于3000。

对照品溶液的制备：精密称取野马追内酯F、K、H、A、B适量，加甲醇制成每1毫升分别含野马追内酯F为0.125mg，野马追内酯K为0.171mg，野马追内酯H为0.270mg，野马追内酯A为0.152mg，野马追内酯B为0.336mg的混合溶液，即得。HPLC检测图见附图3。

供试品溶液的制备：取装实施例1-3中制得的有效部位0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇使溶解，并定容至刻度，微孔滤膜过滤，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

（2）检测结果

野马追萜内酯有效部位含量测定

结果显示，实施例1-3中野马追萜内酯总含量（%）分别达75.3%、67.2%、64.9%，达到了有效部位的要求。