用于治疗或减缓自体免疫疾病、其并发症和/或肾炎的医药组合物以及其有效成分之用途的制作方法

本发明系关于一种用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物以及其有效成分之用途。

背景技术：

自体免疫疾病，是一种人体内自己的免疫系统攻击自己身体正常细胞的疾病。于自体免疫患者中，免疫系统会产生出对抗自己身体内正常细胞(甚至细胞内的各种正常组成部份)的抗体，造成不正常的过度发炎反应或是组织伤害，进而影响身体健康。

而自体免疫性疾病，如红斑性狼疮(lupuserythematosus)通常影响多重器官，包括脑、肺与肾脏。造成红斑性狼疮的确切病因不明，可能与遗传、贺尔蒙、环境与感染有关。尽管红斑性狼疮的死亡率在1950年代之后已经逐渐降低，然而，患者仍受病症反复发作之苦。

因此，目前仍亟需开发一种更有效之针对如红斑性狼疮等的自体免疫疾病治疗药物。

技术实现要素：

本发明提供一种用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物，包括：一有效量之芸香科(rutaceae)植物的萃取物为治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的有效成分，其中该自体免疫疾病系择自于由红斑性狼疮(lupuserythematosus)、干癣(psoriasis)、干癣性关节炎(psoriaticarthritis)、僵直性脊髓炎(ankylosingspondylitis)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、幼年型自发性多关节炎(juvenileidiopathicarthritis)、克隆氏症(crohn'sdisease)与溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)所组成之群组。

本发明也提供一种芸香科植物的萃取物用于制造治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎之药物的用途，其中该自体免疫疾病系择自于由红斑性狼疮、干癣、干癣性关节炎、僵直性脊髓炎、类风湿性关节炎、幼年型自发性多关节炎、克隆氏症与溃疡性结肠炎所组成之群组。

本发明还提供另一种用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物，包括：一有效量之化合物，为治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的有效成分，其中该化合物择自由下列所组成之群组的至少一个：

(a)具有式(i)之化合物：

(b)具有式(ii)之化合物：

以及

(c)具有式(iii)之化合物：

其中r1为c1-c5烷基、r2为h或c1-c3烷基、r3为h或c1-c3烷基、r4为h或c1-c3烷基，而r5为h或c1-c3烷基。

本发明另提供一种化合物用于制造治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎之药物的用途，其中该化合物系择自由下列所组成之群组的至少一个：

(a)具有式(i)之化合物：

(b)具有式(ii)之化合物：

以及

(c)具有式(iii)之化合物：

其中r1为c1-c5烷基、r2为h或c1-c3烷基、r3为h或c1-c3烷基、r4为h或c1-c3烷基，而r5为h或c1-c3烷基。

为了让本发明之上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：

附图说明

图1a显示，黄皮(clausenalansium)之乙醇萃取物he-07对于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中之发炎因子tnf-α产生的影响。

图1b显示，黄皮之乙醇萃取物he-07对于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中之发炎因子il-6产生的影响。

图2a显示，黄皮之乙醇萃取物he-07对于nzbwf1/j小鼠之尿液中的蛋白质含量的影响。

图2b显示，黄皮之乙醇萃取物he-07对于nzbwf1/j小鼠之血清中尿素氮含量的影响。

图2c显示，黄皮之乙醇萃取物he-07对于nzbwf1/j小鼠之血清中肌酸酐含量的影响。

图2d显示，经载剂、黄皮之乙醇萃取物he-07与环磷酰胺(cyclophosphamide,ctx)处理之nzbwf1/j小鼠之肾脏组织病理染色结果。

图2e显示，黄皮之乙醇萃取物he-07对于nzbwf1/j小鼠之肾脏发炎、肾小管病变与肾丝球炎的影响。

图2f显示，黄皮之乙醇萃取物he-07对于nzbwf1/j小鼠之存活率的影响。以kaplan-meier法及graphpadprism6软体进行存活率分析，各组均与载剂组进行比较，结果显示300mg/kghe-07组与载剂组有显著差异(p<0.05)，50mg/kgctx组与载剂组亦有显著差异(p<0.01)。

图3a显示，黄皮之乙醇萃取物he-07对于马兜铃酸诱发肾炎之小鼠之体重变化的影响。

图3b显示，经载剂、黄皮之乙醇萃取物he-07与未经处理之小鼠于马兜铃酸投予后第12天的体重变化。相较于载剂处理组具显著差异：*p<0.05。

图4a显示，经载剂、黄皮之乙醇萃取物he-07与未经处理之小鼠于马兜铃酸投予后第7天的血清中尿素氮(bun)含量。相较于载剂处理组具显著差异：*p<0.05；**p<0.01。

图4b显示，经载剂、黄皮之乙醇萃取物he-07与未经处理之小鼠于马兜铃酸投予后第12天的血清中尿素氮(bun)含量。相较于载剂处理组具显著差异：*p<0.05。

图5a显示，经载剂、黄皮之乙醇萃取物he-07与未经处理之小鼠于马兜铃酸投予后第7天的血清中肌酸酐(cre)含量。相较于载剂处理组具显著差异：**p<0.01。

图5b显示，经载剂、黄皮之乙醇萃取物he-07与未经处理之小鼠于马兜铃酸投予后第12天的血清中肌酸酐(cre)含量。相较于载剂处理组具显著差异：**p<0.01；***p<0.001。

图6显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之6个化合物的结构。

图7a显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中对于发炎因子tnf-α产生的影响。

图7b显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中对于发炎因子mcp-1产生的影响。

图8a显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在红斑性狼疮动物模式中对于小鼠体重的影响。

图8b显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在红斑性狼疮动物模式中对于小鼠存活率的影响。以kaplan-meier法及graphpadprism6软体进行存活率分析，各组均与载剂组进行比较，结果显示300mg/kghe-07-x组与50mg/kgctx组均与载剂组有显著差异(p<0.01)。

图9a显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在红斑性狼疮动物模式中对于小鼠之肾脏发炎的影响。卡方检定(chisquaretest)，*p<0.05(相较于载剂处理)。

图9b显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在红斑性狼疮动物模式中对于小鼠之肾小管病变的影响。卡方检定，*p<0.05(相较于载剂处理)。

图9c显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在红斑性狼疮动物模式中对于小鼠之肾丝球炎的影响。卡方检定，*p<0.05(相较于载剂处理)。

图10a与图10b显示，于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物f4m、f5m、f3m与f6m对于发炎因子tnf-α产生的影响。n＝5，结果显示为平均值±标准差：学生t检验(student’st-test)，**p<0.01；***p<0.001(相较于载剂处理)。

图11a与图11b显示，于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物f4m、f5m、f3m与f6m对于发炎因子il-6产生的影响。n＝5，结果显示为平均值±标准差：学生t检验，*p<0.05；**p<0.01(相较于载剂处理)。

图12a与图12b显示，于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物f4m、f5m、f3m与f6m对于发炎因子mcp-1产生的影响。n＝5，结果显示为平均值±标准差：学生t检验，**p<0.01；***p<0.001(相较于载剂处理)。

图13显示，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之he-07-fr4(其中含有大于80％之化合物f4m)在红斑性狼疮动物模式中对于小鼠存活率的影响。以kaplan-meier法及graphpadprism6软体进行存活率分析，各组均与载剂组进行比较，结果显示50mg/kghe-07-fr4组与载剂组有显著差异(p<0.05)，50mg/kgctx组与载剂组亦有显著差异(p<0.01)。

实施方式

本发明提供一种用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物，其可抑制il-17产生及抑制发炎等，并具有治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的效果。上述自体免疫疾病的例子，可包括，但不限于红斑性狼疮(lupuserythematosus)、干癣(psoriasis)、干癣性关节炎(psoriaticarthritis)、僵直性脊髓炎(ankylosingspondylitis)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、幼年型自发性多关节炎(juvenileidiopathicarthritis)、克隆氏症(crohn'sdisease)与溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)等。

上述本发明之用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物，可包括，但不限于一有效量之芸香科植物的萃取物，其中芸香科植物的萃取物为自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的有效成分。在一实施例中，本发明之用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物，可更包括一药学上可接受之载体或盐类。

于上述本发明之医药组合物中，上述芸香科植物可包括黄皮属(clausena)植物、月橘属(murraya)植物或柑橘属(citrus)植物，但不限于此。又，上述黄皮属植物的例子可包括，但不限于黄皮(clausenalansium)、过山香(clausenaexcavataburm.f.)等。上述月橘属植物的例子，可包括，但不限于山黄皮(murrayaeuchrestifolia)、七里香(murrayapaniculata)等。上述柑橘属植物的例子则可包括，但不限于柚(citrusgrandis)、桶柑(citrustankan)等。

于上述本发明之医药组合物中，上述芸香科植物的萃取物可以一醇类(例如，甲醇、乙醇或丙醇)、一酯类(例如，乙酸乙酯)、一烷类(例如，己烷)或一卤烷(例如，氯甲烷、氯乙烷)萃取而得，但并不以此为限。在一实施例中，上述芸香科植物的萃取物可以乙醇萃取而得。

在一实施例中，上述本发明之医药组合物中，上述芸香科植物的萃取物为黄皮之乙醇萃取物。于此实施例中，黄皮之乙醇萃取物之指标成分可包括o-甲基独活属醇(o-methylheraclenol)、栓翅芹内酯(prangenin)、ζ-黄皮酰胺(ζ-clausenamide)、欧前胡素(imperatorin)、8-牛儿醇基补骨脂素(8-geranyloxypsoralen)与印度黄皮唑碱(indizoline)，但不限于此。又，于此实施例中，于黄皮之乙醇萃取物中对于自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎有治疗或减缓功效的活性成分，可包括，栓翅芹内酯、ζ-黄皮酰胺、欧前胡素、8-牛儿醇基补骨脂素、印度黄皮唑碱或其任意之组合，但不限于此。

在上述芸香科植物的萃取物为黄皮之乙醇萃取物的实施例中，本发明之医药组合物可用于治疗或减缓红斑性狼疮。而上述红斑性狼疮可为全身性红斑性狼疮。又于此实施例中，本发明之医药组合物可用于治疗或减缓红斑性狼疮的并发症，例如狼疮肾炎。再者，于此实施例中，本发明之医药组合物也可用于治疗或减缓一般肾炎。

本发明也提供一种以化合物为主要有效成分之用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物。

上述本发明之用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物，可包括，但不限于，一有效量之化合物，其为治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的有效成分，其中上述化合物系可择自下列化合物之至少一个：

(a)具有式(i)之化合物：

(b)具有式(ii)之化合物：

与

(c)具有式(iii)之化合物：

其中r1为c1-c5烷基、r2为h或c1-c3烷基、r3为h或c1-c3烷基、r4为h或c1-c3烷基，而r5为h或c1-c3烷基。

又，上述自体免疫疾病的例子，可包括红斑性狼疮、干癣、干癣性关节炎、僵直性脊髓炎、类风湿性关节炎、幼年型自发性多关节炎、克隆氏症与溃疡性结肠炎等，但不限于此。

在一实施例中，上述本发明之用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物，可更包括一药学上可接受之载体或盐类。

而于上述本发明之用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物中，具有式(i)之化合物的例子，可包括栓翅芹内酯、欧前胡素、8-牛儿醇基补骨脂素等，但不限于此。具有式(ii)之化合物的例子可包括，但不限于，ζ-黄皮酰胺等。具有式(iii)之化合物的例子可包括，印度黄皮唑碱等，但不限于此。

在一实施例中，于上述本发明之用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物中，具有式(i)之化合物可为栓翅芹内酯、欧前胡素或8-牛儿醇基补骨脂素，具有式(ii)之化合物可为ζ-黄皮酰胺而具有式(iii)之化合物可为印度黄皮唑碱。

在另一实施例中，上述本发明之用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物中系以具有式(i)之化合物为有效成分。于此实施例中，本发明之医药组合物可用于治疗或减缓红斑性狼疮。上述红斑性狼疮可为全身性红斑性狼疮。又于此实施例中，本发明之医药组合物可用于治疗或减缓红斑性狼疮的并发症，例如狼疮肾炎。另外，于此实施例中，本发明之医药组合物可用于治疗或减缓一般肾炎。在一特定实施例中，上述具有式(i)之化合物为8-牛儿醇基补骨脂素。

于上述任何本发明用于治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的医药组合物中，前述药学上可接受之载体可包括，但不限于溶剂、分散媒(dispersionmedium)、套膜(coating)、抗菌与抗真菌试剂与一等渗透压与吸收延迟(absorptiondelaying)试剂等与药学投予相容者。对于不同的给药方式，可利用一般方法将药学组合物配置成剂型(dosageform)。

又，上述药学上可接受之盐类可包括，但不限于盐类包括无机阳离子，例如，碱金属盐类，如钠、钾或胺盐，碱土金族盐类，如镁、钙盐，含二价或四价阳离子之盐类，如锌、铝或锆盐。此外，也可是为有机盐类，如二环己胺盐类、甲基-d-葡糖胺，胺基酸盐类，如精胺酸、离胺酸、组织胺酸、麸胺酸酰胺。

本发明所制备之药物给药可以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalationspray)或藉由植入贮存器(implantedreservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮内(intradermal)静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)、动脉内(intraarterial)、滑囊(腔)内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位内(intralesional)注射以及灌注技术。

口服成分的形式可包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueoussuspensions)、分散液(dispersions)与溶液。

再者，本发明还提供一种芸香科植物的萃取物用于制造治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎之药物的用途。

上述药物可抑制il-17产生及抑制发炎等，并具有治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的效果。而上述自体免疫疾病，可包括，红斑性狼疮、干癣、干癣性关节炎、僵直性脊髓炎、类风湿性关节炎、幼年型自发性多关节炎、克隆氏症与溃疡性结肠炎等，但不限于此。

又，上述芸香科植物可包括黄皮属植物、月橘属植物或柑橘属植物，但不限于此。上述黄皮属植物的例子可包括，但不限于黄皮、过山香等。上述月橘属植物的例子可包括，但不限于山黄皮、七里香等。此外，上述柑橘属植物的例子可包括，但不限于柚、桶柑等。

再者，上述芸香科植物的萃取物可以一醇类(例如，甲醇、乙醇或丙醇)、一酯类(例如，乙酸乙酯)、一烷类(例如，己烷)或一卤烷(例如，氯甲烷、氯乙烷)萃取而得，但并不以此为限。在一实施例中，上述芸香科植物的萃取物可以乙醇萃取而得。

在一实施例中，上述芸香科植物的萃取物为黄皮之乙醇萃取物。于此实施例中，黄皮之乙醇萃取物之指标成分可包括o-甲基独活属醇、栓翅芹内酯、ζ-黄皮酰胺、欧前胡素、8-牛儿醇基补骨脂素与印度黄皮唑碱，但不限于此。又，于此实施例中，于黄皮之乙醇萃取物中对于自体免疫疾病及/或肾炎有治疗或减缓功效的活性成分可包括，但不限于栓翅芹内酯、ζ-黄皮酰胺、欧前胡素、8-牛儿醇基补骨脂素、印度黄皮唑碱或其任意之组合，但不限于此。

在上述芸香科植物的萃取物为黄皮之乙醇萃取物的实施例中，在上述本发明芸香科植物的萃取物用于制造治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎之药物的用途中，所述药物可用于治疗或减缓红斑性狼疮。上述红斑性狼疮可为全身性红斑性狼疮。又于此实施例中，所述药物可用于治疗或减缓红斑性狼疮的并发症，例如狼疮肾炎。再者，于此实施例中，所述药物可用于治疗或减缓一般肾炎。

另外，本发明也提供一种化合物用于制造治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎之药物的用途。上述化合物可择自下列化合物之至少一个：

(a)具有式(i)之化合物：

(b)具有式(ii)之化合物：

与

(c)具有式(iii)之化合物：

其中r1为c1-c5烷基、r2为h或c1-c3烷基、r3为h或c1-c3烷基、r4为h或c1-c3烷基，而r5为h或c1-c3烷基。

上述化合物可为治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎的一有效成分。而上述自体免疫疾病的例子，则可包括红斑性狼疮、干癣、干癣性关节炎、僵直性脊髓炎、类风湿性关节炎、幼年型自发性多关节炎、克隆氏症与溃疡性结肠炎等，但不限于此。

具有式(i)之化合物的例子，可包括栓翅芹内酯、欧前胡素、8-牛儿醇基补骨脂素等，但不限于此。具有式(ii)之化合物的例子可包括，但不限于，ζ-黄皮酰胺等。又，具有式(iii)之化合物的例子可包括，印度黄皮唑碱等，但不限于此。

在一实施例中，于上述本发明之化合物用于制造治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎之药物的用途中，具有式(i)之化合物可为栓翅芹内酯、欧前胡素或8-牛儿醇基补骨脂，具有式(ii)之化合物可为ζ-黄皮酰胺，而具有式(iii)之化合物可为印度黄皮唑碱。

又在一实施例中，在本发明之化合物用于制造治疗或减缓自体免疫疾病及/或其并发症及/或肾炎之药物的用途中，上述化合物系以具有式(i)之化合物为有效成分。于此实施例中，所述药物可用于治疗或减缓红斑性狼疮。上述红斑性狼疮可为全身性红斑性狼疮。又于此实施例中，所述药物可用于治疗或减缓红斑性狼疮的并发症，例如狼疮肾炎。另外，于此实施例中，所述药物可用于治疗或减缓一般肾炎。在一特定实施例中，上述具有式(i)之化合物为8-牛儿醇基补骨脂素。

实施例

a.材料与方法

1.方法1：药材之乙醇萃取物的制备

将药材清洗或烘干后，进行粗粉碎。将500g药材粉末加入5倍体积的95％乙醇，并以25℃震荡萃取一周。将所获得之萃取液进行抽气过滤，以取得滤液并将其定量体积。之后，将滤液取样2ml以进行高效液相色谱分析(highperformanceliquidchromatography,hplc)与薄层色层分析(thinlayerchromatography,tlc)分析。

将其余之滤液减压浓缩至体积约30ml，之后分装至冷冻干燥瓶并进行冷冻干燥，所获得之冷冻干产物即为试验药物(萃取率：约3.5％)。

2.方法2：以周边血液白血球(peripheralbloodleukocyte,pbl)细胞平台筛选抑制il-17分泌的药物

利用隐静脉采血方式取得sd大鼠血液。将大鼠血液加入含edta离心管中(最终浓度为2mg/ml)充份混匀，之后加入4倍体积量的ack缓冲溶液以破解红血球细胞。将上述离心管置于37℃水浴中5分钟，加入4倍体积量的pbs缓冲溶液以3000rpm速度离心5分钟，并除去上清液后。之后，重复破解红血球细胞的步骤二次，并加入适量体积的细胞培养液。

将细胞植入于96孔盘中(2x10⁵个细胞/孔)，加入适当浓度的试验药物(10μl/孔)，并混合均匀。接着，将96孔盘放入37℃且含5％co2之细胞培养箱中培养1小时。之后，于每孔加入刺激物丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,pma)(最终浓度为30ng/ml)及离子霉素(ionomycin)(最终浓度为1μg/ml)。于均匀混合后，将96孔盘置入细胞培养箱中培养48小时。

于培养48小时后，将96孔盘以3000rpm离心5分钟，使细胞沉淀并将上清液(细胞培养液)移至新的96孔盘(约155μl/孔)。

将保留于原96孔盘中之细胞添加alamarblue(5μl/孔)，并放入37℃且含5％co2细胞培养箱中4小时。之后，利用elisa读取仪以激发光560nm与发射光590nm检测细胞存活率。

而将新的96孔盘中之细胞培养液稀释2-4倍后，利用大鼠il-17elisa套组(ebioscience,88-7170)检测其il-17含量。

细胞存活分析与il-17含量分析皆以添加丙二醇甲醚醋酸酯及离子霉素组为100％，并以百分比显示il-17之分泌。

方法3：th17细胞分化试验(th17differentiationassay)

c57bl/6小鼠由国家动物中心购入后即饲养于工研院动物站，并遵循工研院动物站使用实验动物及实验操作之规范(itri-iacuc-2012-025)。

将6-8周龄之c57bl/6小鼠的脾脏取出。之后利用cellstrainer(corning)将脾脏磨碎，并收集细胞悬浮液即为初级脾脏细胞。接着，利用imagmagneticsystem(bdpharmingen)依据其操作步骤自初级脾脏细胞分离出cd4+t细胞。

接着将cd4+t细胞加入24孔细胞培养盘中(5×10⁵个细胞/孔)，其中24孔细胞培养盘需于前一天以anti-cd3(1μg/ml；ebioscience)作吸附处理。然后将anti-cd28(ebioscience)加入24孔细胞培养盘以使t细胞活化，同时加入il-6(peprotech)、tgf-β(peprotech)、anti-ifn-γ(ebioscience)、anti-il-4(ebioscience)、anti-il-2(ebioscience)以进行th17细胞之分化，并于最后加入待测样品。之后，将24孔细胞培养盘置于37℃且含5％co2之培养箱中培养3天。

于培养3天后，将24孔细胞培养盘以1100rpm离心5分钟，使细胞沉淀并将上清液(细胞培养液)移至新的24孔盘(950μl/孔)。

将保留于原24孔盘中之细胞添加alamarblue(abdserotec)(20μl/孔)，并于37℃且含5％co2之培养箱中再培养6小时。于上述培养后，利用连续波长微孔盘分析仪测量细胞于波长570nm与600nm之吸光值，并依据产品建议之分析公式计算细胞存活率。

将上述细胞培养液进行5倍稀释，接着利用市售套组mouseil-17aelisa(ebioscience)并根据产品所建议之操作步骤分析其中之il-17表现量。

4.方法4：以ifn-γ诱导单核球细胞产生cxcl9之试验

自bcrc取得人类单核球细胞(thp-1)细胞。首先，将thp-1细胞(2×10⁴/ml)种于96孔培养盘中。经于37℃且含5％co2之培养箱中培养16小时后，加入重组人类ifn-γ(1mg/ml)与待测样品于96孔培养盘中共同培养24小时。

于培养24小时后，将96孔培养盘以1100rpm离心3分钟，使细胞沉淀并将上清液(细胞培养液)移至新的96孔培养盘(90μl/孔)。

将保留于原96孔盘中之细胞添加alamarblue(abdserotec；cat.no.buf012b)，并于37℃且含5％co2之培养箱中再培养4小时。于上述培养后，利用连续波长微孔盘分析仪测量细胞于波长570nm与600nm之吸光值，并透过下列公式计算细胞存活率：

细胞存活率＝(11,726×实验组od570)–(80,586×实验组od600)/(11,726×对照组od570)–(80,586×对照组od600)×100％，其中，11,726与80,586分别为alamarblue在od570与od600之莫耳吸光系数。

利用人类cxcl9/migduosetelisa(r&d；cat.no.dy392)并根据产品所建议之操作步骤分析细胞培养液之cxcl9表现量。

5.方法5：脂多醣(lipopolysaccharide,lps)诱发小鼠急性发炎模式

5.1balb/c小鼠

6-8周大之balb/c公鼠系购自乐斯科生物科技股份有限公司(biolascotaiwanco.,ltd)。之后进入工研院动物实验站一般小鼠实验区进行为期一周之检疫工作，饲养条件符合国家实验动物规范。进动物当天即将小鼠进行标示、分笼及秤重。于检疫期间观察小鼠之活动力与环境适应性。一周后，若小鼠体重正常增加，则将其移入饲养区等待实验之进行。

饲养区之光照时间自动控制为12小时亮、12小时暗，温度控制为23±2℃。动物可自由取得充分之食物及饮水。本品系实验动物已有丰富的基础参考资料与数据，可适用于发炎性功能评估试验，实验方法已获得工研院iacuc委员会核准。

5.2小鼠之处理

于实验前先将小鼠秤重并分组，使各组平均体重无明显差异，并纪录其临床症状。实验前2-4小时将小鼠禁食，但仍正常供应饮水。在以脂多醣(lipopolysaccharides,lps)刺激前/后特定时间，以口服、腹腔注射(ip)或静脉注射(iv)方式给予小鼠试验药物，给药后观察并纪录小鼠临床症状，对照组则控制为给予相同体积之溶剂。以腹腔注射(ip)方式给予小鼠1mg/kg之脂多醣(0.25ml/小鼠)刺激，观察并纪录小鼠之临床症状。

于以脂多醣刺激后1.5小时，将小鼠以过量co2安乐死，之后以心脏采血方式取得小鼠全血。

小鼠全血以6000rpm于4℃离心10分钟。之后收集血浆，以进行tnf-α、il-6与mcp-1分泌量的测定。

5.3tnf-α、il-6与mcp-1分泌量的测定

血浆中之tnf-α、il-6与mcp-1分泌量系依照elisa套组分析步骤进行分析，步骤简述如下：

室温下，于elisa96孔盘加入捕捉抗体(captureantibody)混合液(100μl/孔)，以覆盖elisa96孔盘的表面。隔夜后，吸干混合液并以清洗缓冲溶液(washbuffer)清洗elisa96孔盘(300μl/孔)，清洗三次，然后将阻碍缓冲溶液(blockbuffer)加至elisa96孔盘(200μl/孔)以覆盖剩余空间，并在室温下作用1小时。重复前述清洗步骤。

接着，将适当稀释倍数之待测样品及标准品加至elisa96孔盘(100μl/孔)，并在室温下作用2小时。然后重复前述清洗步骤。

于清洗后，再将侦测抗体(detectionantibody)混合液加至elisa96孔盘(100μl/孔)，并于室温下作用2小时。重复前述清洗步骤。

再将链霉亲和素-山葵过氧化氢酵素(streptavidin-hrp)混合液加至elisa96孔盘(100μl/孔)，并于室温下避光作用20分钟。重复前述清洗步骤。

之后，将基质溶液(substratesolution)(tmb)(100μl/孔)加至elisa96孔盘，并于室温下避光作用20分钟。最后，将终止溶液(stopsolution)(1nhcl)加至elisa96孔盘(50μl/孔)以终止显色反应，并测定od450nm的吸光值。

5.4统计分析

本试验数据以实验结果之平均值(mean)±标准差(standarderror,s.e.)来表示。采用t-test比较各组间是否具差异性，若p值小于0.05则表示两试验组之间具有统计上显著差异。

6.方法6：nzbwf1/j全身性红斑性狼疮(sle)自体免疫动物模式

6.1nzbwf1/j母鼠

nzbwf1/j母鼠系购自美国thejacksonlaboratory，动物检疫后，代养至适当周龄(约16-25周大)。

实验开始前，根据anti-dsdna抗体数值将小鼠随机分组，之后开始给予测试样品。一周投药5天，连续投药10-18周后牺牲动物。投药期间每周记录体重变化，且每1-2周轻压小鼠腹部使排尿，以试纸及蛋白质测定套组测定尿中白蛋白含量(mg/dl)。

实验结束时，搜集尿液并以心脏采血方式取得小鼠全血。之后取下小鼠肾脏秤重并记录其外观病变，并保存于10％中性福马林中以备做病理切片观察之用。病理评分标准系依文献shackelfordetal.toxicol.pathol.30:93-96做判断，以0-5分表示：0分代表无(notpresent)；1分代表极微(minimal)(<1％)；2分代表轻微(slight)(1-25％)；3分代表中度(moderate)(26-50％)；4分代表中/重度(moderate/severe)(51-75％)；5分代表严重(severe)(76-100％)。

6.2测定尿中蛋白质含量

每1-2周轻压小鼠腹部(膀胱)使其排尿，并将尿液收集于1.5ml离心管中，以尿液试纸测定尿液中的蛋白质含量(mg/dl)。以试纸沾染尿液，静置1分钟，依据试纸呈色结果判定蛋白质含量。其中以“-”代表尿蛋白含量为0mg/dl；以“+/-”代表尿蛋白含量为10mg/dl；以“+”代表尿蛋白含量为30mg/dl；以“++”代表尿蛋白含量为100mg/dl；以“+++”代表尿蛋白含量为300mg/dl；以“++++”代表尿蛋白含量为1000mg/dl。若呈色介于两个区间之间，则取两区间之平均值为尿蛋白数值。

6.3测定血清中尿素氮(bloodureanitrogen,bun)及肌酸酐(creatinine,cre)的含量

以尾巴采血方式自小鼠取得约0.1ml血液。将血液于室温下静置1-2小时后，以6,000rpm于室温离心10分钟。之后取上层血清测定血清中尿素氮(bun)及肌酸酐(cre)的含量。

血清中尿素氮(bun)及肌酸酐(cre)的含量以fujichem4000i干式血清生化仪进行测定，步骤简述如下：

实验前先将尿素氮(bun)及肌酸酐(cre)试片及待测血清置于室温下回温。之后，依仪器指示在试片中央加入10μl之血清原液(如数值超出测定范围则将血清以灭菌水进行适当稀释后测定)，并进行测定。待测定完成则可得到血清中尿素氮(bun)及肌酸酐(cre)的含量(mg/dl)。

7.方法7：马兜铃酸(aristolochicacid,aa)诱发之肾炎模式建立

将雌性balb/c小鼠(lasco,taiwan)以口服方式投予试验药物(250mg/kg及750mg/kg)。3天后，再以腹腔注射每日投予5mg/kg的马兜铃酸至balb/c小鼠。马兜铃酸投予过程中，仍持续投予小鼠试验药物(250mg/kg及750mg/kg)并记录其体重变化。连续注射马兜铃酸12天之后牺牲小鼠，并采集血清以进行后续血清生化值(尿素氮(bun)及肌酸酐(cre))分析。血清生化值以富士干式生化分析仪(4000i,fuji)进行分析。

8.方法8：以el4细胞平台筛选抑制il-17分泌药物

将el4细胞植入于96孔盘(1x10⁵细胞/孔)，加入适当浓度之试验药物(10μl/孔)，并混合均匀。

接着，将96孔盘放入37℃且含5％co2之细胞培养箱中培养1小时。之后，于每孔加入刺激物丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,pma)(最终浓度为10ng/ml)及离子霉素(ionomycin)(最终浓度为5ng/ml)。于均匀混合后，将96孔盘置入细胞培养箱中培养18小时。

于培养18小时后，将96孔盘以1200rpm离心5分钟，使细胞沉淀并将上清液(细胞培养液)移至新的96孔盘(155μl/孔)。

将保留于原96孔盘中之细胞添加5mg/ml之mtt(5μl/孔)，并放入37℃且含5％co2之细胞培养箱中1小时。之后将dmso添加至细胞(150μl/孔)，以将结晶紫溶出。将96孔盘中之液体混合均匀之后，测定各孔于570nm之吸光值，以测定细胞存活率。

而将新的96孔盘中之细胞培养液稀释2-4倍后，利小鼠il-17elisa套组(r&d,dy421e)检测其il-17含量。

细胞存活分析与il-17含量分析皆以添加丙二醇甲醚醋酸酯及离子霉素组为100％，并以百分比显示il-17之分泌。

b.结果

(a)黄皮之乙醇萃取物的作用

以上述方法1获得黄皮之乙醇萃取物，将其命名为he-07。

1.黄皮之乙醇萃取物he-07对于周边血液白血球(peripheralbloodleukocyte,pbl)细胞与th17细胞的影响

分别以上述方法2与方法3来确认黄皮之乙醇萃取物(he-07)对于大鼠周边血液白血球与cd4+t细胞所分化成之th17细胞之存活率与il-17分泌的影响。结果分别如表1与表2所示。

表1、黄皮之乙醇萃取物he-07对于大鼠周边血液白血球之存活率与il-17分泌的影响

表2、黄皮之乙醇萃取物he-07对于cd4+t细胞所分化成之th17细胞之存活率与il-17分泌的影响

表1与表2显示，黄皮之乙醇萃取物he-07可有效抑制两种不同细胞之il-17分泌。

目前已知il-17在自体免疫疾病，如干癣、干癣性关节炎、僵直性脊髓炎等之中扮演了关键性角色，且il-17的单株抗体已于临床实验证实对于上述自体免疫疾病具有显著的治疗效果，此外动物实验与临床资料显示，il-17与红斑性狼疮相关。因此，具备抑制il-17分泌之功效的黄皮之乙醇萃取物应可应用于上述自体免疫疾病的治疗。

2.黄皮之乙醇萃取物he-07对于以ifn-γ诱导单核球细胞所产生cxcl9的影响

cxcl9为红斑性狼疮相关趋化因子。以上述方法4与来确认黄皮之乙醇萃取物he-07对于以ifn-γ诱导单核球细胞所产生cxcl9的影响。结果如表3所示。

表3、黄皮之乙醇萃取物he-07对于以ifn-γ诱导单核球细胞所产生cxcl9的影响

结果显示，黄皮之乙醇萃取物he-07能够有效抑制以ifn-γ所诱导之单核球细胞的cxcl9分泌。

3.黄皮之乙醇萃取物he-07对于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中之发炎因子tnf-α与il-6产生的影响

tnf-α与il-6为目前公认与发炎相关之因子。以上述方法5与来确认黄皮之乙醇萃取物he-07对于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中之发炎因子tnf-α与il-6产生的影响。结果分别如图1a与图1b所示。

依据图1a与图1b可知，于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中，黄皮之乙醇萃取物he-07可显著抑制之发炎因子tnf-α与il-6的产生。

由于黄皮之乙醇萃取物对于tnf-α或il-6有显著的抑制效果，而已知tnf-α或il-6涉及自体免疫疾病，因此应可将黄皮之乙醇萃取物应用于类风湿性关节炎、幼年型自发性多关节炎、克隆氏症、溃疡性结肠炎等自体免疫疾病的治疗或减缓。

4.黄皮之乙醇萃取物(he-07)对于nzbwf1/j小鼠的作用

nzbwf1/j小鼠为常用之全身性红斑性狼疮自体免疫动物模式。以上述方法6来确认黄皮之乙醇萃取物(he-07)对于nzbwf1/j小鼠之作用。结果如第2a至2f图及表4所示。

表4、黄皮之乙醇萃取物(he-07)对于nzbwf1/j小鼠之存活率的影响

kaplan-meier法

图2a显示，黄皮之乙醇萃取物he-07可有效减少nzbwf1/j小鼠之尿液中的蛋白质含量。又，由图2b与图2c可知，黄皮之乙醇萃取物he-07可有效降低nzbwf1/j小鼠之血清中尿素氮与肌酸酐含量。

而依据图2d与图2e可知，于nzbwf1/j小鼠中，黄皮之乙醇萃取物he-07可显著减少肾脏发炎细胞浸润，并显著降低肾小管病变与肾丝球炎。

再者，图2f及表4显示，黄皮之乙醇萃取物(he-07)可显著提高nzbwf1/j小鼠的存活率。

由于黄皮之乙醇萃取物有效改善红斑性狼疮动物模式nzbwf1/j小鼠之肾炎并提高其存活率，因此应可将其应用于治疗红斑性狼疮与狼疮肾炎。

5.黄皮之乙醇萃取物he-07对于以马兜铃酸诱发肾炎之小鼠的作用

以上述方法7来确认黄皮之乙醇萃取物he-07对于马兜铃酸诱发肾炎之小鼠之体重、血清中之尿素氮(bun)含量以及血清中之肌酸酐(cre)含量的影响。结果分别如第3a与3b图、第4a与4b图以及第5a与5b图所示。

第3a与3b图显示，于马兜铃酸诱发小鼠肾炎12天后，黄皮之乙醇萃取物he-07具有减缓小鼠体重下降的效果。

而由第4a与4b图可清楚得知，于马兜铃酸诱发小鼠肾炎后，黄皮之乙醇萃取物he-07显著降低了小鼠血清中之尿素氮(bun)含量。

又，第5a与5b图则显示，于马兜铃酸诱发小鼠肾炎后，黄皮之乙醇萃取物he-07显著降低了小鼠血清中之肌酸酐(cre)含量。

依据上述结果可知，黄皮之乙醇萃取物可有效改善马兜铃酸所诱发之肾炎，应可将其应用于肾炎相关治疗。

(b)黄皮之乙醇萃取物的活性片段与其作用

1.黄皮之乙醇萃取物he-07之活性片段的确认

将黄皮之乙醇萃取物he-07经由高效液相色谱分析与薄层色层分析分析，获得各个黄皮之乙醇萃取物he-07之片段，并进行活性测试，以确认出其活性片段，并将其命名为he-07-x。

之后经由核磁共振光谱法(nuclearmagneticresonancespectroscopy,nmrspectroscopy)分析，确认于he-07-x中之6个化合物，分别编码为f8m、f7m、f6m、f5m、f4m与f3m。

f8m、f7m、f6m、f5m、f4m与f3m之结构如图6所示，其中f8m为o-甲基独活属醇(o-methylheraclenol)、f7m为栓翅芹内酯(prangenin)、f6m为ζ-黄皮酰胺(ζ-clausenamide)、f5m为欧前胡素(imperatorin)、f4m为8-牛儿醇基补骨脂素(8-geranyloxypsoralen)，与f3m为印度黄皮唑碱(indizoline)。

又，上述6个化合物于活性片段he-07-x中之含量，则如表5所示。

表5、活性片段he-07-x中之含量

依据表5可知，化合物f8m、f7m、f6m、f5m、f4m与f3m共占活性片段he-07-x的56.11wt％

2.活性片段he-07-x对于周边血液白血球与el4细胞之il-17分泌的影响

分别以上述方法2与方法8来确认活性片段he-07-x对于大鼠周边血液白血球与el4细胞之il-17分泌的影响。结果如表6所示。

表6、活性片段he-07-x对于大鼠周边血液白血球与el4细胞之il-17分泌的影响

依据表6可知，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x可抑制周边血液白血球与el4细胞分泌il-17。

由于黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x可抑制il-17分泌，而il-17的单株抗体已于临床实验中被证实对于自体免疫疾病具有显著的治疗效果，且动物实验与临床资料显示il-17与红斑性狼疮相关。因此应可将其应用于自体免疫疾病，如干癣、干癣性关节炎、僵直性脊髓炎、红斑性狼疮、狼疮性肾炎等的治疗。

3.活性片段he-07-x对于以ifn-γ诱导单核球细胞所产生cxcl9的影响

以上述方法4与来确认活性片段he-07-x对于以ifn-γ诱导单核球细胞所产生cxcl9的影响。结果如表7所示。

表7、活性片段he-07-x对于以ifn-γ诱导单核球细胞所产生cxcl9的影响

依据表7可知，黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x可抑制th-1细胞分泌cxcl9。

4.活性片段he-07-x对于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中之发炎因子tnf-α与mcp-1产生的影响

tnf-α与mcp-1为目前公认与发炎相关之因子。以上述方法5与来确认活性片段he-07-x在脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中对于发炎因子tnf-α与mcp-1产生的影响。结果分别如第7a图与第7b图所示。

依据第7a图与第7b图可知，于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中，活性片段he-07-x可显著抑制发炎因子tnf-α与mcp-1的产生并具有剂量效应。

由于黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x对于tnf-α或mcp-1有显著的抑制效果，而已知tnf-α及mcp-1涉及自体免疫疾病，因此应可将其应用于类风湿性关节炎、幼年型自发性多关节炎、克隆氏症、溃疡性结肠炎、红斑性狼疮、狼疮性肾炎等自体免疫疾病的治疗或减缓。

5.活性片段he-07-x对于nzbwf1/j小鼠的作用

以上述方法6来确认活性片段he-07-x对于nzbwf1/j小鼠之作用。结果如第8a与8b图与表8，以及第9a至9c图所示。

表8、活性片段he-07-x对于nzbwf1/j小鼠之存活率的影响

kaplan-meier法

第8a图显示，在红斑性狼疮动物模式中，投予300mg/kg之活性片段he-07-x可使小鼠体重稳定地增加。

又，根据第8b图与表8可以清楚得知，在红斑性狼疮动物模式中，投予300mg/kg之活性片段he-07-x可以大幅提高小鼠之存活率。

而依据第9a至9c图可知，在红斑性狼疮动物模式中，投予300mg/kg之活性片段he-07-x可显著减缓小鼠肾脏发炎，并显著降低肾小管病变与减缓肾丝球炎。

由于黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x可有效改善红斑性狼疮动物模式nzbwf1/j小鼠之肾炎并提高其存活率，因此应可将其应用于治疗红斑性狼疮与狼疮肾炎。

(c)黄皮之乙醇萃取物的活性成分与其作用

将前述存在于黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x之6个化合物中占较高重量比例之5个化合物，f7m、f6m、f5m、f4m与f3m进一步确认其个别之功效。

1.黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物对于周边血液白血球与el4细胞之il-17分泌的影响

分别以上述方法2与方法8来确认活性片段he-07-x中之化合物对于周边血液白血球与el4细胞之il-17分泌的影响。结果如表9所示。

表9、活性片段he-07-x中之化合物对于周边血液白血球与el4细胞之il-17分泌的影响

依据表9可知，在从黄皮分离出之上述6个化合物中，f3m(印度黄皮唑碱(indizoline))、f4m(8-牛儿醇基补骨脂素(8-geranyloxypsoralen))、f5m(欧前胡素(imperatorin))、f6m(ζ-黄皮酰胺(ζ-clausenamide))与f7m(栓翅芹内酯(prangenin))具有抑制il-17分泌之活性。

由于f3m(印度黄皮唑碱)、f4m(8-牛儿醇基补骨脂素)、f5m(欧前胡素)、f6m(ζ-黄皮酰胺)与f7m(栓翅芹内酯)可抑制il-17分泌，而il-17的单株抗体已于临床实验中被证实对于自体免疫疾病具有显著的治疗效果，因此应可将其应用于自体免疫疾病，如干癣、干癣性关节炎、僵直性脊髓炎、红斑性狼疮、狼疮性肾炎等的治疗。

4.黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物对于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中之发炎因子tnf-α、il-6与mcp-1产生的影响

以上述方法5与来确认活性片段he-07-x中之化合物对于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中之发炎因子tnf-α、il-6与mcp-1产生的影响。结果分别如第10a与10b图、第11a与11b图与第12a与12b图所示。

第10a与10b图显示，于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中，f4m与f5m可显著抑制发炎因子tnf-α的产生。第11a与11b图显示，于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中，f4m、f3m与f6m可显著抑制发炎因子il-6的产生。而第12a与12b图显示，于脂多醣诱发小鼠急性发炎模式中，f4m、f5m、f3m与f6m皆可显著抑制发炎因子mcp-1的产生。

依据上述结果可知，在从黄皮分离出之上述6个化合物中，f3m(印度黄皮唑碱(indizoline))、f4m(8-牛儿醇基补骨脂素(8-geranyloxypsoralen))、f5m(欧前胡素(imperatorin))与f6m(ζ-黄皮酰胺(ζ-clausenamide))具有抗发炎之活性。

由于f3m(印度黄皮唑碱)、f4m(8-牛儿醇基补骨脂素)、f5m(欧前胡素)与f6m(ζ-黄皮酰胺)对于tnf-α、il-6与mcp-1有显著的抑制效果，因此应可将其应用于类风湿性关节炎、幼年型自发性多关节炎、克隆氏症、溃疡性结肠炎、红斑性狼疮、狼疮性肾炎等自体免疫疾病的治疗或减缓。

5.黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物对于nzbwf1/j小鼠的作用

以上述方法6来确认黄皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物对于nzbwf1/j小鼠之作用。结果如第13图以及表10所示。

表10、活性片段he-07-fr4(含有大于80％之f4m)对于nzbwf1/j小鼠之存活率的影响

kaplan-meier法

第13图及表10显示，在红斑性狼疮动物模式中，投予50mg/kg之活性片段he-07-fr4(含有大于80％之f4m(8-牛儿醇基补骨脂素))12周可显著提高小鼠之存活率。

由于f4m(8-牛儿醇基补骨脂素)可有效改善红斑性狼疮动物模式nzbwf1/j小鼠之存活率，因此应可将其应用于治疗红斑性狼疮。

(d)芸香科植物之乙醇萃取物的作用

将其他芸香科植物分别以上述方法1获得乙醇萃取物。上述其他芸香科植物分别为，属于黄皮属之过山香，属于月橘属之七里香与山黄皮，以及属于柑橘属之柚与桶柑。

以上述方法8来确认其他芸香科植物之乙醇萃取物对于el4细胞之il-17分泌的影响。结果如表11所示。

表11、其他芸香科植物之乙醇萃取物对于el4细胞之il-17分泌的影响

依据表11可知，黄皮之近源属种植物，属于黄皮属之过山香、属于月橘属之七里香与山黄皮，以及属于柑橘属之柚与桶柑之乙醇萃取物皆可抑制el4细胞分泌il-17。

由于，属于黄皮属之过山香、属于月橘属之七里香与山黄皮，以及属于柑橘属之柚与桶柑之乙醇萃取物皆可抑制il-17分泌，而il-17的单株抗体已于临床实验中被证实对于自体免疫疾病具有显著的治疗效果，因此应可将其应用于自体免疫疾病，如干癣、干癣性关节炎、僵直性脊髓炎、红斑性狼疮、狼疮性肾炎等的治疗。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之权利要求所界定者为准。