一种混合物及其在预防或治疗镉毒性药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种混合物及应用，具体涉及一种混合物及其在预防或治疗镉毒性药物中的应用。

背景技术：

重金属镉广泛应用于电池、颜料、油漆、塑料、电镀、印刷、汽车、航空等行业，随着镉使用量的不断增加，目前镉污染已经成为一个严重危害人类健康的环境问题。由于镉的生物半衰期长达10～40年，且生物降解缓慢【应用与预防医学，2012，18(5)：317-320；Biometals 2010,23(5)：769-782】，因此，水、土壤以及空气等环境中的镉最终会积累在动植物体内。由于镉的毒性浓度很低，微量的镉持续不断进入体内就可因长期生物蓄积和生物放大作用导致肺、肾脏、肝脏、胰腺、甲状腺和骨骼等多种器官组织以及神经、生殖、心脏和免疫等系统的损伤【生态毒理学报，2012，7(4)：354-359；Biometals，2010，23(5)：769-782；Biometals 2010,23(5)：951-960；Toxicology，2011,283(2-3)：65-87】。目前已经确认，镉与骨质疏松症、骨痛病、肾病、肺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、肾脏癌症等多种癌症、糖尿病、心血管疾病和退行性疾病(如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症)等多种疾病相关【微量元素与健康研究，2012，29(1)：51-53；Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2013：898034；Biochim Biophys Acta，2007，1774(11)：1414-1421；Toxicology，2011，283(2-3)：65-87】。

目前临床上还没有有效治疗镉中毒的特异性药物【Biological Trace Element Research，2016，174(1)：112-120；International J Mol Sci，2016，17(1)：1-22】。对于接触性急性镉中毒，可能有效的治疗方法是静脉注射依地酸钙钠金属螯合剂，加速镉通过尿液排出的速度，但应用依地酸钙钠治疗镉中毒尚存在争议，因为这会引起肾脏镉浓度过快积累，增加镉的肾毒性；口服二巯基琥珀酸(DMSA)被认为可以用做镉中毒解毒剂，应用于治疗急性镉中毒，尤其是镉中毒早期病症。目前这些金属离子螯合剂由于其副毒作用，应用受到限制。对大多数的人群来说，镉是通过污染的食物、水、空气和吸烟等经消化道和呼吸道进入人体内，经过长期积蓄造成慢性镉中毒，这种慢性镉中毒一旦被发现，镉沉积往往已经非常严重，所造成器官组织的损伤难以逆转。近年来的研究表明，某些微量元素、抗氧化剂、维生素和动植物天然化合物对镉毒性具有一定的干预作用，在镉中毒的预防应用上备受关注【实用预防医学，2012，19(11)：1761-1763；Scientific World Journal，2013：394-652；Current Drug Targets，2016，17(12)：1350-1384】。由于镉引起毒性是多方面的，单一元素或化合物不能起到完全拮抗镉毒性的作用【Current Drug Targets，2016，17(12)：1350-1384】，因此将有效拮抗镉毒性元素和化学物按一定比例混合，将起到降低镉在体内的积蓄，有效预防或治疗镉毒性的作用。

技术实现要素：

本发明提供一种低成本、低毒性、使用方便的混合物及其在预防或治疗镉毒性药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：一种混合物，由以下组分按重量份数混合构成：维生素C 200份、维生素E 200份、维生素B₁ 100份、维生素B₆ 100份、碳酸钙250份、氯化镁396份、氯化锌157份、氯化亚铁45份、姜黄素100份、半胱氨酸50份、血红素25份和亚硒酸钠1份。

一种混合物在预防或治疗镉毒性药物中的应用，所述混合物能够降低镉在器官中的积蓄，减缓镉对细胞与组织的毒性。

本发明的有益效果是：

(1)本发明中的主要组分为维生素、氨基酸、微量元素和动植物提取物，毒性低，毒副作用小；

(2)本发明采用的原材料易于获得、制备过程简单、使用方便；

(3)本发明能够降低镉在肾脏和肝脏器官中的积蓄，能够减缓镉对细胞与组织的毒性，对镉毒性的预防或治疗具有积极的作用。

附图说明

图1为本发明中混合物剂量对小鼠体重变化影响曲线。

图2为本发明中小鼠肾脏隔含量图。

图3为本发明中小鼠肝脏镉含量图。

图4为本发明中小鼠肾脏中过氧化氢酶活力对比示意图。

图5为本发明中小鼠肾脏中超氧化物歧化酶活力对比示意图。

图6为本发明中小鼠肾脏中谷胱甘肽过氧化物酶活力对比示意图。

图7为本发明中小鼠肾脏组织HE(苏木精-伊红染色)切片示意图。

图8为本发明中小鼠肝脏组织HE(苏木精-伊红染色)切片示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

一种混合物，由以下组分按重量份数混合构成：维生素C 200份、维生素E 200份、维生素B₁ 100份、维生素B₆ 100份、碳酸钙250份、氯化镁396份、氯化锌157份、氯化亚铁45份、姜黄素100份、半胱氨酸50份、血红素25份和亚硒酸钠1份。

其中：维生素C、碳酸钙、氯化镁、氯化亚铁和亚硒酸钠购自天津科密欧化学试剂有限公司；维生素B₁、维生素B₆、半胱氨酸和血红素购自Sigma公司；姜黄素购自Puritan's Pride公司；氯化锌购自成都科龙化工试剂厂；各组分为粉末形态，将上述物质混合均匀即形成所述混合物；混合物中碳酸钙、氯化镁、氯化亚铁和氯化锌起作用分别为钙离子、镁离子、亚铁离子和锌离子；有效剂量为162.4mg/kg/day～324.8mg/kg/day。

混合物组分中碳酸钙可以由氯化钙(278份)和硝酸钙(410份)等能够提供含钙离子的无机盐或有机化合物替代，混合物中以钙离子质量计算为钙离子所占份数为100份。混合物组分中氯化镁可以由碳酸镁(347份)、硝酸镁(616份)或硫酸镁(495份)等能够提供含镁离子的无机盐或有机化合物替代，混合物中以镁离子质量计算为镁离子所占份数为100份；混合物组分中氯化锌可以由碳酸锌(144份)、硝酸锌(218份)或硫酸锌(186份)等能够提供含锌离子的无机盐或有机化合物替代，混合物中以锌离子质量计算为锌离子所占份数为75份；混合物组分中氯化亚铁可以由硝酸亚铁(64份)或硫酸亚铁(54份)等能够提供含亚铁离子的无机盐或有机化合物替代，混合物中以亚铁离子质量计算为亚铁离子所占份数为20份。混合物组分中半胱氨酸可由半胱氨酸衍生物替代。

一种混合物在预防或治疗镉毒性药物中的应用，所述混合物能够降低镉在器官中的积蓄，减缓镉对细胞与组织的毒性。

实施例1

将42只雄性昆明小鼠(5周龄，由成都达硕生物科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK(川)2015-030)，经适应性饲养2周后，随机分为7组，分别为空白组(常规饲料组)、镉处理组、低剂量拮抗组、高剂量拮抗组、低剂量治疗组、高剂量治疗组和药物毒性组；试验小鼠饲养温度为25±2℃，湿度50±10％，昼夜周期为12/12h；小鼠自由摄食和饮水；所有小鼠均给予普通饲料，空白组和药物毒性组给予蒸馏水，其他组给予含有50mg/L Cd²⁺(CdCl₂)的蒸馏水；低剂量拮抗组和高剂量拮抗组于试验开始至试验结束，每天分别灌胃给予对应的低、高剂量的混合物；低剂量治疗组和高剂量治疗组于试验第15天至试验结束，每天分别灌胃给予对应低、高剂量的混合物；药物毒性组于试验开始至试验结束，每天灌胃给予高剂量混合物；其中低剂量为162.4mg/kg/day，高剂量为324.8mg/kg/day。

实施例2

在实施例1试验过程中，每天测定每只小鼠体重和每组小鼠饮水量，并观察小鼠毛色和行为状态，7组试验小鼠于第35天颈椎脱臼处死，测定小鼠肝脏、肾脏和脾脏重量。

试验过程中小鼠体重变化如图1所示，从图1中可以看出7组小鼠体重变化相近，统计学分析(使用分析软件为SPSS，下同)没有显著性差异。

小鼠肝脏、肾脏和脾脏指数如表1所示，试验结果显示各试验组肝脏指数相近，统计学分析没有显著性差异。

镉处理组肾脏指数较空白组显著降低；低剂量拮抗组和高剂量拮抗组肾脏指数较镉处理组显著升高，同时与空白组无显著差异；低剂量治疗组和高剂量治疗组肾脏指数与镉处理组和空白组均无显著差异；药物毒性组肾脏指数与空白组无显著差异。

镉处理组脾脏指数较空白组显著升高；低剂量拮抗组脾脏指数较镉处理组显著降低，同时与空白组无显著差异；高剂量拮抗组、低剂量治疗组和高剂量治疗组脾脏指数与镉处理组和空白组均无显著差异；药物毒性组肾脏指数与空白组无显著差异。

表1混合物对镉中毒小鼠的脏器指数的影响

与空白组对比^#表示P<0.05，^##表示P<0.01；与镉处理组对比^*表示P<0.05，^**表示P<0.01，其中P<0.05表示显著，P<0.01表示非常显著；附图2、3、4、5、6中相同。

实施例3

从实施例2中各组样本中分别称取0.2g肾脏样本，0.4g肝脏样本，分别充分磨碎后烘干至恒重，加入10mL消化液，加热充分消化后定容，用火焰原子吸收分光光谱仪(Z-5000，日立)测定镉含量；测定方法参照GB 5009.15-2014《食品中镉的测定》中火焰原子吸收分光光谱法。

试验结果如图2和图3所示，试验结果显示，空白组和药物毒性组肾脏和肝脏组织镉含量很低；镉处理组肾脏和肝脏镉含量显著升高；与镉处理组相比较，低剂量拮抗组、高剂量拮抗组、低剂量治疗组和高剂量治疗组小鼠肾脏和肝脏中镉含量显著降低(P<0.01)，说明该混合物能显著减少镉在小鼠肾脏和肝脏中的积蓄。

实施例4

从实施例2中各组样本中分别称取0.2g肾脏样本，加入2mL磷酸盐缓冲液(0.1M，含1mM EDTA，pH7.4)，用自动匀浆器制成匀浆后采用离心机(D3024R，SCILGEX公司)，在4000rpm、4℃条件下离心15min，取上清液，用于测定小鼠肾脏匀浆中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力；其中，过氧化氢酶酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、超氧化物歧化酶ELISA试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶ELISA试剂盒由上海邦奕生物有限公司提供；测定方法按照ELISA试剂盒步骤进行，使用的仪器为酶标仪(VARIOSKAN FLASH，Thermo公司)。

过氧化氢酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是胞内三种重要的抗氧化酶，这三种酶的含量代表了细胞抗氧化能力。

肾脏匀浆中过氧化氢酶活力如图4所示，与空白组比较，镉处理组过氧化氢酶活力显著降低；与镉处理组相比较，低剂量拮抗组和低剂量治疗组过氧化氢酶活力显著升高，同时与空白组无显著差异，高剂量拮抗组、高剂量治疗组和药物毒性组过氧化氢酶活力与镉处理组和空白组均无显著性差异；

肾脏匀浆中超氧化物歧化酶活力如图5所示，与空白组相比镉处理组超氧化物歧化酶活力显著降低；与镉处理组相比，低剂量拮抗组、高剂量拮抗组、低剂量治疗组和高剂量治疗组超氧化物歧化酶活力显著升高，同时与空白组无显著性差异；药物毒性组超氧化物歧化酶活力与空白组无显著性差异。

谷胱甘肽过氧化物酶活力如，图6所示，与空白组相比镉处理组谷胱甘肽过氧化物酶活力显著降低；与镉处理组相比较，低剂量拮抗组、高剂量拮抗组和低剂量治疗组谷胱甘肽过氧化物酶活力显著升高，同时与空白组无显著性差异；高剂量治疗组谷胱甘肽药物过氧化物酶活力与镉处理组和空白组均无显著性差异；药物毒性组谷胱甘肽过氧化物酶活力与空白组无显著性差异。

实施例5

从实施例2各组中分别取小鼠肝脏和肾脏样本固定于组织固定液中，制作石蜡切片，进行苏木精-伊红染色，在显微镜下观察染色的组织切片，进行病理分析。

图7所示，为小鼠肾脏组织HE切片，从图中可以看出空白组肾脏组织结构正常，无明显病理变化；镉处理组肾小球毛细血管基膜增厚，肾小管上皮细胞水肿，胞体肿胀，胞浆淡染；低剂量拮抗组和高剂量拮抗组肾脏组织结构基本正常，无明显病理变化；低剂量治疗组有部分肾小管上皮细胞水肿，胞体肿胀，胞浆淡染；高剂量治疗组部分肾小管上皮细胞胞浆胞体胀大，胞浆透明，呈气球样变；药物毒性组肾组织结构与空白组相同。

图8所示，为小鼠肝脏组织HE切片，从图中可以看出空白组肝脏组织结构正常，无明显病变；镉处理组部分肝细胞胞核固缩浓染，局部肝细胞水肿，胞体肿胀，胞浆淡染；低剂量拮抗组肝脏组织结构基本正常；高剂量拮抗组少量肝细胞胞核固缩，程度较镉处理组明显减轻；低剂量治疗组部分肝细胞胞核固缩浓染，局部肝细胞水肿，胞体肿胀，胞浆淡染；高剂量治疗组少量肝细胞胞核固缩浓染，部分肝细胞空泡变性，胞体肿胀；药物毒性组与空白组相同，肝脏组织结构正常。

图7和8中：A：空白组；B：镉处理组；C：低剂量拮抗组；D：高剂量拮抗组；E：低剂量治疗组；F：高剂量治疗组；G：药物毒性组。

试验结论

通过实施例1-5试验证明，本发明混合物在给药量在162.4mg/kg/day～324.8mg/kg/day范围，在预防或治疗镉毒性方面效果显著，其中给药量162.4mg/kg/day各项指标好于324.8mg/kg/day；药物毒性组小鼠毛色正常，体重及其他各项指标与空白组无显著性差异，所以该混合物毒副作用小，毒性低。

药理作用

研究认为，镉暴露一般会使细胞内氧化自由基增多，使活性氧增加，进而对细胞造成氧化损伤，镉进入细胞也会诱导细胞凋亡引发细胞癌变。该发明混合物的主要药理作用为：维生素C是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，在细胞内和细胞外能拮抗镉引起的氧化损伤，可以保护细胞免受超氧化自由基的损伤；维生素E是重要的抗氧化剂和氧自由基的消除剂，与其他抗氧化物质及抗氧化酶共同构成机体的抗氧化系统；维生素B₁在体内以焦磷酸硫胺素(TPP)的形式存在，TPP可与镉形成易排出的复合物，从而促进镉的排泄；维生素B₆主要参与酶的合成和抗氧化作用；镉离子与钙离子存在相同的转运机制，钙可以与镉转运位点竞争性结合使细胞镉的摄入降低；镁有利于减少因镉引起的Cu²⁺和Zn²⁺的流失，降低体内镉的蓄积和抑制镉的细胞毒性；锌能干预镉进入细胞，并能诱导金属硫蛋白合成，使镉与金属硫蛋白形成复合物而加速镉的排出；铁与镉具有互相拮抗的生物学作用；姜黄素能有效清除胞内自由基，减少由镉引起的自由基对细胞的损伤；半胱氨酸在胞内容易被氧化还原，可参与活性氧的清除，减缓镉毒性；血红素能有效的补充铁而且在胞内起到抗氧化作用；硒可防止或拮抗镉对器官组织引起的损害，对镉引起的端粒酶逆转录酶mRNA的表达也具有一定的拮抗作用。