TMC/京尼平/pDNA纳米载体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因治疗和抗体生产领域，尤其涉及TMC/京尼平/pDNA纳米载体及其制备方法和应用。

背景技术：

随着社会经济的繁荣与进步，健康问题越来越受到人们的重视。在致命的10大疾病中，排名前几的心脏病、恶性肿瘤、脑血管病变、糖尿病严重影响人们的生活，而且这些疾病还呈增长趋势，死亡率也越来越高，趋向于年轻化，这些疾病常常会引起很多并发症。基因治疗给人们带来了曙光，从1990年至今，实现了在生物医药领域和临床上基因治疗对人类疾病进行基因干预治疗，在治疗疾病的潜力得到了认可，比传统治疗疾病的方法有很多不可比拟的优点。基因治疗已经成为当代生命科学领域最具前景性的研究方向。2003年基因组计划的成功，推动了基因治疗的进步。基因治疗旨在改变基因水平，有DNA和mRNA两个水平。2009年美国就有354项关于基因治疗的计划在试行，远远超出了2008年的全球的116项。英国在2014年推出了“十万基因组计划”拟通过对基因组进行测序，有效确定引发癌症及其他疾病的基因。

抗体也是生物科学领域的主力军，最普遍的用法是通过Western blot去揭示细胞中特定蛋白的表达量的多少，抗体另一方面还被用于荧光染色和免疫组化。根据2015年Biocompare发表的一份报告，在科研上用于抗体的生产的市场规模很庞大，并且仍在增长，抗体的种类也越来越多，但是抗体的质量得不到保证，在抗体的购买方面损失了很多的资金，只科研用于抗体市场规模就达到25亿美金，每年因购买质量差的抗体导致的损失达到8亿美金。2015年9月Uhlén和美国实验生物学学会联合会分别举办了关于抗体迫在眉睫的问题的解决的会议，解决方案之一就是抗体的效果的评价。同一种抗体在几次试验下表现出的性质不同，会产生不可预料的结果。斯坦福大学反向DNA疫苗开创一型糖尿病新疗法，这种疫苗是以基因工程技术为基础的反向DNA疫苗，通过靶向抑制异常表达的T细胞保护胰岛B细胞不受伤害，来治疗糖尿病。2015年4月，科学家证明了纳米涂层细菌能有效转运口服DNA疫苗，这种疫苗可以刺激人体的免疫系统发挥作用治疗疾病，主要目的是有效增加口服疫苗生物利用度，寻找一个有效的载体物质。一些常见的方法如基因枪法、电穿孔法、显微注射等方法，但这些方法目前的缺点是无法确保基因进入体内不被降解、无靶向性、会产生机体的免疫反应，目前阳离子聚合物载体作为非病毒型载体已经受到了人们的重视，将潜在的病毒型载体的安全性隐患排除。这种阳离子载体既可应用于基因治疗又可简化疫苗的生产以及DNA疫苗的不成熟性，可保护DNA进入体内不被DNA水解酶水解。常见的阳离子聚合物基因载体毒性低、转染效率高、具有靶向性且在细胞内无明显免疫反应。因此合成以阳离子聚合物为基础的DNA纳米载体载体很有意义和应用前景。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种TMC/京尼平/pDNA纳米载体及其制备方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种TMC/京尼平/pDNA纳米载体，包括包裹pDNA的TMC/京尼平纳米球；所述的TMC/京尼平/pDNA纳米载体粒径在100nm-500nm。

本发明还提供一种制备上述的TMC/京尼平/pDNA纳米载体的方法，通过单体壳聚糖合成三甲基壳聚糖，通过交联剂京尼平，先形成纳米球，再将DNA载入纳米球中。

步骤如下：

（一）制备碘化三甲基壳聚糖

（1）分别称取研碎的脱乙酰度DD=80%-95%的壳聚糖、2.3倍壳聚糖摩尔量的NaI、 2.3倍壳聚糖摩尔量的质量分数为15%NaOH溶液、10倍壳聚糖摩尔量的CH₃I溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮中，得到混合溶液；将混合溶液在40-60℃条件下水浴1h，然后将混合溶液离心进行分离，通过乙醚对沉淀洗涤2次、过滤除去乙醚后再将沉淀溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中后在40-60℃条件下水浴1h；

（2）再次称取与上步等量的NaI、NaOH溶液、CH₃I依次加入上步1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，在40-60℃条件下水浴0.5h后再加入与NaI等摩尔量的CH₃I和0.5倍NaI摩尔量的NaOH继续搅拌1h，得到碘化三甲基壳聚糖产品；

（二）制备去碘化的三甲基壳聚糖

将上步所得碘化三甲基壳聚糖产品溶解在10%的NaCl溶液中，进行脱碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，对沉淀用乙醚与乙醇交替洗涤后离心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基壳聚糖产品；

（三）TMC/京尼平纳米球的制备

称取上述制备的三甲基壳聚糖溶解在体积分数为1%的乙酸溶液中，室温下逐滴加入与三甲基壳聚糖摩尔比1:1的质量分数为0.5%的京尼平溶液，边滴边搅拌，反应中颜色变化后再持续搅拌进行6h，即制得TMC/京尼平纳米球；

（四）TMC/京尼平/pDNA纳米载体纳米球的制备

（1）将上步所得TMC/京尼平纳米球通过0.22µm滤膜进行灭菌操作，放入无菌操作台备用。

（2）将（1）中的TMC/京尼平溶液取1mL加入离心管1中，另取药用量的pDNA加入离心管2中，加入无菌水稀释至2µg/mL；向离心管1中分批加入稀释后的pDNA后涡旋30s,再将离心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得到TMC/京尼平/pDNA纳米载体纳米球。

作为优选项：所述步骤（二）中水浴过程中通过使用醇沉法加入5倍体积的乙醇溶液进行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH₃I，离心得到去碘化三甲基壳聚糖。

本发明中TMC/京尼平纳米球作为阳离子聚合物纳米粒，可以通过静电作用与pDNA结合，起到保护pDNA的作用，可以与不同浓度的pDNA结合，形成的纳米球粒径和电位均有所不同；粒径和带电荷的不同使纳米粒子进入细胞体内进行基因治疗和对抗体生产的影响不同；阳离子聚合物载体的分散性好，尺寸可控，稳定性好，与pDNA凝集很稳定，整体带正电荷，第三种电荷反转复合物可以在不同pH条件下进行电荷反转，更加有利于载体进入细胞。

本发明还提供TMC/京尼平/pDNA纳米载体在基因治疗和抗体生产领域的应用。

本发明的DNA纳米载体，可以与不同浓度的可以表达绿色荧光蛋白的pDNA进行结合，从而可以对各个环节进行综合评价，更好的用于生物检测。

壳聚糖衍生物分别是天然的非病毒型载体和合成型的非病毒型载体，主要表现在其安全性可降解性、生物相容性、释药可控性、转染效率高。在一定程度上保证DNA纳米载体整体带正电荷，采用复凝集法制备阳离子聚合物的DNA纳米载体。在特定pH条件下，在水中分散性很好，粒径分布均匀。

TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平/pDNA纳米载体分别以天然阳离子聚合物和合成阳离子聚合物对于DNA的结合程度，毒性大小以及粒径分布产生影响。

综上所述，本发明的优点和有益效果为：

1、本发明制备方法工艺简单，成本低；

2、本发明制备的纳米颗粒稳定性好，并且在水中分散性好，粒径可控；

3、本发明制备的pDNA纳米载体比在PBS和油相中尺寸和带电荷量影响更小；

4、本发明制备的纳米颗粒比两单体的物质稳定性更好，更能改变整个物质的电荷分布，更加适合基因治疗和抗体生产的应用。

附图说明

图1为本发明中三甲基壳聚糖的制备过程示意图；

图2为本发明制备的载体进入细胞示意图。

具体实施方式

制备TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平/pDNA纳米载体，包括如下实验步骤：

（1）制备TMC(三甲基壳聚糖)

①称取一定量研碎的壳聚糖（DD=80%-95%），NaI固体, NaOH溶液、CH3I溶液加入含有1-甲基-2-吡咯烷酮的烧瓶中40-60℃水浴1h.通过乙醇溶液将反应产物进行沉淀，通过离心进行分离。上述所得产品通过乙醚洗涤2次过滤除去乙醇。

②将①中的产物溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中40-60℃水浴，量取一定量的NaI固体, NaOH溶液、CH3I加入含有1-甲基-2-吡咯烷酮溶液的烧瓶中，40-60℃水浴0.5h.再加入CH3I和NaOH固体继续搅拌1h.

③碘化三甲基壳聚糖去碘化 将上述制备的产品溶解在10%的NaCl溶液中，代替盐酸，进行脱碘化。用乙醇沉淀此聚合物，用乙醚与乙醇交替洗涤并离心，通过真空干燥得到白色粉末。

（2）制备TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平纳米球

称取一定量上述制备的三甲基壳聚糖溶解在体积分数为1%的乙酸溶液中，室温下按照一定配比混合逐滴加入质量分数为0.5%的京尼平溶液，边滴边搅拌，反应进行15min后颜色变化，反应持续进行6h.制得TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平纳米球。

(3）制备TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平/pDNA纳米载体

将制得的TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平纳米球使用0.45µm的滤膜进行处理，pDNA(0.1mg/mL)分批加入到壳聚糖纳米球溶液中，分别涡旋30s后，将离心管放入孵育器中37℃进行培养1h.既可制得TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平/pDNA纳米载体。

以下实施例描述了本发明的特殊实施例子，以便对本发明作进一步的说明，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不仅仅局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本专利的原理，利用其他类似材料或反应条件实现本发明所描述的DNA纳米载体的制备，这些不脱离本发明描述的基本概念。因此，这些修改或不同的应都在本发明的覆盖范围内。

实施例1

1、制备碘化三甲基壳聚糖

称取2g研碎的壳聚糖（DD=80%-95%），4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、11.5mlCH3I溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮中60℃水浴1h.反应过程中需要冷凝CH3I通过乙醇溶液将进行沉淀，通过离心进行分离。上述所得产品通过乙醚洗涤2次过滤除去乙醇。

2、将1中的产品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中60℃水浴，移除吸附在碘化三甲基壳聚糖多余的乙醚。量取4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、7mlCH3I依次加入80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，60℃水浴0.5h.再加入2mlCH3I和0.6gNaOH继续搅拌1h.

3、 制备去碘化的三甲基壳聚糖

将2中制备的将上步所得碘化三甲基壳聚糖产品溶解在10%的NaCl溶液中，进行脱碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，对沉淀用乙醚与乙醇交替洗涤后离心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基壳聚糖产品；

所述乙醇沉淀的具体操作为使用醇沉法加入5倍体积的乙醇溶液进行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH3I，离心得到去碘化三甲基壳聚糖。

4 、TMC/京尼平纳米球的制备

称取10mg上述制备的三甲基壳聚糖溶解在10ml体积分数为1%的乙酸溶液中，室温下逐滴加入2ml质量分数为0.5%的京尼平溶液，边滴边搅拌，反应进行15min后颜色变化，反应持续进行6h.制得TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平纳米球。

5、 TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平/pDNA纳米载体纳米球的制备

（1）、将4中的TMC/京尼平纳米球通过0.22µm滤膜进行灭菌操作，放入无菌操作台备用。

（2）、将（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入离心管1中，取10µlpDNA(3kb)加入2ml离心管2中，加入无菌水稀释至100µl，分批加入稀释后的pDNA,涡旋30s混合溶液,将离心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。

实施例2

1、制备碘化三甲基壳聚糖

称取2g研碎的壳聚糖（DD=80%-95%），4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、11.5mlCH3I溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮中40℃水浴1h.反应过程中需要冷凝CH3I通过乙醇溶液将进行沉淀，通过离心进行分离。上述所得产品通过乙醚洗涤2次过滤除去乙醇。

2、将1中的产品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中40℃水浴，移除吸附在碘化三甲基壳聚糖多余的乙醚。量取4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、7mlCH3I依次加入80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，40℃水浴0.5h.再加入2mlCH3I和0.6gNaOH继续搅拌1h。

3 、制备去碘化的三甲基壳聚糖

将2中制备的将上步所得碘化三甲基壳聚糖产品溶解在10%的NaCl溶液中，进行脱碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，对沉淀用乙醚与乙醇交替洗涤后离心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基壳聚糖产品；

所述乙醇沉淀的具体操作为使用醇沉法加入5倍体积的乙醇溶液进行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH3I，离心得到去碘化三甲基壳聚糖。

4、 TMC/京尼平纳米球的制备

称取10mg上述制备的三甲基壳聚糖溶解在10ml体积分数为1%的乙酸溶液中，室温下逐滴加入2ml质量分数为0.5%的京尼平溶液，边滴边搅拌，反应进行15min后颜色变化，反应持续进行1h，制得TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平纳米球。

5、TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平/pDNA纳米载体纳米球的制备

（1）、 将4中的TMC/京尼平纳米球通过0.22µm滤膜进行灭菌操作，放入无菌操作台备用；

（2）、 将（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入离心管1中，取10µlpDNA(5kb)加入2ml离心管2中，加入无菌水稀释至2ug/ml，分批加入稀释后的pDNA,涡旋30s混合溶液,将离心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。

实施例3

1、制备碘化三甲基壳聚糖

称取1g研碎的壳聚糖（DD=80%-95%），2.4gNaI,5.5ml15%NaOH溶液、5.75mlCH3I溶解在40ml1-甲基-2-吡咯烷酮中60℃水浴1h.反应过程中需要冷凝CH3I通过乙醇溶液将进行沉淀，通过离心进行分离。上述所得产品通过乙醚洗涤2次过滤除去乙醇。

2、将1中的产品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中60℃水浴，移除吸附在碘化三甲基壳聚糖多余的乙醚。量取2.4gNaI,5.5ml15%NaOH溶液、3.5mlCH3I依次加入40ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，60℃水浴0.5h.再加入1mlCH3I和0.3gNaOH继续搅拌1h;

3、 制备去碘化的三甲基壳聚糖

将2中制备的将上步所得碘化三甲基壳聚糖产品溶解在10%的NaCl溶液中，进行脱碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，对沉淀用乙醚与乙醇交替洗涤后离心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基壳聚糖产品；

所述乙醇沉淀的具体操作为使用醇沉法加入5倍体积的乙醇溶液进行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH₃I，离心得到去碘化三甲基壳聚糖。

4 、TMC/京尼平纳米球的制备

称取5mg上述制备的三甲基壳聚糖溶解在5ml体积分数为1%的乙酸溶液中，室温下逐滴加入1ml质量分数为0.5%的京尼平溶液，边滴边搅拌，反应进行15min后颜色变化，反应持续进行6h，制得TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平纳米球。

5、 TMC（三甲基壳聚糖）/京尼平/pDNA纳米载体纳米球的制备

（1）、 将4中的TMC/京尼平纳米球通过0.22µm滤膜过滤后进行灭菌操作，放入无菌操作台备用。

（2）、将（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入离心管1中，取8µlpDNA(3kb)加入2ml离心管2中，加入无菌水稀释至100µl，分批加入稀释后的pDNA,涡旋30s混合溶液,将离心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。