一种布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗的制作方法

本发明属于生物制品领域，尤其涉及一种布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗。
背景技术：
：布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(革兰氏阴性胞内寄生菌)寄生在人和动物体内所引起的一种严重人畜共患病，给人类和动物的健康带来很大威胁，世界上仅少数发达国家或发达国家的某一地域消灭本病，疫苗免疫是预防和控制布病的重要措施之一。现在预防布鲁氏菌病主要依靠光滑弱毒活疫苗，有牛种弱毒活疫苗A19(S19)，羊种弱毒活疫苗Rev.1和M5(M5-90)，还有猪种弱毒活疫苗S2。布鲁氏菌病疫苗都具有良好的免疫保护效果，对控制布鲁氏菌病流行有明显效果。但这些疫苗对人仍有一定感染性，现在中国布病疫苗主要以口服等粘膜免疫方式为主，存在易于在体表(粘膜表面)扩散造成污染环境和现场人员等生物安全问题，同时流失的疫苗也会降低免疫动物对疫苗的生物利用度。温敏凝胶系统是近年来发展起来的一种新兴的递送系统，主要用于药物、细胞、基因等的传送，在治疗疾病，组织修复和再生方面起到了很大作用。温度敏感型原位凝胶，是一类对温度变化敏感的智能型高分子聚合物凝胶，可随贮藏条件和用药部位的温度变化发生相转变形成非化学交联的凝胶，其形成是温度改变后氢键或疏水作用也随之改变，导致聚合物的物理状态发生改变，即环境温度低于最低临界相变温度(LCST)时呈现液体状态，高于LCST时呈现半固体凝胶状态，在体内可迅速发生相转变，从而达到局部给药或延长药物在用药部位的滞留时间的目的，提高了药物的生物利用度，同时也避免了多次给药的不便。比较常见的温敏凝胶有泊洛沙姆(poloxamer)，它是一类由聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)组成的PEO-PPO-PEO型非离子三嵌段共聚物，已被美国和欧洲药典收录，已注册的商品名有Pluronic，Synperonic或Tetronic。该聚合物达到临界胶束温度时，其链上疏水性PPO嵌段脱水，泊洛沙姆分子在水溶液中聚集成以脱水PPO链为内核、以水化膨胀的PEG链为外壳的球状胶束，随着温度升高，胶束间的缠结和堆砌作用加剧而发生胶凝。它具有良好的生物相容性、顺应性、缓控释能力和较高的安全性。现温敏凝胶系统主要应用于药物制剂上，在生物制品上偶见报道，2012年，中科院过程工程研究所马光辉研究员领导的研究团队在温敏性水凝胶作为黏膜免疫投递系统的研究中获得进展，将温敏凝胶创新性地用于H5N1裂解疫苗的鼻黏膜免疫投递系统，其效果显著优于单纯H5N1裂解疫苗经鼻免疫的效果；2014年管晓燕等人进行了温敏型生物降解水凝胶载体防龋基因疫苗pVAX1-spap/A经不同途径免疫新西兰大白兔的实验研究，目的蛋白能够在免疫部位表达，能够有效诱导动物的体液免疫和黏膜免疫应答。粘膜感染是布鲁氏菌入侵机体的一种主要途径，通过粘膜免疫能够模拟感染途径产生相应免疫保护。而且，粘膜免疫对于怀孕牲畜来讲更加安全，所以针对布病防控研制出一种安全有效的用于粘膜免疫的疫苗是十分必要的。技术实现要素：本发明一个目的是提供一种布鲁氏菌病凝胶剂型疫苗。本发明提供的疫苗，为以泊洛沙姆为凝胶基质，布鲁氏菌病活疫苗为活性成分的凝胶剂型疫苗。上述疫苗中，所述凝胶基质包括泊洛沙姆407和泊洛沙姆188；所述泊洛沙姆407和所述泊洛沙姆188的质量比为1.9-2.2:0.1-0.4。上述疫苗中，所述泊洛沙姆407和所述泊洛沙姆188的质量比(点眼免疫最优比)为2.2:0.4。上述疫苗中，所述凝胶基质按照如下方法制备：将所述泊洛沙姆407和所述泊洛沙姆188按照质量比为2.2:0.4加入专用生理盐水溶液中，静置，得到凝胶基质。上述基质中还可以含有药学上可接受的稳定剂、染色剂和免疫增强剂；临用前，用制备好的凝胶基质稀释已经制备的布鲁氏菌活疫苗，充分混匀。上述疫苗中，所述专用生理盐水由溶质和溶剂组成，溶质为NaCl，溶剂为由质量百分含量0.1-1％的胰蛋白胨、5-10mg/L黄芪多糖、5-25mg/L台盼蓝和水组成；溶质在溶剂中的质量百分含量为0.9％；所述静置的温度为4℃，所述静置的时间为18-24h。上述疫苗中，所述布鲁氏菌病活疫苗为布鲁氏菌S2株活疫苗、布鲁氏菌A19株活疫苗或其余任一种布鲁氏菌株活疫苗(即可由布鲁氏菌S2、A19(S19)、Rev.1、M5(M5-90)等任一种制苗菌株制备)。上述疫苗中，所述疫苗按照如下方法制备：将所述布鲁氏菌病活疫苗与所述凝胶基质混匀，得到布鲁氏菌病凝胶剂型疫苗。上述凝胶基质也是本发明保护的范围。上述疫苗或上述凝胶基质在制备动物粘膜免疫产品中的应用也是本发明保护的范围。本发明申请的布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗用于粘膜免疫，呈现从体外的液态到机体粘膜表面转变为凝胶态，根据所测定的免疫动物(牛、羊)的粘膜温度最低为36.6度，所以通过调整两种不同规格的泊洛沙姆进行配比，通过对其胶凝温度进行测定，使其胶凝温度小于粘膜温度时触发其胶凝，试验研究表明，触发其胶凝的适当温度为34.0±2.0℃。本发明另一个目的是提供一种动物粘膜免疫产品。本发明提供的产品，其活性成分为上述疫苗。上述中，所述粘膜免疫为点眼、口服、滴鼻或阴道灌注；或所述动物为家畜，或所述家畜为牛或羊。本发明的实验证明，本发明将布鲁氏菌病活疫苗与温敏凝胶结合应用于布鲁氏菌病的粘膜免疫(点眼、口服、滴鼻、阴道灌注)，所涉及的适用于布鲁氏菌病的温敏凝胶剂型疫苗及其制备方法未见报道。温敏凝胶剂型能够有效消除现有布病疫苗粘膜免疫散毒的危险，提高粘膜免疫的安全性，同时减少了疫苗免疫时有效成份的流失，延长了有效成份的作用时间，提高疫苗的生物利用度。附图说明图1为使用配方四所制备的泊洛沙姆温敏凝胶体外活菌释放曲线；进行释放度试验时设定恒温摇床的温度为36.6℃，转速为100转，用口径为1.3mm的试管，先将2mL布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(100亿/mL)加入到试管内，将其放入36.6℃的水浴中迅速凝固，在凝胶上层小心加入2.4mL的同温生理盐水，每20min将溶蚀液体在超净台内全部倒出，再缓慢补充同温生理盐水2.4mL，将溶蚀液体进行活菌计数，结果由图1可见，在3h时的活菌释放量已高于全部菌量水平的90％。图2为使用配方四所制备的温敏凝胶基质溶解A19疫苗后奶牛抗体效价变化规律。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。冻干布鲁氏菌病活疫苗(S2株)(制苗菌株为中国兽医微生物菌种保藏管理中心编号CVCC70502菌株，参考《中国人民共和国兽用生物制品规程》二OOO年版157-158页)制成不低于100亿活菌/头份使用。冻干布鲁氏菌病活疫苗(A19株)(制苗菌株为中国兽医微生物菌种保藏管理中心编号CVCC70202菌株，参考《中国人民共和国兽用生物制品规程》二OOO年版159-160页)制成不低于600亿活菌/头份使用。泊洛沙姆407和泊洛沙姆188(购于BASF公司)；胰酪胨大豆琼脂培养基(BD)；台盼蓝(sigma)；黄芪多糖(索莱宝)。实施例1、布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗的制备一、泊洛沙姆凝胶基质的制备不同配方的泊洛沙姆凝胶基质按照如下方法制备：将泊洛沙姆407和泊洛沙姆188按表1所示的比例加入10mL的专用生理盐水溶液中，4℃静置溶解24小时形成澄清的凝胶溶液，将凝胶溶液灭菌，得到泊洛沙姆凝胶基质。专用生理盐水溶液由溶质和溶剂组成，溶质为NaCl，溶剂为由质量百分含量0.1％的胰蛋白胨、5mg/L黄芪多糖、5mg/L台盼蓝和水组成；溶质在溶剂中的质量百分含量为0.9％。二、泊洛沙姆凝胶基质胶凝温度的测定通过试管倾斜法(双氯芬酸钠眼用温度敏感原位凝胶的研制_鞠凤阁：P15)进行测定，测定上述一得到的不同配方的泊洛沙姆凝胶基质高压前后胶凝温度、0.22um滤膜过滤前后胶凝温度、模拟泪液稀释前后胶凝温度，结果如表1。表1配方一配方二配方三配方四泊洛沙姆407/g1.92.02.12.2泊洛沙姆188/g0.10.20.30.4胶凝温度/℃33.534.534.935.0高压后温度/℃34.034.335.034.8滤膜过滤后温度/℃33.834.835.235.3模拟泪液稀释后温度/℃***48.7注：*代表大于50℃。从表1中可以看出，两种灭菌方式对凝胶的胶凝温度几乎无影响，且配方四对泪液稀释的抵御能力较强，为点眼免疫最佳配方。最佳泊洛沙姆凝胶基质按照如下方法制备：将泊洛沙姆407和泊洛沙姆188按2.2g:0.4g加入10mL专用生理盐水溶液中，4℃静置溶解24小时形成澄清的凝胶溶液，将凝胶溶液灭菌，得到最佳泊洛沙姆凝胶基质。二、布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗的制备及效果检测A、布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(S2株)及其免疫效果检测1、布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(S2株)布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗按照如下方法制备：用上述一制备的最佳泊洛沙姆凝胶基质稀释冻干布鲁氏菌病疫苗(S2株)，充分混匀，使疫苗的使用剂量为每只羊1头份。2、泊洛沙姆温敏凝胶体外活菌释放曲线检测最佳泊洛沙姆凝胶基质温敏凝胶的体外活菌释放曲线，方法如下：进行释放度试验时设定恒温摇床的温度为36.6℃，转速为100转，用口径为1.3mm的试管，先将2mL布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(100亿/mL)加入到试管内，将其放入36.6℃的水浴中迅速凝固，在凝胶上层小心加入2.4mL的同温生理盐水，每20min将溶蚀液体在超净台内全部倒出，再缓慢补充同温生理盐水2.4mL，将溶蚀液体进行活菌计数。结果如图1所示，可见在3h时的活菌释放量已高于全部菌量水平的90％。3、布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗免疫效果检测免疫动物：景泰羊，不同年龄混群免疫组设定：三个实验组，每组各六只景泰羊(三只小羊，三只大羊)，给药方式为口腔给药、点眼，具体如下：A组：口服布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(S2株)1头份。B组：眼部滴注布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(S2株)1头份。C组：口服生理盐水稀释冻干布鲁氏菌病疫苗(S2株)1头份。阴性对照组：眼部滴注温敏凝胶、口服生理盐水、口服温敏凝胶各三只。试验过程：按照上述免疫方式对各组羊只进行免疫，于免疫后的20天进行颈静脉采血，离心取血清，使用布鲁氏菌病虎红抗原进行检测(中国兽医药品监察所生产，编号S201603布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原参考品)，检测方法：使用洁净的玻板，划分成3cm2的方格，每一方格中放置一份0.03mL的被检血清，摇动抗原瓶使抗原均匀悬浮，在被检血清旁加入0.03mL抗原，用牙签等及晃动方式均匀混合血清和抗原，于4min内观察结果，出现凝集现象者判为阳性，否则判为阴性。采血后无菌采集所有试验羊的下颌淋巴结、腹股沟淋巴结、脾，装于平皿进行组织研磨分离细菌。试验结果如表2所示：表2由上表可见，免疫20天后，从抗体水平和抗体检出率上分析，B组的血清效价最高，抗体检出率100％；A组的效价次之，抗体检出率100％；而C组效价最低，抗体检出率为67％。从靶器官载菌量上来看，A、B、C三组均在鄂下淋巴结分离到细菌，腹股沟少量，脾脏没有，C组载菌量最高，B组次之，A组最低。结果显示，在布鲁氏菌病凝胶剂型疫苗免疫组，即A组和B组，血清抗体水平较稳定，均高于传统疫苗剂型免疫的C组，且C组个体抗体水平差异大，靶器官载菌量要高于A组和B组。B、布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(A19株)及其免疫效果检测1、布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(A19株)布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗按照如下方法制备：用上述一制备的最佳泊洛沙姆凝胶基质稀释冻干布鲁氏菌病疫苗(A19株)，充分混匀，使疫苗的使用剂量为每头牛1头份。2、免疫效果检测免疫动物：荷斯坦奶牛免疫组设定：分三个实验组，每组10头奶牛，免疫途径为点眼和阴道灌注；具体如下：A组：眼部滴注生理盐水稀释的冻干布鲁氏菌病疫苗(A19株)1头份。B组：眼部滴注布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(A19株)1头份。C组：阴道灌注布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗(A19株)1头份。阴性对照组：生理盐水点眼组和阴道喷注温敏凝胶组各五头。试验过程：按照上述免疫方式对各组奶牛进行免疫，于免疫后的7d、15d、30d、45d采血，分离血清，采用布鲁氏菌病试管抗原进行效价测定(中国兽医药品监察所生产，编号S201604布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品)，具体测定方法参考《动物布鲁氏菌病诊断技术》毛开荣等编P60-64。结果如图2和表3：表3由上表可见，免疫后不同时期，从抗体水平和抗体检出率上分析，C组(阴道灌注布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗)的效价最高，抗体检出率100％；B组(眼部滴注布鲁氏菌病温敏凝胶剂型疫苗)的效价次之，抗体检出率95％；A组(眼部滴注生理盐水稀释的冻干布鲁氏菌病疫苗)效价最低，抗体检出率为90％。从结果来看，使用传统疫苗剂型的点眼免疫组A组有10％的奶牛没有检测到抗体，而B组在使用凝胶疫苗点眼免疫后抗体检出率相对于A组升高5％，C组效价上升很稳定，抗体检出率100％，且整体效价水平高于A、B两组。上述具体实施方案不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。当前第1页1 2 3