骨修复材料及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料
技术领域：
，具体而言，涉及一种骨修复材料及其制备方法。
背景技术：
：我国正步入老龄化社会，增龄性改变和伴随发生的疾病将导致大量的骨缺损重建需求，传统的植骨支架材料包括异种骨、同种异体骨、合成材料等，以上材料都存在一定的局限性：同种异体骨来源有限；异种骨存在来源和价格问题，同时有传播疾病，引起宿主免疫排斥反应等风险；合成材料的孔隙率、孔隙交通、孔径大小等方面与人体松质骨不同，对细胞的黏附与增殖不利，较难促进成骨细胞的分化成熟。羟基磷灰石(HA)是煅烧骨的主要成分，也是人体骨组织中无机质的主要成分，与人体组织有良好的生物相容性，但HA在体内降解较慢，骨组织在短期内不易生成。β-磷酸三钙(β-TCP)不但具有良好的生物相容性，而且具有良好的生物降解性，其降解产物Ca2+、PO43-等离子可进入活体体液，为新骨的形成提供丰富的Ca、P等有益元素，促使新骨的形成，但β-TCP在体内的降解速度稍快，与新骨生长速度不匹配。此外，现有的骨修复材料大多对人体骨缺损处的骨修复的促进作用较小。因此，需要对用于骨修复材料进行进一步研究，以满足人体骨缺损处的骨修复需要。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种骨修复材料及其制备方法，以解决现有技术中骨修复材料不满足人体骨缺损处的骨修复需求问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种骨修复材料，其为多孔结构，且骨修复材料包括β转化生长因子、羟基磷灰石、β-磷酸三钙和胶原。进一步地，胶原为I型胶原蛋白。进一步地，胶原为采用交联剂交联后的I型胶原蛋白。进一步地，交联剂为谷氨酰胺转氨酶和/或京尼平。进一步地，羟基磷灰石和β-磷酸三钙的重量比为40～80:20～60；优选地，β转化生长因子的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的1～30ng/g；优选地，胶原的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的5～25％。根据本发明的另一方面，提供了一种上述的骨修复材料的制备方法，其包括以下步骤：取哺乳动物的松质骨依次进行水煮、磷酸溶液浸泡、蒸煮、干燥，得到预处理松质骨；将预处理松质骨置于磷酸氢钠溶液或者磷酸氢二钠溶液中进行改性处理，得到改性松质骨；将改性松质骨煅烧，得到羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料；以及将羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料与胶原溶液的混合物进行pH调节后，向混合物中加入β转化生长因子溶液，然后进行第一次冰浴处理，干燥，得到骨修复材料。进一步地，进行第一次冰浴处理的步骤之后以及干燥之前，还包括向加入β转化生长因子溶液后的混合物中加入交联剂的步骤；优选交联剂的用量为胶原溶液中胶原重量的0.001～0.1％。进一步地，改性处理的步骤中，磷酸氢钠溶液的质量浓度为0.5～2.5％，磷酸氢二钠溶液的质量浓度为0.5～2.5％，处理时间为1.5～2.5h。进一步地，得到羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料与胶原溶液的混合物的步骤包括：将胶原与乙酸水溶液混合，得到胶原溶液；将羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料与胶原溶液混合，得到混合物。进一步地，加入交联剂的步骤之后，还包括进行第二次冰浴处理的步骤；优选地，将混合物进行pH调节的步骤中，调解pH值至7～8；优选地，第一次冰浴处理中，搅拌速度为500～5000r/min，处理时间为1～2h；优选地，第二次冰浴处理中，搅拌速度为500～5000r/min，处理时间为1～2h；优选地，进行第二次冰浴处理的步骤之后及干燥之前，在15～25℃温度下静置3～5小时。应用本发明的技术方案，骨修复材料为多孔结构，且骨修复材料包括β转化生长因子、羟基磷灰石、β-磷酸三钙和胶原。多孔结构利于骨细胞的增殖、分化。同时包括羟基磷灰石和β-磷酸三钙，克服了羟基磷灰石过于稳定、β-磷酸三钙降解过快的缺点，平衡了材料的降解速度，使其更适宜匹配人体骨骼修复速度。胶原具有许多优点：无毒，低抗原性，良好的生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性，能促进细胞迁移、黏附、分化和调节细胞生长。β转化生长因子(TGF-β)是一族多功能的多肽蛋白，广泛存在于机体正常组织细胞以及转化细胞中，骨组织和血小板中含量最高。TGF-β具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成和调节机体免疫作用。TGF-β可促进骨膜间充质细胞的增殖和分化，促进成骨(软骨)细胞的增殖，刺激胶原、骨连结素和骨桥蛋白的合成。同时，TGF-β可抑制破骨细胞的生成以及成熟破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收作用。由此可见，TGF-β在骨组织代谢过程中起着十分重要的作用。总之，本发明提供的骨修复材料兼具了以上各种优点，能够匹配人体骨骼的修复速度，满足人体骨缺损处的骨修复需求。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1示出了根据本发明的实施例1中的羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料的扫描电镜图；以及图2示出了根据本发明的一种实施例1中的骨修复材料的扫描电镜图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。正如
背景技术：
部分所描述的，现有的骨修复材料不满足人体骨缺损处的骨修复需求。为了解决这一问题，本发明提供了一种骨修复材料，其为多孔结构，且骨修复材料包括β转化生长因子、羟基磷灰石、β-磷酸三钙和胶原。多孔结构利于骨细胞的增殖、分化。同时包括羟基磷灰石和β-磷酸三钙，克服了羟基磷灰石过于稳定、β-磷酸三钙降解过快的缺点，平衡了材料的降解速度，使其更适宜匹配人体骨骼修复速度。胶原具有许多优点：无毒，低抗原性，良好的生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性，能促进细胞迁移、黏附、分化和调节细胞生长。β转化生长因子(TGF-β)是一族多功能的多肽蛋白，广泛存在于机体正常组织细胞以及转化细胞中，骨组织和血小板中含量最高。TGF-β具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成和调节机体免疫作用。TGF-β可促进骨膜间充质细胞的增殖和分化，促进成骨(软骨)细胞的增殖，刺激胶原、骨连结素和骨桥蛋白的合成。同时，TGF-β可抑制破骨细胞的生成以及成熟破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收作用。由此可见，TGF-β在骨组织代谢过程中起着十分重要的作用。总之，本发明提供的骨修复材料兼具了以上各种优点，能够匹配人体骨骼的修复速度，满足人体骨缺损处的骨修复需求。在一种优选的实施方式中，胶原为I型胶原蛋白。I型胶原蛋白具有更高的生物相容性，作为骨修复材料中的胶原，能够进一步促进人体骨骼的修复。在一种优选的实施方式中，胶原为采用交联剂交联后的I型胶原蛋白。未经交联的I型胶原蛋白为线性结构，将其交联后，能够显著提高其稳定性，不易溶解分散，更方便应用。上述交联剂可以采用本领域常用的胶原蛋白的交联剂，比如戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷等。在一种优选的实施方式中，交联剂为谷氨酰胺转氨酶和/京尼平。谷氨酰胺转氨酶和/或京尼平作为胶原蛋白交联剂，除了具有较好的交联性能，能够提高胶原蛋白的稳定性之外，同时具有更好的生物特性，应用在骨修复材料中更为适宜。尤其是谷氨酰胺转氨酶，更适宜作为上述交联剂。在一种优选的实施方式中，羟基磷灰石和β-磷酸三钙的重量比为40～80:20～60；优选地，β转化生长因子的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的1～30ng/g；优选地，胶原的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的5～25％。将各成分之间的用量关系控制在上述范围内，骨修复材料各方面的性能更加平衡，各成分之间能够发挥进一步地正向协同效应，对于人体骨骼的修复具有更佳的促进作用。另外，根据本发明的另一方面，还提供了一种上述骨修复材料的制备方法，其包括以下步骤：取哺乳动物的松质骨依次进行水煮、磷酸溶液浸泡、蒸煮、干燥，得到预处理松质骨；将预处理松质骨置于磷酸氢钠溶液或者磷酸氢二钠溶液中进行改性处理，得到改性松质骨；将改性松质骨煅烧，得到羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料；将羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料与胶原溶液的混合物进行pH调节后，向混合物中加入β转化生长因子溶液，然后进行第一次冰浴处理，干燥，得到骨修复材料。上述处理步骤中，取哺乳动物松质骨进行系列处理后，将预处理松质骨置于磷酸氢钠溶液或者磷酸氢二钠溶液中进行改性处理，得到的改性松质骨经高温煅烧后，即形成了羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料。再将羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料与胶原溶液的混合物进行pH调节后，向混合物中加入β转化生长因子溶液，然后将得到的平衡溶液进行第一次冰浴处理、干燥，即可得到同时包括β转化生长因子、羟基磷灰石、β-磷酸三钙和胶原的骨修复材料。具体的哺乳动物的松质骨可以是其脊骨、股骨等。该骨修复材料的孔隙率、孔隙交通、孔隙大小与人体松质骨基本一致，利于骨细胞的增殖、分化。同时包括羟基磷灰石和β-磷酸三钙，克服了羟基磷灰石过于稳定、β-磷酸三钙降解过快的缺点，平衡了材料的降解速度，使其更适宜匹配人体骨骼修复速度。胶原具有许多优点：无毒，低抗原性，良好的生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性，能促进细胞迁移、黏附、分化和调节细胞生长。β转化生长因子(TGF-β)是一族多功能的多肽蛋白，广泛存在于机体正常组织细胞以及转化细胞中，骨组织和血小板中含量最高。TGF-β具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成和调节机体免疫作用。TGF-β可促进骨膜间充质细胞的增殖和分化，促进成骨(软骨)细胞的增殖，刺激胶原、骨连结素和骨桥蛋白的合成。同时，TGF-β可抑制破骨细胞的生成以及成熟破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收作用。由此可见，TGF-β在骨组织代谢过程中起着十分重要的作用。总之，本发明提供的骨修复材料兼具了以上各种优点，能够匹配人体骨骼的修复速度，满足人体骨缺损处的骨修复需求。在一种优选的实施方式中，进行第一次冰浴处理的步骤之后以及干燥之前，还包括向第一次冰浴处理后的混合物中加入交联剂的步骤。加入交联剂，能够显著提高胶原蛋白的稳定性，使其具有一定的黏度，不易溶解分散，更方便应用。在一种优选的实施方式中，改性处理的步骤中，磷酸氢钠溶液的质量浓度为0.5～2.5％，磷酸氢二钠溶液的质量浓度为0.5～2.5％，处理时间为1.5～2.5h。经改性处理，可以使改性松质骨经煅烧后呈现羟基磷灰石-β-磷酸三钙两相结构。同时，通过调整磷酸氢钠溶液和磷酸氢二钠溶液的浓度和处理时间，能够调整两相之间的比例。而本发明优选将浓度和处理时间控制在上述范围内，能够使羟基磷灰石和β-磷酸三钙的重量比达到40～80:20～60，进而能够进一步平衡骨修复速度。在一种优选的实施方式中，得到羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料与胶原溶液的混合物的步骤包括：将胶原与乙酸水溶液混合，得到胶原溶液；将羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料与胶原溶液混合，得到混合物。在一种优选的实施方式中，加入交联剂的步骤之后，还包括进行第二次冰浴处理的步骤；优选地，第二次冰浴处理中，搅拌速度为500～5000r/min，处理时间为1～2h。如此，利用第二次冰浴处理能够使胶原蛋白更充分地交联，稳定性更佳。优选地，第一次冰浴处理中，搅拌速度为500～5000r/min，处理时间为1～2h。这样，胶原蛋白与羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料之间能够更好地分散。优选地，进行第二次冰浴处理的步骤之后及干燥之前，在15～25℃温度下静置3～5小时。该过程为陈化过程，可使各组分分散更加均匀。优选地，将混合物进行pH调节的步骤中，调解pH值至7～8。调解pH值至7～8，更适合人体酸碱环境。优选地，在15～25℃温度下静置3～5小时后，其转移到不锈钢容器中后，放置到-10～-30℃下冷冻处理24小时，再转移到-80℃下冷冻干燥处理，得到骨修复材料在配置胶原溶液时，本领域技术人员可以根据最终的用量关系选择其浓度和用量。优选地，将从牛跟腱中提取的I型胶原蛋白加入到质量分数为0.5％的乙酸水溶液中配置成胶原溶液，胶原蛋白的含量占该溶液质量分数的5％。以每10毫升胶原乙酸溶液中加入2～5g羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料的比例向胶原乙酸溶液中加入羟基磷灰石-磷酸三钙复合材料，混合均匀，并调节pH值至7～8。然后向其中掺加浓度为1～30ng/ml的β转化生长因子溶液，在此过程中进行第一次冰浴处理。优选地，采用的β转化生长因子溶液可以是以生理盐水为溶剂配置的溶液。上述取哺乳动物脊骨、股骨的松质骨依次进行水煮、磷酸溶液浸泡、蒸煮、干燥，得到预处理松质骨。该步骤的具体工艺可以进行调整。具体地，可以按照以下条件进行实际操作：步骤一、取哺乳动物脊骨、股骨的松质骨部分切成小块后水煮、干燥；步骤二、将干燥后的松质骨用磷酸溶液浸泡；步骤三、将磷酸溶液浸泡后的松质骨放置于高压锅内蒸煮，将蒸煮后的松质骨用去离子水漂洗数次，至pH值为7时干燥；将哺乳动物脊骨、股骨的松质骨进行切块、水煮、干燥的方法是将脊骨、股骨部分的松质骨切成1cm3小块，放入锅中水煮3～4小时后，用清水漂洗数次，置于干燥箱中，120～140℃干燥6～8h。所用的磷酸溶液，其质量浓度为0.5～5％，浸泡时间为0.5～5小时。松质骨在高压锅中蒸煮，温度为125℃，时间为2～4小时。上述煅烧过程中，优选是将改性松质骨高温炉升温到300～400℃后，保温0.5～2小时；继续升温至500～600℃后，保温0.5～2h；继续升温至700～800℃后，保温0.5～2h；继续升温至900～1000℃后，保温0.5～2h；继续升温至1000～1100℃后，保温0.5～2小时。该煅烧条件下，形成的材料孔结构更加稳定。以下通过实施例进一步说明本发明的有益效果：实施例1步骤1、选取健康、新鲜的9个月龄藏牦牛的脊骨松质骨，将脊骨、股骨部分的松质骨切成1cm3小块，放入锅中水煮4小时后，用清水漂洗数次，置于干燥箱中，120～140℃干燥6～8h。将干燥后的松质骨在磷酸溶液中浸泡，磷酸溶液质量浓度为3％，浸泡时间为3小时。松质骨在高压锅中蒸煮，温度为125℃，时间为3小时。干燥，得到预处理松质骨；步骤2、将预处理松质骨加至质量浓度为2％的磷酸氢二钠水溶液中，浸泡2h，得到改性松质骨；步骤3、将改性松质骨煅烧，具体将改性松质骨高温炉升温到400℃后，保温0.5小时；继续升温至500℃后，保温2h；继续升温至800℃后，保温0.5h；继续升温至1000℃后，保温0.5h；继续升温至1100℃后，保温0.5小时。得到羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料(SEM图见图1)，从图1中可见其保留了原有自然骨的连续多孔结构，具有很大的内表面积，有利于细胞的植入和粘附，以及细胞营养成分的渗入和细胞代谢产物的排出；将羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料破碎筛分，选取粒径为0.1～2mm的颗粒备用；步骤4、将从牛跟腱中提取的I型胶原蛋白加入到质量分数为0.5％的乙酸溶液中配置成胶原乙酸溶液，胶原蛋白的含量占该溶液质量分数的5％；以每10毫升胶原乙酸溶液中加入5g羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料的比例向胶原乙酸溶液中加入羟基磷灰石-β-磷酸三钙复合材料，混合均匀，并调节pH值至7。然后向其中加入1ng/ml的β转化生长因子的生理盐水溶液。在此过程中，冰浴下以每分钟3000转搅拌，时间为1.5小时。然后加入交联剂(交联剂用量为胶原的0.08％)谷氨酰胺转氨酶，冰浴下继续以每分钟3000转搅拌，时间为1.5小时，然后在25℃下静置3时。将上述溶液转移到不锈钢容器中后，放置到-30℃下冷冻处理24小时，再转移到-80℃下冷冻干燥处理。得到骨修复材料(SEM图见图2)。由图2可知，该骨修复材料为多孔结构。上述骨修复材料中，羟基磷灰石和β-磷酸三钙的重量比为6:4，β转化生长因子的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的1ng/g；胶原的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的9.1％。实施例2制备工艺与实施例1相同，不同之处在于：步骤2中将预处理松质骨加至质量浓度为0.5％的磷酸氢二钠水溶液中，浸泡2.5h，得到改性松质骨；步骤4中将混合物进行pH调节的步骤中，调解pH值至8；第一次冰浴处理中，搅拌速度为5000r/min，处理时间为1h；第二次冰浴处理中，搅拌速度为5000r/min，处理时间为1h；第二次冰浴处理的步骤之后及干燥之前，在15℃温度下静置5小时。改变胶原乙酸溶液和β转化生长因子的加入量。交联剂用量为胶原的0.1％。最终得到的骨修复材料中，羟基磷灰石和β-磷酸三钙的重量比为8:2，β转化生长因子的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的30ng/g；胶原的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的5％。实施例3制备工艺与实施例1相同，不同之处在于：步骤2中将预处理松质骨加至质量浓度为2.5％的磷酸氢钠水溶液中，浸泡2.5h，得到改性松质骨；步骤4中将混合物进行pH调节的步骤中，调解pH值至7；第一次冰浴处理中，搅拌速度为500r/min，处理时间为2h；第二次冰浴处理中，搅拌速度为500r/min，处理时间为2h；第二次冰浴处理的步骤之后及干燥之前，在25℃温度下静置4小时。改变胶原乙酸溶液和β转化生长因子的加入量。交联剂用量为胶原的0.01％。最终得到的骨修复材料中，羟基磷灰石和β-磷酸三钙的重量比为4:6，β转化生长因子的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的10ng/g；胶原的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的10％。实施例4制备工艺与实施例1相同，不同之处在于：步骤2中将预处理松质骨加至质量浓度为3％的磷酸氢钠水溶液中，浸泡3h，得到改性松质骨；步骤4中将混合物进行pH调节的步骤中，调解pH值至8.5；第一次冰浴处理中，搅拌速度为500r/min，处理时间为2h；无第二次冰浴处理；干燥之前，在25℃温度下静置4小时。改变胶原乙酸溶液和β转化生长因子的加入量。最终得到的骨修复材料中，羟基磷灰石和β-磷酸三钙的重量比为3:7，β转化生长因子的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的0.5ng/g；胶原的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的4％。交联剂用量为胶原的0.0005％。实施例5制备工艺与实施例1相同，不同之处在于：步骤2中将预处理松质骨加至质量浓度为0.4％的磷酸氢钠水溶液中，浸泡0.5h，得到改性松质骨；步骤4中将混合物进行pH调节的步骤中，调解pH值至8；第一次冰浴处理中，搅拌速度为500r/min，处理时间为2h；无第二次冰浴处理；干燥之前，在25℃温度下静置4小时。改变胶原乙酸溶液和β转化生长因子的加入量。最终得到的骨修复材料中，羟基磷灰石和β-磷酸三钙的重量比为9:1，β转化生长因子的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的0.5ng/g；胶原的含量为相对于羟基磷灰石和β-磷酸三钙总重量的4％。未添加交联剂。性能检测：将实施例1至5中制得的骨修复材料与市售Bio-OssCollagen材料(对比例1，不包含胶原和生长因子)分别进行比格犬牙槽嵴位点保留实验，术后即可和术后2月，对比格犬行CBCT扫描，结果证实在植入后2个月，应用不同材料比格犬的牙槽嵴高度和宽度的降低值分别如表1所示：表1牙槽嵴高度降低值牙槽嵴宽度降低值实施例10.80mm0.49mm实施例20.86mm0.48mm实施例30.71mm0.44mm实施例40.95mm0.53mm实施例50.98mm0.56mm对比例11.22mm0.66mm从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：利用本发明实施例中制备的骨修复材料，比格犬的骨高度和宽度的降低值均较低，这说明本材料在促进骨骼修复方面具有优势。总之，本发明提供的骨修复材料利于骨细胞的增殖、分化。同时包括羟基磷灰石和β-磷酸三钙，克服了羟基磷灰石过于稳定、β-磷酸三钙降解过快的缺点，平衡了材料的降解速度，使其更适宜匹配人体骨骼修复速度。胶原能促进细胞迁移、黏附、分化和调节细胞生长。β转化生长因子可促进骨膜间充质细胞的增殖和分化，促进成骨(软骨)细胞的增殖，刺激胶原、骨连结素和骨桥蛋白的合成。同时，TGF-β可抑制破骨细胞的生成以及成熟破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收作用。由此可见，TGF-β在骨组织代谢过程中起着十分重要的作用。总之，本发明提供的骨修复材料兼具了以上各种优点，能够匹配人体骨骼的修复速度，满足人体骨缺损处的骨修复需求。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3