基于切片式去细胞支架构建的人工神经移植物及制备方法与流程

本发明属于组织工程领域，具体涉及基于切片式去细胞支架构建的人工神经移植物及制备方法。

背景技术：

神经损伤后常造成缺损，特别是脊髓损伤后会引起空洞发生，如何填充缺损部位，减少空洞形成是神经损伤修复领域的热门问题。自体神经移植虽然能治疗神经缺损，但明显的副作用及有限的来源严重限制其应用。目前研究的重点是利用组织工程的观念构建神经移植物来填补缺损，促进神经损伤修复。

支架、细胞因子及种子细胞是组织工程的三个关键要素。人造高分子材料如聚乳酸等，虽然来源广泛，但是存在生物相容性不理想等缺点。来源于哺乳动物如大鼠和猪的组织取材方便，价格低廉，经去细胞处理后具有良好的生物相容性。但目前的去细胞支架制备工艺均为整体取材，经去污剂等多种化合物处理后去除细胞。目前的技术中存在的技术缺陷有：（1）整体组织去细胞存在去细胞强度过小易残留，强度过大则粉碎；（2）在整体组织上种植种子细胞，须依赖种子细胞向组织内部侵袭迁移，否则仅支架表面存在细胞支架的载细胞能力较低；（3）同理，整体组织交联细胞因子也须依赖因子渗透入组织内部，其影响因素较多。

大量研究表明，除了细胞因子类的化学信号对细胞的生长分化有显著影响，机械性刺激及材料表面的拓扑结构也是影响细胞命运的重要因素，组织经切片后可暴露出组织内的微细结构，有助于细胞贴附、迁移，甚至控制细胞生长方向、细胞形态，乃至影响细胞分化方向。如脊髓白质中的纵行纤维束与骨骼肌中的纵行肌原纤维束均能诱导干细胞沿其方向延伸出突起，以达到连接断裂部位上下纤维。另外，固定液对蛋白分子具有较强的交联作用，供体组织中的蛋白分子大部分交联成互联结构，可以起到封闭抗原的效果，从而降低移植物的免疫原性。

目前将细胞因子交联至支架上常用的交联剂包括戊二醛、过氧化酶、多酚氧化酶及碳二亚胺等；其中戊二醛存在细胞毒性，过氧化酶及多酚氧化酶会显著影响细胞因子的功能，碳二亚胺不仅价格昂贵而且同样会影响细胞因子活性。而京尼平是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，具有广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化等。大量研究表明京尼平可以作为蛋白交联剂，能够将细胞因子交联于胶原、明胶及壳聚糖表面。京尼平交联蛋白的机制可能与其存在二醛结构相关。

纤维蛋白是临床常用的手术粘合剂，亦有商业化的产品用于修复皮肤创口。纤维蛋白能够通过凝血酶催化纤维蛋白原形成，是一种优良的水凝胶，能够粘合切片支架，重建人工神经移植物。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种基于切片式去细胞支架重建的组织工程神经移植物及其制备方法，本发明的方法具有成本低、周期短、方法简便、易于操作等优点；所制备的神经移植物负载高浓度细胞因子与自体干细胞，且细胞排列方向能够满足连接损伤断端的要求。

本发明首先提供一种组织工程神经移植物，所述神经移植物基于切片式去细胞支架构建而成；

进一步的，所述神经移植物由切片式去细胞支架和京尼平交联细胞因子，负载自体干细胞构建而成；

更进一步的，所述自体干细胞来源于鼻腔呼吸部粘膜细胞的外胚间充质干细胞。

本发明还提供一种组织工程神经移植物的制备方法，所述方法为：以固定液固定组织，冰冻切片后进行去细胞处理，以京尼平交联细胞因子，制备京尼平交联支架上；培养患者自体外胚间充质干细胞，种植于京尼平交联的支架上，以纤维蛋白粘合载细胞切片支架构建神经移植物。具体操作步骤如下：

S1.切片式去细胞支架的制备：

将哺乳动物的脊髓、骨骼肌或肌腱去除表面结缔组织后以固定液处理24小时，按缺损需求修剪组织，进行冰冻切片，纵向切片，切片厚度为60微米。用去离子超纯水及磷酸缓冲液依次反复浸洗备用；然后用3%（wt.%）Triton X-100、1M氢氧化钠、10%（wt.%）十二烷基磺酸钠及4%（wt.%）脱氧胆酸钠依次浸泡去除切片内细胞成分，再用4%（wt.%）多聚甲醛浸泡过夜，以大量灭菌磷酸缓冲液在无菌条件下清洗得到无菌去细胞支架，冷藏备用。

S2. 京尼平交联细胞因子：

利用京尼平的蛋白交联功能将细胞因子交联至去细胞支架上，将步骤（1）得到的去细胞支架按体积比1：20浸泡于DMEM/F-12培养液中，培养液中预混表皮生长因子（EGF，50-100ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，50-100ng/mL）、神经营养因子（NGF，50-100ng/mL）及神经营养素3（NT-3，50-100ng/mL），随后加入预灭菌的1%（w/v）磷酸缓冲液配制的京尼平溶液（加入约1mL乙醇促溶），于细胞培养箱内37℃培养12h，出现呈色反应，溶液呈深蓝色，切片从白色变为蓝色。

S3.含细胞因子切片支架负载自体干细胞：

取患者鼻腔呼吸部粘膜细胞在体外以限定性培养基培养纯化外胚间充质干细胞，并进行扩增鉴定，随后将鉴定后的外胚间充质干细胞种植于京尼平交联支架上， 1-2天便可进行下一步操作。

S4.以纤维蛋白粘合载自体外胚间充质干细胞支架构建人工神经移植物，按如下步骤进行：

（1）制备简易模具，亦可设计合成类似的PVC模具，目的是为了制备出含横截面为弧形凹槽的载体。

（2）将载细胞切片支架层叠在半圆形凹槽内，或者卷曲后置于槽内，加入8-10mg/mL纤维蛋白原与50-100 IU/mL凝血酶，构建人工神经移植物，此为最终成品。

与现有技术相比较，本发明的优势在于：

（1）本发明制备的切片式支架去细胞更彻底，避免了整体组织去细胞存在去细胞强度过小易残留，强度过大则粉碎的缺点。

（2）本发明可以确保重建的移植物内部存在大量种子细胞，支架的载细胞能力显著提高。（3）本发明可以确保重建的移植物内部含有较高浓度的细胞因子。

（4）组织经切片后可暴露出组织内的微细结构，有助于细胞贴附、迁移，甚至控制细胞

生长方向、细胞形态，乃至影响细胞分化方向。如脊髓白质中的纵行纤维束与骨骼肌中的纵行肌原纤维束均能诱导干细胞沿其方向延伸出突起，以达到连接断裂部位上下纤维。另外，固定液对蛋白分子具有较强的交联作用，供体组织中的蛋白分子大部分交联成互联结构，可以起到封闭抗原的效果，从而降低移植物的免疫原性。

（5）本发明中采用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子及神经营养素3，在促进干细胞增殖的同时诱导其向神经分化。京尼平是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，具有广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化等。大量研究表明京尼平可以作为蛋白交联剂，能够将细胞因子交联于胶原、明胶及壳聚糖表面。

（6）纤维蛋白能够通过凝血酶催化纤维蛋白原形成，是一种优良的水凝胶，能够粘合切片支架，重建人工神经移植物。

附图说明

图1为本发明制备的切片式去细胞支架照片；其中A为京尼平交联细胞因子之前，B为京尼平交联细胞因子之后,C为利用琼脂糖凝胶制备的圆柱形凹槽，D为利用纤维蛋白交联切片式支架所得的神经移植物成品。

图2为切片式支架的显微照片；其中A与B为荧光照片，C与D为扫描电镜照片；A显示京尼平处理后的支架具有红色荧光，B显示GFP转基因外胚间充质干细胞生长于切片支架之上，C为空支架，D为负载外胚间充质干细胞支架。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明：

以水合氯醛深度麻醉大鼠（400-500 g Sprague Dawley大鼠；来源于江苏大学实验动物中心），经心脏灌注磷酸缓冲液约500 mL后，灌注4%（wt.%）多聚甲醛500 mL，充分固定大鼠组织。解剖大鼠椎管，细心分离脊髓，小心去除表面的脊膜后，投入4%多聚甲醛内进行后固定约2h。包埋在OCT包埋剂内利用徕卡冰冻切片机在-15℃下进行纵切，切片厚度选为60μm。捞取切片后置于磷酸缓冲液中初步清洗，进入去细胞程序。

以3% （wt.%）Triton X-100 浸泡切片 2-3 h后，大量磷酸缓冲液清洗；1M 氢氧化钠浸泡 1-2 h后清洗； 10% （wt.%）十二烷基磺酸钠浸泡 2-3 h后清洗； 4% （wt.%）脱氧胆酸钠浸泡 1h；大量磷酸缓冲液清洗后以4%（wt.%）多聚甲醛浸泡2h 灭菌并封闭抗原物质。以上所有浸泡均在37℃烘箱内震荡完成。此时切片可以在4℃条件下长期保存于4%（wt.%）多聚甲醛溶液内。待需用时，将固定的切片转入大量已灭菌磷酸缓冲液中，经过多道清洗以去除有细胞毒性的多聚甲醛。

以磷酸缓冲液配制1%（w/v）的京尼平溶液（加入约1mL乙醇促溶），0.1μm滤器过滤除菌待用。将去细胞支架按体积比1：20浸泡于DMEM/F-12培养液中，培养液中预先加入EGF、bFGF、NGF及NT-3（浓度为50-100ng/mL），随后加入上述京尼平溶液，于细胞培养箱内作用12-24h，整个溶液会从无色透明转为深蓝色，切片由乳白转为深蓝色。至此，含细胞因子切片支架制备完毕。

取患者（脊髓损伤模型大鼠）鼻腔呼吸部粘膜，在无菌条件下切碎后以组织块培养方法培养纯化外胚间充质干细胞，利用nestin、HNK-1、vimentin、CD133对其进行流式或免疫荧光鉴定。以胰酶EDTA溶液消化外胚间充质干细胞，形成单细胞悬液，对细胞进行计数，按1×10⁶/支架的比例种植于含细胞因子切片支架上。1天后，细胞便可牢固地贴在切片支架上，便可进行下一步操作。

制备简易模具，如于培养皿盖内表面粘合一圆柱形物体，圆柱形物体的柱身横置于培养皿盖上，其与培养皿体便构成一简易模具，亦可设计合成类似的PVC模具。将高温消毒后的3%（W/V）琼脂糖磷酸缓冲液溶液，倒至无菌培养皿内离瓶口约5mm，盖上粘有圆柱形物的培养皿盖待琼脂糖冷却，取走培养皿盖，则在琼脂糖胶上留下一截面为弧形的凹槽。可以通过控制加入琼脂糖的量调节凹槽的深度，通过换不同直径的圆柱形物，控制凹槽的最大宽度。将上述含细胞切片支架层叠在凹槽内，或者卷曲后置于槽内，加入8-10 mg/mL纤维蛋白原与50-100 IU/mL凝血酶，构建成为人工神经移植物，此为最终成品。