本发明涉及中药
技术领域：
，尤其涉及灵芝孢子油及其脂肪乳剂的制备技术，具体涉及一种灵芝孢子油及其脂肪乳剂在抗肿瘤中的应用。
背景技术：
：灵芝孢子(Ganodermalucidiumspore)是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质。现代药理研究表明，灵芝孢子具有抗肿瘤、增强免疫调节、抗病毒、降血糖、降血脂、抗缺氧能力、抗炎、清除自由基等作用。灵芝及灵芝孢子化学成分复杂，具有广泛的生物学活性，其中多糖和三萜两大类活性物质被认为是主要功效成分。灵芝孢子油是灵芝孢子经破壁、超临界二氧化碳萃取所得脂溶性活性物质，主要以甘油三酯类化合物存在，还有少量的游离脂肪酸、类固醇酯及三萜类成分，现代研究表明具有抗肿瘤、增强免疫力、保肝护肝等功效。目前，大部分研究均认为灵芝孢子油具有增强免疫力及抗肿瘤作用是由于其富含灵芝三萜类化合物，因此，对灵芝孢子油的成分研究主要偏重于灵芝三萜类化合物的富集，而对灵芝孢子油中甘油三酯类化合物的成分研究和功效分析，目前尚未见有相关报道。市面上大多数的灵芝孢子油分离工艺得到的孢子油需经过脱酸、脱臭等常规精炼工序后，才能得到符合食用油卫生标准的灵芝孢子油，而精炼工序会使得产品中特有的三萜酸、麦角甾醇、脂溶性维生素等功效成分损失。灵芝孢子油根据其制备工艺的不同，成品的活性成分也有不同，对抗肿瘤的功效也不同，因此，通过对灵芝孢子油制备工艺的研发获得药效更好的灵芝孢子油，不但能够更好地造福病患，而且具有广阔的市场价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种以油酸单不饱和脂肪酸为主，产品酸值和过氧化值等卫生指标符合食用油卫生标准，且产品中灵芝酸、麦角甾醇、脂溶性维生素等功效成分保留较好的灵芝孢子油。本发明的另一个目的是提供上述灵芝孢子油在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的另一个目的在于提供以上述灵芝孢子油为主要成分通过高压均质技术制备的灵芝孢子油口服乳剂。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：本发明人通过研究发现，灵芝孢子油的抗肿瘤作用与其特有甘油三酯类成分关系更加密切，其三萜类成分与甾醇成分在油中含量虽然不高，但其抗肿瘤活性也是确切的。因此本发明人创新性地开发出一种新型灵芝孢子油的制备工艺，并且验证了该灵芝孢子油具有很好的抗肿瘤功效。一种灵芝孢子油，其特征在于该灵芝孢子油是由如下方法制备而得：步骤1将灵芝孢子粉经低温振荡破壁后，得到破壁灵芝孢子粉，破壁率大于95％；步骤2将破壁灵芝孢子粉与乙醇搅拌混合后制粒，得到破壁灵芝孢子颗粒，并将破壁灵芝孢子颗粒进行干燥处理；步骤3将步骤2干燥处理后的破壁灵芝孢子粉颗粒放置于超临界CO2萃取釜中，进行超临界CO2萃取，萃取釜的萃取压力为28～32MPa，萃取釜的萃取温度为38～42℃；通过分离釜进行两级分离，分离釜I的分离压力为10～14MPa，分离釜I的分离温度为43～47℃，分离釜II的分离压力为5～7MPa，分离釜II的分离温度为38～42℃；从分离釜Ⅰ中收集灵芝孢子油，直至萃取完全。上述步骤1中，灵芝孢子粉采用市售的灵芝孢子粉，优选采用符合表1所述质量标准的市售的灵芝孢子粉。表1市售灵芝孢子粉的质量标准项目质量指标性状为棕色或棕褐色干燥粉末，无结块气味、滋味具有灵芝孢子粉固有的气味和滋味，微苦，无异味水分，％≤8.0灰分，％≤3.0酸值(以脂肪计)(以KOH计)，(mg/g)≤10过氧化值(以脂肪计)，(g/100g)≤0.25上述步骤1中，低温振荡破壁的参数条件为：破壁温度为-16℃～-12℃，破壁时间为40～70分钟；优选破壁温度为-14℃，破壁时间为55分钟。上述步骤2中，乙醇采用质量百分比浓度为95％的乙醇溶液；破壁灵芝孢子粉与乙醇的重量比为5：2.5～5：3.5；优选破壁灵芝孢子粉与乙醇的重量比为5：3。上述步骤2中，将破壁灵芝孢子粉与乙醇搅拌混合后制粒是采用湿法制粒，先将破壁灵芝孢子粉与乙醇搅拌混合10～30分钟，然后挤压过筛制粒，筛网目数为14目。上述步骤2中，破壁灵芝孢子颗粒的干燥处理温度为45℃～49℃，干燥时间为4h～8h，干燥至干颗粒水分含量≤7.0％。本发明灵芝孢子油的成分检测显示：该灵芝孢子油中主要含六种含油酸的甘油三酯类化合物，这六种含油酸的甘油三酯类化合物的含量之和约占灵芝孢子油总质量的50％～80％，其含量具体如下所示：(1)甘油三油酸酯(简称OOO，C57H104O12)，占灵芝孢子油总质量的12.5％～23.5％；(2)1,2-二油酸-3-棕榈酸-甘油三酯(简称OOP，C55H102O6)，占灵芝孢子油总质量的12.8％～23.8％；(3)1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯(简称OOL，C57H102O6)，占灵芝孢子油总质量的7.6％～14.1％；(4)1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸-甘油三酯(简称POL，C55H100O6)，占灵芝孢子油总质量的5.2％～9.7％；(5)1,3-二棕榈酸-2-油酸-甘油三酯(简称POP，C55H102O6)，占灵芝孢子油总质量的3.40％～3.70％；(6)1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯(简称LLO，C57H100O6)，占灵芝孢子油总质量的5.80％～6.10％。本发明的灵芝孢子油，其性能检测结果为：相对密度0.912～0.920，折光率1.460～1.480，碘值78～95g/100g，皂化值186～199mg/g，不皂化物≤15g/kg，酸值≤3.0mg/g，过氧化值≤0.25g/100g，水分及挥发物≤0.2％，脂肪酸组成(％)：棕榈酸12～17，硬脂酸2.7～4.0，油酸52～64，亚油酸12～18，亚麻酸ND～3.3。本发明的灵芝孢子油经实验验证对肿瘤细胞的生长具有很好的抑制作用，因此，可用本发明的灵芝孢子油与药学上可接受的辅料制备抗肿瘤的脂肪乳剂，如口服剂、注射剂等。本发明还提供一种以上述灵芝孢子油为主要成分的灵芝孢子油脂肪乳，该灵芝孢子油脂肪乳的原料配方是由如下重量份数的各组分组成：上述维生素E、磷脂和甘油均采用市售产品即可实现本发明。步骤1油相制备：分别称取灵芝孢子油和磷脂，将灵芝孢子油预热至40℃，在高剪切分散乳化机搅拌下，少量多次把灵芝孢子油加至磷脂中，停止搅拌放置5分钟后继续搅拌至分散均匀，加热至65～70℃，制备得到油相；水相制备：分别量取甘油和纯化水，把甘油加至纯化水中，混合均匀，加热到65～70℃，制备得到水相；步骤2初乳的制备：在高剪切分散乳化机的搅拌下，将油相缓缓加入水相中搅拌8～10分钟制成初乳，并用质量百分比浓度为5％的氢氧化钾溶液适量调初乳的pH值至7.0～9.0；步骤3均质：将制备好的初乳置于高压均质设备中，在25～50MPa的压力下反复均质3～6次，则制备得到所需灵芝孢子油脂肪乳。上述步骤1和步骤2中，所述高剪切分散乳化剂的转速为10000r/min～30000r/min。本发明的灵芝孢子油脂肪乳经实验证明具有一定抑制化疗引起的白细胞、红细胞、血红蛋白降低的作用，也有一定改善肝脏功能的作用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明人在研究中发现，灵芝孢子油酸败严重程度受制备及储存过程中温度、水分的影响很大，因此本发明人在研究中强调制备过程温度及水分控制以保持产品的新鲜度，包括低温破壁、破壁孢子粉颗粒的低温干燥，超临界二氧化碳萃取和分离温度均控制在一定温度范围，从而有效避免了灵芝孢子油酸败。2.本发明的超临界二氧化碳萃取采用设备自身的两级分离功能，对分离温度和压力等参数进行了优化，使分离后的孢子油不需再进行任何脱酸、脱臭等常规精炼工序，产品酸值、过氧化值等卫生指标已达到食用油卫生标准，且更好地保留了产品特有的三萜酸、麦角甾醇、脂溶性维生素等功效成分。3.本发明通过研发特定的制备工艺而获得药效更好的灵芝孢子油，该灵芝孢子油既富含以油酸为主的单不饱和脂肪酸，又保留了灵芝特有的三萜酸、麦角甾醇、脂溶性维生素等功效成分，具有很好的抗肿瘤活性。4.本发明的灵芝孢子油中富含甘油三酯类化合物，对肿瘤细胞的生长具有很好的抑制作用，且本发明通过均质技术将该灵芝孢子油开发成O/W型的口服乳剂，与传统的胶囊剂相比，本发明的灵芝孢子油脂肪乳服用方便、活性成分更利于人体吸收，生物利用度高；5.本发明的灵芝孢子油及其脂肪乳剂均具有抑制肿瘤细胞的作用，且灵芝孢子油在与抗肿瘤药物共用时，起到很好的增效作用，同时又能减轻放化疗的毒副作用，提高肿瘤患者的生活质量。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1灵芝孢子油本实施例灵芝孢子油的制备过程如下所示：步骤1破壁本实施例的灵芝孢子粉采用市售的灵芝孢子粉，该市售的灵芝孢子粉的水分≤8.0％，灰分≤3.0％，酸值(以脂肪计)≤10mg/g，过氧化值(以脂肪计)≤0.25g/100g；将灵芝孢子粉置于贝利微粉机料盒中，设定破壁时间为55分钟，破壁温度为-14℃，得到破壁灵芝孢子粉；步骤2制粒称取60kg步骤1制备的破壁灵芝孢子粉加入CH-200槽型混合机，按照破壁灵芝孢子粉：乙醇＝5：3的重量比，向CH-200槽型混合机中加入质量百分比浓度为95％的乙醇，上盖，搅拌混合20分钟，使物料达到“捏之成团，压之则散”，然后挤压过筛制粒，筛网目数为14目，得到破壁灵芝孢子颗粒；将上述破壁灵芝孢子颗粒均匀铺放于CT-C热风循环烘箱不锈钢托盘上，摊平，物料的厚度不得超过盘高度的2/3；干燥温度控制在45℃，干燥时间为8h，每30分钟记录一次干燥温度，控制干颗粒水分≤7.0％时，出车；步骤3称取步骤2干燥处理后的破壁灵芝孢子颗粒3kg投进超临界CO2萃取釜中，进行超临界CO2萃取，萃取釜的萃取压力29MPa，萃取釜的萃取温度为42℃；通过分离釜进行两级分离，分离釜I的压力为10MPa，分离釜I的分离温度45℃，分离釜II的分离压力为7MPa，分离釜II的分离温度为40℃，从分离釜Ⅰ中收集灵芝孢子油，直至萃取完全。对本实施例制备的灵芝孢子油进行性能测试，结果如下所示：本实施例制备所得灵芝孢子油的相对密度0.9156，折光率1.4696，碘值88.46g/100g，皂化值193.62mg/g，不皂化物≤1.00g/kg，酸值≤2.09mg/g、过氧化值≤0.13g/100g、水分≤0.07％，脂肪酸组成(％)：棕榈酸13，硬脂酸3.3，油酸61，亚油酸13，亚麻酸ND。实施例2灵芝孢子油本实施例灵芝孢子油的制备过程如下所示：步骤1破壁本实施例的灵芝孢子粉采用市售的灵芝孢子粉，该市售的灵芝孢子粉的水分≤8.0％，灰分≤3.0％，酸值(以脂肪计)≤10mg/g，过氧化值(以脂肪计)≤0.25g/100g；将灵芝孢子粉置于贝利微粉机料盒中，设定破壁时间为70分钟，破壁温度为-16℃，得到破壁灵芝孢子粉；步骤2制粒称取60kg破壁灵芝孢子粉加入CH-200槽型混合机，按照破壁灵芝孢子粉：乙醇＝5：3.5的重量比，向CH-200槽型混合机中加入质量百分比浓度为95％的乙醇，上盖，搅拌混合20分钟，使物料达到“捏之成团，压之则散”，然后挤压过筛制粒，筛网目数为14目，得到破壁灵芝孢子颗粒；将破壁灵芝孢子颗粒均匀铺放于CT-C热风循环烘箱不锈钢托盘上，摊平，物料的厚度不得超过盘高度的2/3；干燥温度控制在49℃，干燥时间为6h，每30分钟记录一次干燥温度，控制干颗粒水分≤7.0％时，出车；步骤3称取步骤2干燥处理后的破壁灵芝孢子颗粒7kg投进超临界CO2萃取釜中，进行超临界CO2萃取，萃取釜的萃取压力30MPa，萃取釜的萃取温度为41℃；通过分离釜进行两级分离，分离釜I的分离压力为12MPa，分离釜I的分离温度46℃，分离釜II的分离压力为6MPa，分离釜II的分离温度为42℃，从分离釜Ⅰ中收集灵芝孢子油，直至萃取完全。对本实施例制备的灵芝孢子油进行性能测试，结果如下所示：本实施例制备所得灵芝孢子油的相对密度0.9154，折光率1.4700，碘值88.0g/100g，皂化值196mg/g，不皂化物≤0.96g/kg，酸值≤2.0mg/g，过氧化值≤0.17g/100g，水分≤0.05％。脂肪酸组成(％)：棕榈酸15.8，硬脂酸3.1，油酸61.3，亚油酸15，亚麻酸ND。实施例3灵芝孢子油功能实验本实施例对实施例1制备的灵芝孢子油的抗肿瘤功能进行实验研究。1、细胞株和实验动物细胞株：肝癌H22细胞株，由中山大学实验动物中心细胞库提供并复苏。试验动物：SPF级BALB/C裸鼠，5-6W，雄性，由广州中医药大学实验动物中心提供。2、本实施例分为8个实验组；各组给药剂量、浓度以及给药途径具体如下所示：(1)对照组：生理盐水，0.2ml/10g小鼠，每天1次尾静脉注射；(2)灵芝孢子多糖口服组：灵芝孢子多糖(灵芝孢粉水提物)用水配置成浓度为0.5g/ml的灵芝孢子多糖溶液；量取5ml灵芝孢子多糖溶液用生理盐水补至总体积为10ml，制备得到灵芝孢子多糖口服组试剂，将该试剂按照0.2ml/10g小鼠的量，每天1次灌胃给小鼠；灵芝孢子多糖口服组的给药剂量为5.0g生药/kg；(3)灵芝孢子三萜口服组：灵芝孢子三萜(灵芝孢子粉60％醇提物)用水配置成浓度为0.5g/ml的灵芝孢子三萜溶液；量取5ml灵芝孢子三萜溶液用生理盐水补至总体积为10ml，制备得到灵芝孢子三萜口服组试剂，将该试剂按照0.2ml/10g小鼠的剂量，每天1次灌胃给小鼠；灵芝孢子三萜口服组的给药剂量为5.0g生药/kg；(4)灵芝孢子油口服组：取步骤1制备的灵芝孢子油5ml用生理盐水补至10ml，然后按照0.2ml/10g小鼠的剂量，每天1次灌胃给小鼠；灵芝孢子油口服组的给药剂量为1.0g生药/kg(按灵芝孢子油算)；(5)灵芝孢子油注射组：取步骤1制备的灵芝孢子油5ml用生理盐水补至10ml，然后按照0.2ml/10g小鼠的剂量，每天1次给小鼠进行尾静脉注射；灵芝孢子油注射组的给药剂量为1.0g生药/kg(按灵芝孢子油算)；(6)康莱特注射液注射组：将市售的康莱特注射液(规格100ml；10g)按照0.26ml/10g小鼠的剂量，每天1次尾静脉注射；康莱特注射液注射组的给药剂量为2.6g生药/kg；(7)大豆油注射组：将市售的大豆油按照0.2ml/10g小鼠的剂量，每天1次给小鼠进行腹腔注射；大豆油注射组的给药剂量为20ml/kg；(8)注射用环磷酰胺(注射)组：市售的注射用环磷酰胺规格为0.2g/瓶，取1瓶注射用环磷酰胺用生理盐水溶解并定容至133ml，然后按照0.2ml/10g小鼠的剂量，给小鼠进行腹腔注射；注射用环磷酰胺(注射)组的给药剂量为30mg/kg；注射用环磷酰胺(注射)组简称CTX组。3、实验过程荷瘤鼠制备：将肝癌H22细胞进行复苏，细胞计数后调成约2×106/0.2ml接种于裸鼠腹腔7d传代，将第三代计数用于试验。抽取接种7d左右种鼠腹水，呈乳白色，D-Hanks液洗涤离心(800r/min×5min)3次，调整细胞浓度至1×107/ml，台盼蓝拒染法检测存活率≥95％，将细胞悬液注射至健康小鼠右腋皮下,每只鼠0.2ml，全程严格无菌操作，60min内完成。接种第2天，将小鼠按上述8个实验组进行分组，每组12只，同时进行给药：1-7组(也就是对照组、灵芝孢子多糖口服组、灵芝孢子三萜口服组、灵芝孢子油口服组、灵芝孢子油注射组、康莱特注射液注射组和大豆油注射组)均每日1次，连续给药7天；注射用环磷酰胺(注射)组是隔3天给药一次，共给药2次。4、测定指标和实验结果于给药前以及给药后7d进行体重称量；于末次给药24h后处死裸鼠，将肿瘤剥除后马上重量，计算抑制率(所有实验数据均以表示，由SSPS13.0数据处理软件行方差分析和组间t检验)，结果如表2所示。表2灵芝孢子有效部位对裸鼠H22肝癌的肿瘤生长抑制作用注：d1、d8：接种后第1、8天；与对照组比较，*为P<0.05**为P<0.01.由表2可见，灵芝孢子油口服组、灵芝孢子油注射组、康莱特注射液注射组和CTX组均能明显抑制裸鼠H22肝癌的生长作用(与对照组比较，P<0.05或P<0.01)，抑制率分别为30.78％、48.14％、38.63％和68.28％；灵芝孢子多糖口服组和灵芝孢子三萜口服组也有一定的抑制作用，但与对照组比较无明显统计学差异(P＞0.05)，抑制率分别为17.76％、26.29％；大豆油注射组抑制率为3.31％。综上所述，本发明的灵芝孢子油确实具有很好的肿瘤细胞抑制作用，与阳性对照康莱特注射液效果接近。实施例4灵芝孢子油脂肪乳本实施例的灵芝孢子油脂肪乳的原料配方是由如下重量份数的各组分组成：上述灵芝孢子油为实施例1制备的灵芝孢子油，维生素E、磷脂和甘油均采用市售产品。本实施例灵芝孢子油脂肪乳的制备方法包括如下步骤：步骤1水相的制备：分别称取灵芝孢子油和磷脂，将灵芝孢子油预热至40℃，在高剪切分散乳化机搅拌下，高剪切分散乳化剂的转速为30000r/min，少量多次把灵芝孢子油加至磷脂中，停止搅拌放置5分钟后继续搅拌至分散均匀，加热至70℃，制备得到油相；水相制备：分别量取甘油和纯化水，把甘油加至纯化水中，混合均匀，加热到70℃，制备得到水相；步骤2初乳的制备：在高剪切分散乳化机的搅拌下，高剪切分散乳化剂的转速为30000r/min，将油相缓缓加入水相中搅拌10分钟制成初乳，并用质量百分比浓度为5％的氢氧化钾溶液适量调初乳的pH值至8.0；步骤3均质：将制备好的初乳置于高压均质设备中，在35MPa的压力下反复均质5次，则制备得到本实施例的灵芝孢子油脂肪乳。实施例5灵芝孢子油脂肪乳的抗肿瘤及增效减毒作用本实施例对实施例4制备的灵芝孢子油脂肪乳进行增效减毒作用的实验。1、实验材料市售的玉米油；实施例4制备的灵芝孢子油脂肪乳；市售的康莱特软胶囊(规格为0.45g/粒)；注射用环磷酰胺(规格为0.2g/瓶)；市售的0.9％氯化钠注射液(生理盐水)。2、细胞株和实验动物细胞株：肝癌H22细胞株，由中山大学实验动物中心细胞库提供并复苏。试验动物：SPF级昆明小鼠，6W，雄性，由中山大学实验动物中心提供。3、实验分组及剂量设计本实施例分为8个实验组，具体的分组及剂量设计如表3所示。表3实验分组以及剂量设计4、实验方法与结果荷瘤鼠制备：复苏肝癌H22细胞，以每只小鼠细胞数量约为5×106分别接种于3只小鼠腹腔后约10d。在无菌条件下(超净台或接种罩)对荷瘤鼠抽取腹水，用生理盐水清洗并计数H22细胞1×107/ml，以0.1ml/只接种到130只小鼠腋下靠背部皮下，待肿瘤长至约50mm3以上，选择合格动物随机分成8个实验组，每组10只。8个实验组的给药情况如下所示：(1)玉米油对照组：本组的实验小鼠是灌胃给予0.2ml/10g的玉米油，每天1次，连续14d；(2)CTX组(也就是注射用环磷酰胺组)：按照表2的给药剂量将注射用环磷酰胺给予小鼠腹腔注射，隔日1次，共7次；(3)CTX+灵芝孢子油脂肪乳低剂量组：本组的实验小鼠是要腹腔注射环磷酰胺和灌胃灵芝孢子油脂肪乳；如表2所示，灵芝孢子油脂肪乳的给药剂量为0.4g/kg，每天1次灌胃给小鼠，连续14天；注射用环磷酰胺的给药剂量为30mg/kg，隔日1次给小鼠腹腔注射，共7次；(4)CTX+灵芝孢子油脂肪乳高剂量组；本组的实验小鼠是要腹腔注射环磷酰胺和灌胃灵芝孢子油脂肪乳；如表2所示，灵芝孢子油脂肪乳的给药剂量为1.2g/kg，每天1次灌胃给小鼠，连续14天；注射用环磷酰胺的给药剂量为30mg/kg，隔日1次给小鼠腹腔注射，共7次；(5)灵芝孢子油脂肪乳低剂量组：灵芝孢子油脂肪乳的给药剂量为0.4g/kg，每天给小鼠灌胃1次，连续14天；(6)灵芝孢子油脂肪乳高剂量组：灵芝孢子油脂肪乳的给药剂量为1.2g/kg，每天给小鼠灌胃1次，连续14天；(7)康莱特软胶囊组：康莱特软胶囊的给药剂量为1.8g/kg，每天给小鼠灌胃1次，连续14天；康莱特软胶囊组为阳性对照组；(8)CTX+康莱特软胶囊组：本组的实验小鼠是要腹腔注射环磷酰胺和灌胃康莱特软胶囊；如表2所示，康莱特软胶囊的给药剂量为1.8g/kg，每天1次灌胃给小鼠，连续14天；注射用环磷酰胺的给药剂量为30mg/kg，隔日1次给小鼠腹腔注射，共7次。5、测定指标末次给药24h检测各项指标。①于给药前以及给药后每周进行体重称量，以及作一般状态观察；②每天对每笼动物进行进食量测定(称量放的饲料和剩余饲料重量)；③每周测量瘤体积(给药前、1W、2W)，于末次给药24h后小鼠处死，将肿瘤剥除后马上重量，计算抑制率；④记录死亡动物，并计算死亡率；⑤检测血常规指标：WBC(白细胞数)、RBC(红细胞数)、HGB(血红蛋白)、PLT(血小板数)等；⑥网织红细胞数：取血10μL加入100μL的煌焦油蓝酒精溶液中，充分混合,放置10min，取2～3滴在干燥玻片的一端，立即推片，在显微镜油镜下计数1000个红细胞中的网织红细胞，将结果换算成网织红细胞百分数；玻片涂片染色，显微镜下计数测定；⑦检测脾、胸腺系数和脾结节数：脏器系数＝脏器重量/体重×1000；脾结节：取脾脏，称重之后浸泡于苦味酸福尔马林中，密封浸泡24小时之后，取出；在4倍解剖显微镜下观察，目测计数脾脏表面的结节数；⑧骨髓有核细胞数(BMNC)：动物处死，取右侧完整股骨，用3％醋酸液10ml冲出全部骨髓，使成单细胞悬液，显微镜下，在血细胞计数板上计BMNC；⑨检测肝功能和肾功能指标：末次给药24h后小鼠取血分离血清检测ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、BUN(尿素氮)、CR(肌酐)。所有实验数据均以表示，由SSPS13.0数据处理软件行方差分析和组间t检验。6、实验结果(1)8个实验组对肝癌H22瘤鼠肿瘤体积影响如表4所示。表4对H22瘤鼠肿瘤体积(mm3)影响(N＝8-10,)与对照组比较：*为P<0.05，**为P<0.01；与CTX组比较，#为P<0.05，##为P<0.01。由表4可见，给药7d，与对照组相比，各给药组对肿瘤均有抑制作用趋势，与CTX合用各组趋势尤明显，但无明显统计学差异（与对照组比P＞0.05）；给药14d，与对照组相比，CTX单独给药组、CTX+灵芝孢子油脂肪乳低剂量组、CTX+灵芝孢子油脂肪乳高剂量组、CTX+康莱特软胶囊组均能明显抑制小鼠H22实体瘤的生长（P<0.05或P<0.01），单独给药的灵芝孢子油脂肪乳的低剂量组和高剂量组也有一定的作用趋势，但与对照组比较均P＞0.05；与CTX单独给药组相比，各联合用药组均有增强抑制肿瘤生长作用趋势，灵芝孢子油脂肪乳与CTX的联合用药组略明显些，但无明显统计学差异（P＞0.05）。由上述分析可知，灵芝孢子油脂肪乳对抗肿瘤药物的药效有一定的增效作用。（2）8个实验组对肝癌H22瘤鼠瘤重、抑制率和死亡率的影响如表5所示。表5对H22瘤鼠给药14天瘤重、抑制率、动物死亡率的影响(N=8-10,)与对照组比较：*0.01<P<0.05**P<0.01；与CTX组比较，#为P<0.05，##为P<0.01。由表5可见，通过肿瘤重量进行分析：给药14d，与对照组相比，给药治疗各组均有一定的抑制作用，其中CTX单独给药组、CTX+灵芝孢子油脂肪乳低剂量组、CTX+灵芝孢子油脂肪乳高剂量组、CTX+康莱特软胶囊组能明显抑制小鼠H22实体瘤的生长（与对照组比P<0.05），其抑制率分别为：55.03%、61.09%、65.59%、59.03%；各合用组与CTX单独给药组相比均有加强抑制作用趋势，但无明显统计学差异（P＞0.05）；说明，灵芝孢子油脂肪乳对抗肿瘤药物的药效有一定的增效作用。由表5可见，实验给药治疗14d，对照组裸鼠死亡率为10%；与对照组比较，其它各给药组死亡率均均为0-20%之间，未见明显组检差异，动物死亡原因很可能都是油液体难以灌胃而导致呛死为主。（3）8个实验组对肝癌H22瘤鼠血常规的影响如表6所示。表6对H22瘤鼠血常规的影响(N=8-10,)与对照组比较：*为P<0.05，**为P<0.01；与CTX组比较，#为P<0.05，##为P<0.01。由表6可见，实验给药治疗14d时，与对照组相比，CTX单独给药组WBC、HGB均明显降低（P<0.01），RBC也有降低趋势，但无明显统计学差异；与单独环磷酰胺组相比，各联合用药组均有一定的改善趋势，其中CTX+灵芝孢子油脂肪乳高剂量组组明显升高（P<0.01）；CTX+灵芝孢子油脂肪乳高剂量组可明显提升HGB（血红蛋白）的含量（与CTX组比P<0.05）；说明，灵芝孢子油脂肪乳有一定抑制化疗引起的白细胞、红细胞、血红蛋白降低的作用。（4）8个实验组对肝癌H22瘤鼠肝功能和肾功能的影响如表7所示。表7H22瘤鼠肝功能和肾功能的影响(N=8-10,)与对照组比较：#为P<0.05,##为P<0.01；与CTX组比较，*为P<0.05，**为P<0.01。由表7可见，实验给药治疗14d时，与对照组相比，CTX单独给药组肾功能指标BUN明显升高（P<0.05），其它肝功能指标AST、ALT和肾功能指标Cr改变不明显；与单独环磷酰胺组相比，CTX+灵芝孢子油脂肪乳低剂量组可显著降低AST、ALT（P<0.05），CTX+灵芝孢子油脂肪乳高剂量组可显著降低AST（P<0.015），其它组未见明显改变（P＞0.05）；说明，灵芝孢子油脂肪乳可能有一定改善肝脏功能作用。（5）8个实验组对肝癌H22瘤鼠脾系数、胸腺系数、骨髓有核细胞数、网织红数和脾结节数的影响如表8所示。表8对H22瘤鼠脾系数、胸腺系数、骨髓有核细胞数、网织红数、脾结节数的影响(N=7-10,)与对照组比较：#为P<0.05,##为P<0.01；与CTX组比较，*为P<0.05，**为P<0.01；联合用药各组与CTX组比较，无统计学差异.由表8可见，实验给药治疗14d时，与对照组相比，CTX单独给药组胸腺指数、骨髓有核细胞数（BMNC）、网织红细胞、脾结节降低或减少（P<0.05或0.01）；与单独环磷酰胺组相比，各联合用药组对各指标均有一定的改善趋势，但无明显统计学差异（P＞0.05）。当前第1页1 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