本发明系关于一种治疗或减缓自体免疫相关之疾病的医药组合物。
背景技术：
：正常情况下，免疫系统可视为身体的防卫军，当侦测到细菌、病毒等外来物质的入侵时，会产生抗体且攻打病菌。然而，当免疫系统失调不再能精准分辨敌我时，则这支防卫军会反过头攻击自身的组织或器官，而引发了所谓的「自体免疫疾病(autoimmunedisease)」。自体免疫疾病的罹病机率约为全球人口的5％。而自体免疫疾病的型式可从单一器官的疾病，如桥本氏甲状腺炎(hashimoto'sthyroiditis)，至广泛的全身性疾病，如全身性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，简称sle)。此疾病之病理特征为，在发炎的组织或器官中可发现大量淋巴球的异常浸润，以及在患者的血液中可侦测到自身抗体的存在。特定的自体免疫疾病系存在地域性，与人种、基因及环境皆可能相关。以多发性硬化症(multiplesclerosis，简称ms)而言，好发于祖先来自北欧的高加索人种，且好发于居住在高纬度的女性。目前研究显示，多发性硬化症是一种中枢神经系统自发性去髓鞘(demyelination)的长期发炎疾病，且因受损的神经不同，患者所发生的临床病症也不同，包括失去平衡、痉挛、手脚活动困难、麻痹、及视力模糊等症状。而关于自体免疫疾病的致病机制，已有多篇研究指向干扰素(interferon)或肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor)的过量表现可能涉及类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、克隆氏症(crohn'sdisease)、或干癣性关节炎(psoriaticarthritis)等免疫发炎相关疾病，近期的研究结果更显示，由辅助型t细胞(thelpercells)所调控之介白素(interleukin)，例如il-17，亦是主导自体免疫的重要细胞激素。过去用于治疗自体免疫疾病的主要药物包括：非类固醇抗发炎药、类固醇、免疫调节剂、及免疫抑制剂等。然而，这些药物已知具有副作用风险之外，尚会衍生药物间的交互作用。有鉴于此，新一代的治疗药物多采取免疫标靶疗法，针对自体免疫疾病特有的免疫讯息或分子来设计生物制剂(biologicalagents)，而这些生物制剂可精确地瞄准异常的免疫分子，却不会伤害正常细胞。因此，目前亟需开发一种副作用低且具专一性的生物制剂。技术实现要素：本发明提供一种用于治疗或减缓自体免疫相关疾病的医药组合物，包括草果(amomumtsao-ko)之萃取物为活性成分及药学上可接受的载体或盐类。本发明也提供一种用于治疗或减缓与自体免疫相关之疾病的医药组合物，包括一化合物为活性成分及药学上可接受的载体或盐类，其中该化合物为香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或前述之组合。本发明还提供一种草果之萃取物用于制备治疗或减缓与自体免疫相关之疾病的药物的用途。本发明另提供一种化合物用于制备治疗或减缓与自体免疫相关之疾病的药物的用途，其中该化合物为香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或前述之组合。为了让本发明之上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：附图说明图1显示草果之萃取物he-06对于脂多糖(lipopolysaccharide,lps)所诱发之急性发炎balb/c小鼠模型之tnf-α分泌的抑制情形。**代表p值小于0.01。图2a显示草果之萃取物he-06对于实验性自主免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,eae)c57bl/6小鼠模型之eae发病病程的延缓情形，其中发病病程是以文献上已公认之ataxiascore及eaescore为评分标准，透过连续14天每日观察记录所获得的结果。其中*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。图2b-图2c分别显示草果之萃取物he-06之进一步经减毒步骤所得之2015-0803-2及2015-0909-2萃取物对于eae小鼠模型之发病病程的影响，其中2015-0803-2及2015-0909-2萃取物接投予250mg/kg之剂量。其中**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。图3a-图3e分别显示草果之萃取物he-06之活性分萃区间(i)对于eae急性发炎小鼠模型具缓解与改善的效果，包括延缓eae病程发展、改善eae病症、改善颈椎脱髓鞘症状(demyelination)、以及减少整体脊髓产生脱髓鞘与轴突肿胀(axonalswelling)的情形。其中*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。图4a-图4c分别显示草果之萃取物he-06之活性分萃区间(ii)对于lps所诱发急性发炎小鼠模型之tnf-α分泌的抑制情形、延缓eae小鼠模型之病程发展、以及减缓imq所诱导之类干癣皮肤炎之皮肤发炎病症。其中*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。图5a-图5d分别显示草果之萃取物he-06之活性成份tsaokoin(tk)可抑制el4淋巴癌细胞经诱导发炎后之il-17分泌、抑制lps所诱发急性发炎小鼠模型之tnf-α分泌、延缓eae小鼠模型之病程发展、以及减缓imq所诱导之类干癣皮肤炎之皮肤发炎病症。其中*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。实施方式在本揭露之一态样中，提供一种用于治疗或减缓自体免疫相关之疾病的医药组合物，包括以草果(amomumtsao-ko，简称a.tsao-ko)之萃取物为活性成分及药学上可接受的载体或盐类。上述草果为姜科豆蔻属的多年生常绿草本植物，植物高度可达2.5-3米，生长于热带、亚热带之荫蔽潮湿的林中地带，产地以中国云南及东南亚地区为主，人工栽培已有200多年历史，不仅可作为药材，且因全株有辛香味，其干燥后的果实也可作为调味料，为药食两用的素材。而上述草果之萃取物系萃取自草果的根部、茎、叶、花、果实、种子、树皮或其组合。在一实施例中，上述草果之萃取物可萃取自草果的果实。上述草果之萃取物系由有机溶剂所萃取，所述有机溶剂可包括，醇类、酯类、烷类、卤烷或其组合，但不限于此。上述醇类可以是c1-c12醇类(例如，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、第三丁醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、戊醇、异戊醇、2,3-戊二醇、2,4-戊二醇、环戊醇、己醇、环己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇等)，上述酯类可以是c2-c5酸酯类(例如，乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸戊酯、丙酸戊酯等)，上述烷类可以是c5-c6烷类(例如，正庚烷、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷等)，而上述卤烷例如是氯甲烷、氯乙烷等，但不限于此。在一实施例中，上述草果之萃取物可由乙醇萃取而得。又一实施例中，草果之萃取物可由浓度为50-95％之乙醇萃取而得。其中，用以萃取草果萃取物之乙醇浓度可以为50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％。又一实施例中，用以萃取草果之萃取物之乙醇浓度可以是95％之乙醇。萃取之前，先计算当次所使用的草果重量，接着，以有机溶剂的体积约为草果重量之3-10倍的比例进行萃取。在一实施例中，有机溶剂的体积可以是草果重量之3-7倍。另一实施例中，有机溶剂的体积可为草果重量之5倍。而萃取时，约控制萃取温度为10-35℃，萃取时间为3-10天。在一实施例中，萃取温度可为20-30℃，萃取时间可为5-8天。另一实施例中，萃取温度可为25℃，萃取时间可为7天。在一实施例中，上述草果之萃取物的萃取过程还可配合一震荡模式，此震荡模式可包括水平震荡、垂直震荡、旋转震荡、周转震荡、翘板震荡、超音波震荡或其组合，但不限于此。以及，经前述萃取过程所获得之草果萃取液尚经过一抽气过滤步骤，并以取得之滤液作为草果之萃取物的试验物质，称之为he-06。在一实施例中，上述草果之萃取物he-06还经过一蒸馏的步骤。在另一实施例中，上述草果之萃取物he-06更经过一以低极性溶剂进行加热回流的步骤。另，在一实施例中，上述以草果之萃取物he-06为活性成分之医药组合物具有抑制细胞激素分泌的功能，所述细胞激素可包括il-17、tnf-α或其组合，但不限于此。以及，在又一实施例中，上述以草果之萃取物he-06为活性成分之医药组合物可用于治疗或减缓自体免疫相关疾病，所述治疗或减缓自体免疫相关疾病可包括，但不限于缓解自体免疫相关疾病之症状、或延缓自体免疫相关疾病之病程。其中，所述自体免疫相关疾病可包括多发性硬化症(multiplesclerosis,ms)、视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica,nmo)、急性弥漫性脑脊髓炎(acutedisseminatedencephalomyelitis,adem)、去髓鞘(demyelination)相关神经炎、僵直性脊髓炎(ankylosingspondylitis)、干癣(psoriasis)、干癣性关节炎(psoriaticarthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,ra)、克隆氏症(crohn'sdisease)、幼年型自发性多关节炎(juvenileidiopathicarthritis,jia)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)、或此等疾病的组合，但不限于此等疾病。在一实施例中，上述以草果之萃取物he-06为活性成分之医药组合物可用于治疗或减缓多发性硬化症。在另一实施例中，上述以草果萃取物he-06为活性成分之医药组合物的投予方式可为口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalationspray)或藉由植入贮存器(implantedreservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)动脉(intraarterial)、滑囊(腔)内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位内(intralesional)注射或灌注技术，但不限于此。其中，口服的形式可包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueoussuspensions)、分散液(dispersions)与溶液。在一实施例中，可经由口服或皮下注射方式投予。另，也可在适当期间内依据药学上的例行方法判定患者所适用的投药疗程对其进行多重剂量的投药。上述以草果之萃取物he-06为活性成分之医药组合物更包括此
技术领域：
中熟知的药学上可接受之载体及/或盐类，并以适当比例添加。药学上可接受之载体可包括，但不限于溶剂、分散媒(dispersionmedium)、套膜(coating)、抗菌与抗真菌试剂与一等渗透压与吸收延迟(absorptiondelaying)试剂等与药学投予相容者。对于不同的给药方式，可利用一般方法将药学组合物配置成剂型(dosageform)。而药学上可接受之盐类可包括，但不限于盐类包括无机阳离子，例如，碱金属盐类，如钠、钾或胺盐，碱土金族盐类，如镁、钙盐，含二价或四价阳离子之盐类，如锌、铝或锆盐。此外，也可是为有机盐类，如二环己胺盐类、甲基-d-葡糖胺，胺基酸盐类，如精胺酸、离胺酸、组织胺酸、麸胺酸酰胺。于本揭露之又一态样中，另提供一种如上述之草果之萃取物用于制备治疗或减缓与自体免疫相关之疾病的药物的用途。在本揭露之另一态样中，提供一种用于治疗或减缓与自体免疫相关之疾病的医药组合物，包括一化合物为活性成分及药学上可接受的载体或盐类，所述化合物为香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其组合。其中，上述香草醛及草果素系来自于草果(a.tsao-ko)之萃取物he-06，而此草果之萃取物he-06是以有机溶剂体积/草果重量＝3-10/1，于10-35℃经3-10天震荡所萃取而得。在一实施例中，上述由有机溶剂所萃取出之草果之萃取物he-06更经过一蒸馏的步骤以去除精油部分，再以一低极性溶剂透过一加热回流的步骤进一步减毒且萃取出其中的活性成分。所述低极性溶剂可包括石油醚、c4-c9直链烷类(如正己烷(n-hexane)、正庚烷(n-heptane))、c4-c9环烷类、不饱和苯、酯类、酮类或前述之组合，但不限于此。而关于上述草果之萃取物之萃取部位、所使用之有机溶剂的种类、浓度与体积、以及萃取过程所采用的条件，包括其萃取温度、时间、所配合的震荡模式等，则如同上述说明所记载，于此不再赘述。在另一实施例中，上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其组合为活性成分之医药组合物系具有抑制细胞激素分泌的功能，所述细胞激素可包括il-17、tnf-α或其组合，但不限于此。在又一实施例中，上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其组合为活性成分之医药组合物可用于治疗或减缓自体免疫相关疾病，所述治疗或减缓自体免疫相关疾病可包括，但不限于缓解自体免疫相关疾病之症状、或延缓自体免疫相关疾病之病程。而所述自体免疫相关疾病包括多发性硬化症(multiplesclerosis,ms)、视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica,nmo)、急性弥漫性脑脊髓炎(acutedisseminatedencephalomyelitis,adem)、去髓鞘(demyelination)相关神经炎、僵直性脊髓炎(ankylosingspondylitis)、干癣(psoriasis)、干癣性关节炎(psoriaticarthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,ra)、克隆氏症(crohn'sdisease)、幼年型自发性多关节炎(juvenileidiopathicarthritis,jia)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)、或此等疾病的组合，但不限于此等疾病。在另一实施例中，上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其组合为活性成分之医药组合物可用于治疗或减缓多发性硬化症。又，在一实施例中，上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其组合活性成分之医药组合物的投予方式可包括，但不限于以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalationspray)或藉由植入贮存器(implantedreservoir)的方式进行投予。而关于口服的形式、非口服的形式、以及投药疗程，则如同上述说明所记载，于此不再赘述。上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其组合活性成分之医药组合物更包括此
技术领域：
中熟知的药学上可接受之载剂或盐类，并以适当比例添加。而关于药学上可接受之载体或或盐类的种类，亦如同上述说明所记载，于此不再赘述。因此，于本揭露之另一态样中，可提供一种如上述之化合物用于制备治疗或减缓与自体免疫相关之疾病的药物的用途，其中此化合物为香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其组合。。实施例本揭露之具体实施方式说明如下，然而以下的实施例仅用于进一步揭露本发明之技术内容，不应藉以限制本发明的范畴。实施例1:制备草果之萃取物he-06a.材料以草果之果实为药材，经清洗干净并烘干后，初步以药材粉碎机进行粗粉碎。b.方法取500克上述草果之粗粉碎物，加入5倍体积(即2500ml)的95％乙醇，于25℃以震荡器125rpm约震荡7天，之后收取萃取液进行抽气过滤。接着，将过滤后之滤液定量，并取样2ml进行高效液相层析法(hplc)与薄膜层析法(tlc)之分析，其余滤液减压浓缩至体积约30ml，尔后分装且进行冷冻干燥，即为本揭露之草果之萃取物的试验物质，将其称之为he-06。实施例2:草果之萃取物he-06可抑制il-17分泌a.以el4(murinelymphoma)淋巴癌细胞平台筛选(1)细胞培养el4为小鼠淋巴癌细胞，购自食品工业发展研究所之生物资源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter，简称bcrc)，培养于包含有10％胎牛血清(fetalbovineserum，简称fbs)之rpmi1640培养液中，并添加1.5g碳酸氢钠(sodiumbicarbonate)、1mm丙酮酸钠(sodiumpyruvate)、1x非必需氨基酸(non-essentialaminoacids，简称neaa)、以及0.05mm硫醇基乙醇(2-mecaptoethanol，简称2-me)，培养方式则依据bcrc之建议，以每周2-3次继代培养方式进行培养。(2)il-17分泌及mtt测试于96孔盘中，每孔植入1x105el4淋巴癌细胞，并于实验组之各孔加入适当浓度之10μl草果之萃取物he-06后，置入37℃且包含5％co2之细胞培养箱中培养1小时。接着，添加丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，简称pma或tpa)及离子霉素(ionomycin)作为诱导淋巴癌细胞活化之因子，使pma最终浓度为10ng/ml，而ionomycin最终浓度为5ng/ml，并继续置入细胞培养箱中培养18小时。上述测试中，同时以添加pma(最终浓度10ng/ml)及ionomycin(最终浓度为5ng/ml)者作为对照组。其后，取出上述含el4细胞之96孔盘，以1200rpm离心5分钟，先将上清液(supernatant)转至新的96孔盘，原包含el4细胞之96孔盘中则于各孔加入5μl之5mg/mlmtt，先置于37℃、包含5％co2之细胞培养箱中反应1小时以产生结晶紫，再加入150μl之dmso将结晶紫溶出，之后检测其570nm之吸光值，以评估细胞的存活率。而转至新的96孔盘之上清液，则以mouseil-17elisakit(r&d,dy421e)检测上清液中之il-17含量，所述上清液中之il-17含量即象征细胞所分泌之il-17量。上述il-17含量的检测结果皆先以对照组为100％进行标准化(normalization)，之后计算草果之萃取物he-06抑制il-17分泌之ic50，结果如表一所示。b.以pbl(peripheralbloodleukocyte)大鼠周边血白血球平台筛选(1)细胞培养利用隐静脉采血方式采集sd大鼠(spraguedawleyrat)之血液后置入含edta的离心管中(edta之最终浓度为2mg/ml)充份混合均匀，接着加入约4倍于血液与edta加总体积量之红血球裂解液(acklysisbuffer或redbloodcelllysisbuffer)以破解红血球细胞，期间置于37℃水浴中反应5分钟，再加入约4倍于血液、edta与红血球裂解液加总体积量之缓冲液(pbsbuffer)，以3000rpm离心5分钟后去除上清液，且重复此破解红血球细胞之步骤二次，而离心所得之沉淀部分即pbl，加入适量体积的rpmi细胞培养液进行培养。(2)抑制il-17分泌之测试于96孔盘中，每孔植入2x105pbl细胞，并于实验组之各孔加入适当浓度之10μl草果之萃取物he-06后，置入37℃且包含5％co2之细胞培养箱中培养1小时。接着，添加如上述之pma(最终浓度为10ng/ml)及ionomycin(最终浓度为5ng/ml)作为诱导白血球活化之因子，并继续置入细胞培养箱中培养48小时。上述测试中，同时以添加pma(最终浓度10ng/ml)及ionomycin(最终浓度为5ng/ml)者作为对照组。其后，取出上述含pbl细胞之96孔盘，以3000rpm离心5分钟，先将上清液转至新的96孔盘，原包含pbl细胞之96孔盘中则于各孔加入5μl之alamarblue，先置于37℃、包含5％co2之细胞培养箱中反应4小时，再以elisareader于激发光560nm而发射光590nm进行细胞存活率之检测。而转至新的96孔盘之上清液，则以ratil-17elisakit(ebioscience,88-7170)检测上清液中之il-17含量。上述il-17含量的检测结果皆先以对照组为100％进行标准化，之后计算草果之萃取物he-06抑制il-17分泌之ic50，结果如表一所示。表一、he-06对于el4小鼠淋巴癌细胞及pbl大鼠周边血白血球之抑制il-17分泌之ic50的效果由表一所示之活体外(invitro)细胞检测结果显示，草果之萃取物he-06可抑制经pma及ionomycin诱导之el4淋巴癌细胞与pbl周边血白血球之il-17分泌。实施例3:草果之萃取物he-06可抑制tnf-α分泌(1)实验动物以购自乐斯科生物科技股份有限公司(biolascotaiwanco.,ltd)之6-8周大balb/c公鼠进行此实验。除饲养的条件皆符合国家实验动物规范之外，此批公鼠自取得后即做标示、分笼及秤重，并于一般区检疫室进行为期一周的检疫工作，检疫期间针对活动力与环境适应性做观察，经评估正常后即移入饲养区待实验执行。饲养区之光照时间自动控制为12小时亮、12小时暗，温度控制为23±2℃。期间，小鼠皆可自由取得充分之食物及饮水。本品系小鼠已有丰富的参考资料及相关数据可证实其适用于发炎功能性的评估试验。以下所述发炎模式建立的实验方法并已获得工研院iacuc委员会核准。(2)建立小鼠急性发炎之模式上述小鼠于实验前先进行秤重及分组，使各组平均体重无明显差异。实验前2-4小时，小鼠予以禁食，但仍正常供应饮水。接着，以腹腔注射(ip)方式对每只小鼠投予1mg/kg脂多醣(lipopolysaccharide，简称lps)的刺激(约0.25ml/mouse)，实验组并于lps刺激之前2小时以口服方式投予草果之萃取物he-06，对照组则投予相同体积之溶剂，给药后即持续观察并纪录小鼠的临床症状。上述小鼠经lps刺激1.5小时后，以过量co2执行安乐死，并以心脏采血方式取得小鼠的全血。接着，以6000rpm于4℃离心10分钟后收集血浆，以待进行tnf-α分泌量之分析。(3)tnf-α分泌之检测与分析血浆中tnf-α之分泌量系依照elisa套组所示如下步骤进行分析。首先，在室温下于96孔盘之每孔加入100μl之captureantibody混合液以覆盖各孔的表面。隔夜后，吸干混合液并以每孔300μl之washbuffer清洗三次，接着，每孔加入200μl之blockbuffer于室温下作用1小时，并重复前述之清洗步骤。其后，每孔加入100μl之适当稀释倍数的待测样品(上述血浆)及标准品，于室温下作用2小时，并重复前述清洗步骤。接着，于每孔加入100μl之detectionantibody混合液，于室温下作用2小时，并重复前述之清洗步骤。之后，每孔加入100μl之streptavidin-hrp混合液，先于室温下避光作用20分钟，重复前述之清洗步骤后，再于每孔中加入100μl之substratesolution(tmb)，于室温下再次避光作用20分钟，最后于每孔加入50μl之stopsolution(1nhcl)终止显色反应，并测定od450nm的吸光值。实验结果以所测试数据之平均值(mean)±标准差(standarderror，简称s.e.)来表示，并采用t-test统计比较各组间是否具差异性，以**代表p值小于0.01且表示两组别之间存在统计上之显著差异。实验结果如图1所示。如图1所示，草果萃取物he-06可抑制由lps所诱导急性发炎小鼠中tnf-α的分泌，且抑制程度可达34％，显示草果萃取物he-06可于活体内(invivo)有效抑制因发炎所引起的tnf-α分泌。实施例4:草果之萃取物he-06可延缓eae(experimentalautoimmuneencephalomyelitis)病程发展且改善eae临床症状(1)实验动物以购自国家实验动物中心(thenationallaboratoryanimalcenter,tainan)之约8周大c57bl/6雌鼠进行此实验。经驯化、检疫后，该批小鼠于实际执行eae实验时之周龄约为10-12周。饲养区之光照时间自动控制为12小时亮、12小时暗，温度控制为23±2℃，且相对湿度控制为40-70％。期间，小鼠皆可自由取得充分之食物及饮水，但于eae发病后将于饲育笼的底部额外给予泡软之饲料及洋菜胶果冻，以使发病的小鼠更易取食及补充水分。此外，该批小鼠于检疫及实验期间皆由工研院之兽医师及实验操作人员每日观察及记录其临床症状，以确保实验小鼠的健康状况。(2)建立小鼠自主免疫性脑脊膜炎(eae)之模式上述c57bl/6小鼠先以皮下注射内含200μgmog35-55peptide和400μgmycobacteriumtuberculosish37ra之200μl乳化液，接着立刻以腹腔注射500ng之pertussistoxin，经48小时后，再次以腹腔注射500ng之pertussistoxin，以诱导其发生eae。诱导后第7天起，每天观察且记录上述小鼠之eae临床病症，并依文献上已公认之ataxiascore(神经系统失调分级)及eaescore作为评分标准(ataxiascore及eaescore说明如下)。当小鼠开始出现ataxiascore0++(即eaescore介于0-1之间)时，以s型依序分组，且开始以草果萃取物he-06连续投予14天，期间每日观察该批小鼠状况且依eaescore记录其临床病症，同时以仅投予溶剂者作为对照组。其后，于第15天将小鼠牺牲，并采集其血液与相关器官进行后续分析。(3)ataxiascore及eaescore之记录与数据分析ataxiascore之标准为：0+代表动物行进时后脚呈八字形，会左右摇摆且步态无法平衡；0++代表抓住动物后颈部，观察其尾巴是否可自行抬起，并以手指测试其尾巴张力强弱时，其尾巴出现无法自主抬起且张力减弱情况。而eaescore之判断标准为：score0代表无eae症状；score0.5代表尾巴短暂无力，有时可举起；score1代表尾巴无力，无法正常举起；score2代表尾巴瘫痪或轻微后肢无力；score3代表中度至严重的后肢瘫痪或轻微的前肢无力；score4代表完全的后肢瘫痪或中度至严重的前肢无力；score5代表四肢瘫痪伴随失禁或呈现濒死状态；score6代表动物死亡。实验结果以所记录分数之平均值(mean)±标准差(standarderrorofmean，简称s.e.m.)来表示，并采用t-test统计比较各组间是否具差异性，其中以*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001，且表示两组别之间存在统计上之显著差异。实验结果如图2a所示。如图2a所示，经诱导产生eae之小鼠于发病后14天之临床病症已呈现后肢瘫痪而前肢中重度无力(如上述score4)，而经投予草果之萃取物he-06者可显著延缓eae病程发展，显示草果之萃取物he-06可有效改善eae动物模式之临床症状。实施例5:he-06之活性分萃区间(i)的纯化、制备与减毒测试将草果之萃取物he-06先以水蒸气蒸馏24小时以去除精油部分，再以溶剂进行加热回流(reflux)约8小时以去除药渣并减少毒性成份。以减少毒性成份步骤而言，如以溶剂{n-hexane：ethylacetate＝1：1}进行加热回流8小时，所得之萃取物称之为2015-0803-2，而经eae小鼠模式测试结果，以250mg/ml之2015-0803-2投予10只eae小鼠，虽可改善eae临床症状(如第2b图所示)，但造成有3只小鼠死亡。而若改以低极性溶剂n-hexane进行加热回流8小时，接着采梯度冲提法以n-hexane、etoac及meoh冲提萃取物(即，先利用冲提极性较低的溶剂将容易冲提的物质分离，然后逐渐增加冲提极性高的溶剂量，以致于可将吸附较紧密的物质自管柱中除去)，以进一步执行硅胶管柱划分(silicagelcolumnchromatography)，各划分部分并经细胞活性评估测试后获得其中最佳活性区间，其中所得萃取物称之为2015-0909-2，而经eae小鼠模式测试结果，以250mg/ml之2015-0909-2投予10只eae小鼠，除可改善eae临床症状外(如第2c图所示)，并无造成小鼠死亡。其中以*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。因此，后续以减毒效果较佳之萃取物2015-0909-2作为he-06之活性分萃区间(i)。实施例6:he-06之活性分萃区间(i)可改善eae临床病症除投予的药物更换为he-06之活性分萃区间(i)，而投药浓度为he-06之活性分萃区间(i)：0mg/ml(即对照组vehicle)、30mg/ml、100mg/ml之外，所使用的实验动物、小鼠自主免疫性脑脊膜炎(eae)之模式建立与评分标准皆同于上方记载，于此不再赘述，实验结果如图3a-图3e所示，同时以投予相同体积之溶剂为对照组，且以投予5mg/ml之甲基培尼皮质醇(methylprednisolone，为一类固醇药物，可用于抗发炎)作为正对照组(positivecontrol)。如第3a与3b图所示，经诱导产生eae之小鼠于发病后14天的临床病症已呈现后肢瘫痪而前肢中重度无力(如score4)，而经投予he-06之活性分萃区间(i)30mg/ml及100mg/ml者具明显延缓eae病程发展之功效。其中以*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。又，透过luxolfastblue(lfb)染色来检视神经组织之髓鞘(myelin)，髓鞘为包覆在神经细胞轴突外面的管状鞘，藉由髓鞘染色可用以观察正常及病理情况下之髓鞘是否完整。如第3c图之组织病理染色图所示，he-06之活性分萃区间(i)可明显改善eae动物模式之颈椎脱髓鞘症状。另，依据shackelford等人所发表文献中之组织病理学损伤严重度评分(histopathologicallesionseverityscores)标准来检视脊髓的状况，由病理兽医师来分别评估脊髓包括颈椎(cervicalvertebrae)、胸椎(thoracicvertebrae)及腰椎(lumbarvertebrae)的组织病理分级及髓鞘损害的程度。其中，组织病理学分级标准共分为5个等级：grade1代表出现最小损伤(整体损伤区域<1％)；grade2代表出现轻微损伤(整体损伤区域约1-25％)；grade3代表出现中度损伤(整体损伤区域约26-50％)；grade4代表出现中度到重度损伤(整体损伤区域约51-75％)；grade5代表出现重度损伤(整体损伤区域约76-100％)。观察评分的结果如第3d与3e图所示，经诱导产生eae之小鼠于发病后14天之脊髓产生脱髓鞘(demyelination)及轴突肿胀(axonalswelling)的情形，而经投予he-06之活性分萃区间(i)30mg/ml及100mg/ml者可显著降低eae所引发的脊髓损伤程度，且所投予he-06之活性分萃区间(i)的药效呈现剂量效应，显示he-06之活性分萃区间(i)可有效改善eae动物模式于临床上之脊髓损伤症状。其中*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01。实施例7:he-06之活性分萃区间(ii)的纯化与制备取2.19公斤he-06药材，以16l甲醇加热回流萃取2小时，重复两次以去除药渣，之后合并两次萃取液。接着浓缩两次萃取液至100ml，加入1900ml水均匀分散萃取液，且将萃取液依序以正庚烷及乙酸乙酯分别萃取两次。其后浓缩乙酸乙酯萃取液呈浸膏状26.07克，并取乙酸乙酯浸膏21.27克进行固相吸附萃取。接着，依序以80％正庚烷之乙酸乙酯溶液900ml、60％正庚烷之乙酸乙酯溶液1800ml、55％正庚烷之乙酸乙酯溶液3600ml、40％正庚烷之乙酸乙酯溶液900ml、乙酸乙酯900ml等溶液冲堤，并以每900ml/瓶方式收集且编号为no.1～9。其中no.3即为he-06之活性分萃区间(ii)。实施例8:he-06之活性分萃区间(ii)可抑制il-17及tnf-α分泌(1)抑制il-17分泌之测试除将草果萃取物he-06更换为he-06之活性分萃区间(ii)之外，所使用之el4淋巴癌细胞、培养条件及检测il-17分泌之方法皆同于上方记载，于此不再赘述，il-17分泌之检测结果如表二所示。表二、he-06之活性分萃区间(ii)对于el4小鼠淋巴癌细胞之抑制il-17分泌之ic50的效果由表二所示之活体外(invitro)细胞检测结果显示，he-06之活性分萃区间(ii)可抑制活化之el4淋巴癌细胞之il-17分泌。(2)抑制tnf-α分泌之测试除将草果萃取物he-06更换为he-06之活性分萃区间(ii)之外，所使用之balb/c小鼠、饲养条件、小鼠急性发炎之模式及检测tnf-α分泌之方法皆同于上方记载，于此不再赘述，tnf-α分泌之检测结果如第4a图所示。如第4a图所示，he-06之活性分萃区间(ii)可抑制由lps所诱导急性发炎小鼠中tnf-α的分泌，抑制程度约为16％，显示he-06之活性分萃区间(ii)可于活体内(invivo)抑制因发炎所引起的tnf-α分泌。实施例9:he-06之活性分萃区间(ii)可改善eae临床病症除投予的药物更换为he-06之活性分萃区间(ii)，而投药浓度为he-06之活性分萃区间(ii)：0mg/ml(即对照组vehicle)、30mg/ml、100mg/ml、300mg/ml之外，所使用的实验动物、小鼠自主免疫性脑脊膜炎(eae)之模式建立与评分标准皆同于上方记载，于此不再赘述，实验结果如第4b图所示，同时以投予相同体积之溶剂作为对照组。如第4b图所示，经诱导产生eae之小鼠于发病后14天的eae临床病症已呈现score4之后肢瘫痪而前肢中重度无力病症，而经投予he-06之活性分萃区间(ii)30mg/ml、100mg/ml、300mg/ml者皆具延缓eae病程发展之功效，且呈现剂量效应，显示he-06之活性分萃区间(ii)可有效改善eae动物模式之临床病症。其中以*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。实施例10:he-06之活性分萃区间(ii)可减缓咪喹莫特(imiquimod，简称imq)所诱导之类干癣皮肤炎(psoriasis-likedermatitis)(1)实验动物以购自乐斯科生物科技股份有限公司(biolascotaiwanco.,ltd)之约8周大balb/c公鼠进行此实验。经驯化、检疫后，该批小鼠于实际执行imq诱导类干癣皮肤炎实验时之周龄约为9-10周。饲养区之光照时间自动控制为12小时亮、12小时暗，温度控制为23±2℃，且相对湿度控制为40-70％。期间，小鼠皆可自由取得充分之食物及饮水，并由工研院之兽医师及实验操作人员每日观察及记录其临床症状，以确保实验小鼠的健康状况。(2)建立小鼠类干癣皮肤炎之模式实验开始前，依据小鼠体重随机分组，使各组平均体重及体重分布趋势相近，且将小鼠背上的毛发剃除，剃除区域约4*2cm2，并于第0天开始，每日于每只小鼠之剃毛区域以涂敷方式于皮肤投予3.125mg咪喹莫特(imq)，连续投予6天。同时，依实验设计以管喂(体积10ml/kg)或皮肤涂敷(约30～50mg/mouse)方式投予he-06之活性分萃区间(ii)或溶剂，投予时间同样为6天，并于第6天时以过量co2牺牲小鼠。(3)皮肤发炎程度之记录与数据分析上述皮肤发炎程度系以干癣面积和严重程度指数(psoriasisareaandseverityindex，简称pasi)为标准，针对皮肤红斑(erythema)、皮肤厚度(thickening)、及皱折皮屑(scaling)作相关分析，且依scale0-4层级作如下定义：scale0代表无明显症状，scale1代表症状轻微，scale2代表呈现中度之上述症状，scale3代表已产生中重度之上述症状，而scale4代表已呈现重度之上述症状。将同一只小鼠所观察记录的指数进行累加后，统计各组之平均值(mean)±标准差(standarderrorofmean，简称s.e.m.)，并采用t-test比较各组间是否具差异性，以p值小于0.05表示两组别之间存在统计上之显著差异。实验结果如第4c图所示。如第4c图所示，经imq诱导产生类干癣皮肤炎之小鼠于第2天已开始产生干癣皮肤炎之临床症状，例如皮肤呈现红斑、厚度不均、及皱折皮屑等临床病症，而经投予he-06之活性分萃区间(ii)者可减缓imq所诱导之类干癣皮肤炎的皮肤病状。其中以*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01。实施例11:he-06之化合物活性成份香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin，tk)的分离与制备将草果萃取物he-06先以水蒸气蒸馏24小时以去除精油部分，接着以低极性溶剂如n-hexane进行加热回流(reflux)约8小时，之后采梯度冲提法以n-hexane、etoac及meoh冲提萃取物，并进一步执行硅胶管柱划分，各划分部分经tlc分析，获得各个草果之萃取物he-06之片段，并透过活性测试确认出其中的活性片段。其后，自活性片段单离出2个化合物，并经分析判断此2个化合物为香草醛(vanillin)与草果素(tsaokoin)。接着，分别将含有香草醛或草果素成份之划分部分各自合并，而获得he-06之化合物活性成份香草醛与草果素。实施例12:活性成份tsaokoin(tk)可抑制il-17及tnf-α分泌(1)il-17分泌及mtt测试除将草果萃取物he-06更换为he-06之活性成份tsaokoin(tk)之外，所使用之el4淋巴癌细胞、培养条件、诱导发炎方式、以及il-17分泌与mtt检测方法皆同于上方记载，于此不再赘述，il-17分泌及mtt之检测结果如第5a图及表三所示。表三、活性成分tk对于el4小鼠淋巴癌细胞之抑制il-17分泌之ic50的效果试验样品ic50(μg/ml)tsaokoin(tk)12.1由第5a图所示之活体外(invitro)细胞检测结果显示，he-06之活性成份tsaokoin(tk)可抑制经活化之el4淋巴癌细胞之il-17分泌。(2)抑制tnf-α分泌之测试除将草果萃取物he-06更换为tsaokoin(tk)之外，所使用之balb/c小鼠、饲养条件、小鼠急性发炎之模式及检测tnf-α分泌之方法皆同于上方记载，于此不再赘述，tnf-α分泌之检测结果如图5b所示。如图5b所示，he-06之活性成份tsaokoin(tk)可明显抑制由lps所诱导急性发炎小鼠中tnf-α的分泌，显示tk应可于活体内(invivo)抑制因发炎所引起的tnf-α分泌。其中以***代表p值小于0.001。实施例13:活性成份tsaokoin(tk)可改善eae临床病症除投予的药物更换为he-06之活性成份tsaokoin(tk)，而投药浓度为tsaokoin：0mg/ml(即对照组vehicle)、30mg/ml、100mg/ml之外，所使用的实验动物、小鼠自主免疫性脑脊膜炎(eae)之模式建立与评分标准皆同于上方记载，于此不再赘述，实验结果如图5c所示，同时以投予相同体积之溶剂作为对照组。如图5c所示，经诱导产生eae之小鼠于发病后14天的eae临床病症已呈现score4之后肢瘫痪而前肢中重度无力病症，而经投予tsaokoin30mg/ml、100mg/ml者皆有延缓eae病程发展的趋势，且呈现剂量效应，显示tsaokoin可有效改善eae动物模式之临床病症。其中以*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01；***代表p值小于0.001。实施例14:活性成份tsaokoin(tk)可减缓imq所诱导之类干癣皮肤炎除投予的药物更换为he-06之活性成份tsaokoin(tk)，而投药浓度为tsaokoin100mg/ml之外，所使用的实验动物、类干癣皮肤炎之模式建立与评分标准皆同于上方记载，于此不再赘述，实验结果如图5d所示，同时以投予相同体积之溶剂作为对照组。如图5d所示，经imq诱导产生类干癣皮肤炎之小鼠于第2天已呈现重度皮肤红斑、皮肤厚度不均、及产生皱折皮屑等临床病症，而经投予tsaokoin者可明显减缓imq所诱导之类干癣皮肤炎的皮肤炎病状。其中以*代表p值小于0.05；**代表p值小于0.01。虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之权利要求所界定者为准。当前第1页12