一种聚氨基酸/MoS2纳米团簇的制备方法及应用与流程

本发明属于生物纳米材料领域，具体来说是一种聚氨基酸/MoS₂纳米团簇的制备方法及应用。

背景技术：

癌症是当前威胁人类健康的最危险疾病之一。近年来，肿瘤的病发率以及因为肿瘤引发的死亡率呈现上升的趋势。传统的肿瘤治疗方法包括常见的手术治疗、放疗以及化疗，针对早期肿瘤患者，手术治疗能够达到较好的效果。但对于晚期患者，手术以及放疗失去治疗价值，多采用化疗药物治疗。而化疗存在着一系列的诸如毒副作用大，可致肿瘤的耐药性等不足。光热治疗是近些年来兴起的一种微/无创肿瘤治疗方式，它利用具有光热效果的材料吸收近红外激光并将之转化成热量，使得在肿瘤内部的温度升高，从而对肿瘤造成杀伤效果，最终消融肿瘤。近红外光（波长范围：700-1100 nm）具有良好的生物组织穿透性，穿透过程光吸收衰减小、且几乎对正常的生物组织无损伤，因而在生物医学领域特别是肿瘤治疗领域展现了良好的应用前景。

在人们日益追求生活质量的今天，设计一种安全高效的肿瘤治疗复合材料具有很重要的研究和实用意义。研究表明，凡是在近红外区域具有吸收激光能力并且具有良好的生物相容性的纳米材料都可以应用于光热治疗的研究。近年来，能够在红外区域有较强吸收的生物纳米材料在肿瘤的光热治疗领域被广泛研究。目前，研究较多的光热材料包括有机聚合物/聚合物、碳纳米材料、硫化铜纳米颗粒、氧化钨、硒化铜以及贵金属纳米材料等。碳材料主要包括碳纳米管及石墨烯，在肿瘤光热治疗研究中备受关注。其中C原子以sp2形式杂化，使得其在近红外区域有较强的吸收。 金纳米材料在生物体中具有良好的生物相容性和特殊的表面等离子体共振特性，因而表现出优异的光热转换性能。贵金属纳米材料在NIR激光辐射条件下会发生明显的形貌变化，最终导致光吸收峰的偏移而大幅影响材料的光热性能。而碳材料的吸收系数相对比较低、光热转化效率低等缺点，限制了其进一步应用。因此，开发新型的具有良好的光热稳定性和较高的光热转换效率的光热转换材料是肿瘤的光热治疗研究领域的当务之急。

作为一种最新开发出来的纳米材料，二维纳米片显示出了与其超薄和二维“类石墨烯”结构密切关联的特殊性质，如极高的比表面积和较强的表面吸附特性等。正是因为这些特殊性质，二维过渡金属硫化物（transition metal dichalcogenides，TMDs）在生物医学领域的应用受到了广泛关注。作为TMDs的一员，MoS₂因具有低成本、低毒、光热转换高等优点受到众多研究者的关注。目前，MoS₂纳米颗粒（纳米团簇）的制备过程中多需要添加有毒有害试剂（如水合肼）等，产量低，有背绿色化学合成的原理；而且，所得纳米团簇需要进一步修饰才可以符合应用要求，修饰工艺复杂，限制了基于MoS₂纳米颗粒（纳米团簇）应用。

迄今为止，本领域尚未开发一种能够同步实现对MoS₂纳米团簇的绿色合成和表面修饰的方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种聚氨基酸/MoS₂纳米团簇的制备方法及应用，所述的这种聚氨基酸/MoS₂纳米团簇的制备方法及应用要解决现有技术中的MoS₂纳米团簇合成效率低、合成过程中有有毒溶剂使用，表面修饰繁琐，且纳米团簇光热转化效率低的技术问题。

本发明提供了一种聚氨基酸/MoS₂纳米团簇的制备方法，将钼源、硫源与聚氨基酸同时溶于蒸馏水中，所述的钼源的浓度为1-100 mg/mL，所述的硫源的浓度为1-100 mg/mL，所用的聚氨基酸的浓度为1-100 mg/mL，搅拌均匀后将所得溶液转移至对位聚苯内衬的不锈钢反应釜中密封反应，反应温度为150-250 ℃，反应时间为12-24小时，将所得产物分别用乙醇胺水溶液和蒸馏水清洗3-5次，即得聚氨基酸/MoS₂纳米团簇。

进一步的，所述的搅拌时间均为30-120分钟。

进一步的，乙醇胺水溶液的体积百分比浓度为40-60%。

进一步的，所述的聚氨基酸为聚赖氨酸、α-聚谷氨酸、γ-聚谷氨酸、聚乳酸、或者聚羟基乙酸中的任意一种或两种以上的组合。

进一步的，所述的聚氨基酸为γ-聚谷氨酸，分子量为1000kDa。

进一步的，所述的聚氨基酸的分子量为10kDa-1000kDa。

进一步的，所述的钼源为四水合钼酸铵（(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O）、或者(NH₄)₂MoS₄等可溶性钼盐；所述的硫源为硫脲（(NH₂)₂CS）、或者(NH₄)₂MoS₄。

进一步的，所述的硫源和钼源均为(NH₄)₂MoS₄。

本发明还提供了上述的制备方法获得的聚氨基酸/MoS₂纳米团簇。

本发明还提供了上述的聚氨基酸/MoS₂纳米团簇在制备治疗肿瘤的药物或者试剂中的用途。

本发明采用的聚氨基酸起到了两方面作用：①在水热合成过程中聚氨基酸同步修饰在MoS₂纳米材料表面，省去了额外的化学修饰；②聚氨基酸与合成MoS₂纳米材料前驱体钼源中Mo离子之间存在配位作用，这种配位作用致使MoS₂纳米材料的形貌为团簇状。本发明的这种纳米团簇由MoS₂纳米片堆积而形成，在堆积过程中纳米片之间留有丰富的孔隙结构。类似于其他具有孔隙结构的纳米材料（如介孔SiO₂），这种孔隙结构也可以吸附、截留和负载小分子药物，DNA/RNA等活性物质，这为设计基于这种团簇结构的多功能纳米平台奠定了基础。本发明的这种纳米团簇的表面修饰有一定量的聚氨基酸聚合物链，聚氨基酸链段中的-COOH易于与多种不同的基团结合而引入其他功能小分子，大分子等物质，这对于纳米团簇的表面多功能化修饰具有重要意义。

本发明工艺简单，避免了水合肼等有毒有害试剂的使用，合成过程中同步实现了产品的表面修饰，产品易得；通过将一种水溶性、可生物降解性和生态友好型的生物高分子γ-PGA添加到MoS₂的合成体系中，一步法制备了表面修饰有γ-PGA的γ-PGA/MoS₂纳米团簇。团簇结构的形成与Mo⁴⁺离子和γ-PGA链中羧基上氧原子的配位作用有关。在这种配位作用影响下，MoS₂不再按照传统的二维材料的方式的生长，而是在各个方向的生长均受到了限制。另外，这种配位作用也使得γ-PGA得以修饰于产物表面，即一步反应实现了材料的合成和表面修饰。研究表明，这一γ-PGA/MoS₂纳米团簇具有良好的胶体稳定性和细胞相容性。由于MoS₂自身存在着较宽的导带宽度，结构中电子能态密度上存在丰富的范霍夫奇点，使得MoS₂与外加激光之间发生了强的相互作用，从而导致了强光吸收。这种强光吸收赋予了纳米团簇优异的光热转化性能，在波长为808nm的近红外激光照射下，溶液温度可以迅速的上升，有望在肿瘤的光热治疗等领域得到应用。

本发明通过向水热反应体系中添加一定比例的聚氨基酸（优选地，本发明中所采用的聚合物为分子量为100kDa的γ-PGA），在合成MoS₂纳米团簇的同时，同步实现对MoS₂纳米团簇的表面-COOH修饰。反应过程中产生的少量H₂S气体可通过后续的乙醇胺水溶液清洗的方式有效地去除。γ-PGA/MoS₂纳米团簇具有较宽的光吸收特性，对近红外激光具有较强的吸收。纳米团簇显示出了优异的光热转化能力，且这种光热转化显现出了浓度和激光密度依赖性,有望在肿瘤的光热治疗等领域得到应用。因此，本发明的制备方法简单易行、产量高，适合规模化工业生产。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明通过在水热反应体系中添加聚氨基酸的方法实现对MoS₂纳米团簇表面的修饰和纳米团簇的制备，经实验发现，添加一定浓度的聚氨基酸于溶剂热反应体系中，通过水热反应可以制得聚氨基酸/MoS₂纳米团簇，通过对其测试及表征，该材料具有优异的胶体稳定性和良好的光热转换效应，同时，具有优异的胶体稳定性、细胞相容性和良好的光热转换效应并可以用于肿瘤的光热治疗研究等，进一步发展可为临床肿瘤热疗材料提供新思路。

附图说明

图1为γ-PGA/MoS₂纳米团簇的SEM、TEM图。SEM结果显示所制备的纳米团簇呈均匀的球状（图1（a）），TEM观察结果表明所得团簇结构由MoS₂纳米片组成（图1（b）），团簇的直径为197.3 ± 26.6 nm。团簇结构的形成可能与Mo⁴⁺离子的4d电子亚层中空轨道和γ-PGA分子链中氧原子的孤对电子二者的配位作用有关。在这种配位作用的束缚下，MoS₂不再按照传统的二维材料的方式的生长，而是在各个方向的生长均受到了限制，进而形成团簇结构。

图2为（a）MoS₂纳米片（制备方法Biomaterials,2015;39:206.）和γ-PGA/MoS₂纳米团簇的FTIR图谱；（b）γ-PGA/MoS₂纳米团簇的Uv-Vis-NIR曲线。可以看出，团簇结构在1650 cm^-1及1077 cm^-1处出现振动吸收峰，此为γ-PGA分子；该团簇在1466 cm^-1以及490 cm^-1处现MoS₂分子特征吸收峰；团簇结构在1060 cm-1处显示出了-C-O-的振动吸收峰，说明了γ-PGA分子链已经成功地连接在MoS₂纳米团簇的表面，这部分γ-PGA分子链可以有效地改善纳米团簇的胶体稳定性。（b）不同浓度的γ-PGA/MoS₂纳米团簇紫外-可见-近红外吸收光谱图。由图（b）可以看出不同浓度的γ-PGA/MoS₂均可以吸收一定强度的波长为808 nm的NIR激光。可以预计，上述不同材料吸收的这部分NIR激光将转化为热量。

图3为（a）为γ-PGA/MoS₂纳米团簇的X射线衍射图谱，材料的X射线衍射图谱和MoS₂标准图谱（JCPD 73-1508）各晶面位置基本吻合。（b）Mo、（c）S的X-射线光电子能谱谱图；对比文献可知产物中Mo和S的价态均为Mo⁺⁴和S^-2。γ-PGA分子链引入后，Mo 3d 3/2、Mo 3d 5/2，S 2p 1/2、S 2p 3/2轨道的结合能均升高。可能是因为γ-PGA引入至溶剂热反应体系后，所得的产物为无机/有机杂化体系。XRD和XPS的结果表明本研究中纳米团簇的化学本质为MoS₂，且表面被部分γ-PGA链包裹，最终形成了γ-PGA/MoS₂有机/无机杂化体系。

图4为（a）γ-PGA/MoS₂纳米团簇在去离子水、生理盐水和1640细胞培养基中的水合动力学直径。（b）不同γ-PGA/MoS₂纳米团簇溶液的照片。很明显，团簇结构可以均匀地分散于上述三种介质中，且团簇结构在不同介质中的水合动力学直径并没有发生明显的变化（水合动力学半径分别为290.4 nm（蒸馏水），314.5 nm（PBS）,254.5 nm（RPMI 1640培养基）），证明材料具有良好的胶体稳定性，为进一步在细胞水平发挥它们的光热转换能力奠定了基础。

图5为（a）在不同功率条件，不同Mo浓度γ- PGA/MoS₂纳米团簇分散液温度随辐射时间的变化示意图；从图5（a）可以看出，纳米团簇显示出了优异的光热转化能力，且这种光热转化显现出了浓度和激光密度依赖性。具体来说，用密度为1 w/cm²的NIR激光照射浓度为1mg/mL的纳米团簇溶液，1 min内溶液温度即可以升高近40℃（39.93℃）；继续施加激光，溶液的温度趋于稳定，5 min内温度基本上不在变化，激光致升温过程和溶液与外界的温度扩散达到动态平衡。保持激光密度不变，溶液浓度降低至0.5 mg/mL时，其仍保持良好的光热转化特性，激光照射 1min溶液温度即上升26.5℃。在密度为0.6 W/cm²的NIR激光照射下，纳米团簇溶液的温度变化仍十分明显，1 min内可以升高逾20℃（20.46℃）；同样，在后续几分钟的激光辐射中，溶液温度变化不再明显，并逐渐与散热过程达到平衡。图5（b）为与（a）图对应的红外成像图片，进一步定性地证明了γ-PGA/MoS₂纳米团簇具有优异的光热转化特性。

图6为（a）与不同浓度的γ-PGA/MoS₂纳米团簇共孵育24h后L929细胞的成活率；如图6（a），CCK-8结果表明在材料浓度为0.4 mg/mL时，L929细胞的成活率仍然超过80%（80.5±1.6%），证明此浓度的材料对细胞成活率的影响仍不明显。图6（b，c）分别为对照组（未与纳米团簇共培养）和实验组（细胞与0.4mg/mL纳米团簇共培养24h）的细胞形貌，除了部分材料富集在细胞膜周围外，细胞的形貌并未被明显破坏，细胞仍然贴壁（96孔细胞培养板）生长。为了更直观地观察与材料共培养24h后细胞的成活情况，本研究用台盼蓝溶液对图6（c）中的细胞进行了染色处理。在台盼蓝染色过程中，死亡的细胞会被染成明显的蓝色，而成活的细胞不会被台盼蓝染色。从图6（d）中可以看出，图6（c）中细胞的成活情况良好，进一步证实了CCK-8的结论（图6（a））。综上所述，在实验浓度范围内（0-0.4 mg/mL），无论CCK-8分析，细胞形貌观察，抑或是台盼蓝染色均证明了纳米团簇具有良好的生物相容性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

称取0.1 g 四硫代钼酸铵和1 g γ- PGA（分子量 1000kDa），与20 mL 蒸馏水混合，室温下搅拌0.5 h，得澄清透明溶液。将所得溶液转移至100 mL容积的对位聚苯内衬的不锈钢反应釜中密封。将反应釜置入高温烘箱中220 ℃热处理12 h，待自然冷却至室温后，离心分离反应混合物，并用50%（体积分数，下同）的乙醇胺溶液和蒸馏水各洗涤3次，即得γ-PGA/MoS₂纳米团簇。

实施例2

通过TEM观察材料的微观形貌：将适量纳米团簇分散于无水乙醇中，超声分散均匀后，将镀有碳膜的铜网浸入上述无水乙醇中。待样品自然干燥后，通过TEM观察、拍照，TEM操作电压为200 kV。用Image J 1.40G软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html，National Institutes of Health，美国）测量纳米团簇的直径（每个样品至少测量50次）。TEM观察结果(图1a)显示，所得到的γ-PGA/MoS₂纳米团簇具有片层结构。用Image J 1.40G软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html，National Institutes of Health，美国）测量纳米团簇的直径（至少测量50个不同的团簇颗粒），γ-PGA/MoS₂纳米团簇的直径为197.3 ± 26.6 nm。

实施例3

用Thermal Scientific公司的ESCAlab250型X射线光电子能谱仪（XPS）表征纳米团簇中Mo和S元素的化合价。激发源为单色器Al Kα X射线（λ = 0.8339 nm），能量为1486 eV，线宽为0.9 eV，功率为150 W。结合能用C的1s峰（284.8 eV）校正。使用XRD（Rigaku D/max-2200 PC，日本）研究纳米团簇的XRD衍射图谱的晶体结构。以Cu2Kα射线为光源，操作电压为40 kV，电流为200 mA，扫描角度（2θ）范围为3° - 70°。使用FTIR（Nicolet Nexus 670红外光谱仪）和UV-Vis-NIR（Lambda 25，Perkin Elmer公司，美国）对γ-PGA/MoS₂纳米团簇表征。对于FTIR表征，取少许粉体和PGA粉体（对照组），与干燥的KBr粉末混合研磨均匀后压片。置于Nicolet Nexus 670红外光谱仪样品架上进行扫描（扫描范围0-4000cm-1）；对于UV-Vis-NIR表征，取特定Mo浓度的γ-PGA/MoS₂纳米团簇，用UV-Vis-NIR分析其光吸收性质（波长范围500-1100 nm）。使用英国马尔文公司的Zetasizer Nanoseries（Nano ZS90）测量表征纳米团簇在不同分散介质中的粒径。

从γ-PGA/MoS₂的傅里叶变换红外光谱图2（a）中可以清晰地探测出γ-PGA的振动吸收峰，进一步说明γ-PGA分子链已经成功地连接在MoS₂纳米团簇的表面。由图2（b）可以看出，不同浓度的γ-PGA/MoS₂纳米团簇均可以吸收一定强度的波长为808 nm的近红外激光；可以预计，这种MoS₂纳米团簇吸收的这部分近红外激光将转化为热量，因而具备近红外光吸收-热转化能力。X射线衍射图谱（图3（a））和MoS₂标准图谱（JCPD 73-1508）各晶面位置吻合，进一步证明了这种合成方案的可行性。图3（b）和（c）所示为产物中Mo和S的价态均为Mo⁺⁴和S^-2。但Mo3/2d、Mo5/2d，S1/2p、S3/2p轨道的结合能均有所升高。可能是因为γ-PGA链接在MoS₂纳米团簇表面，所得的产物为无机/有机杂化体系。

实施例4

将γ-PGA/MoS₂纳米团簇分散水中，得具有不同浓度的悬浮液。用所列出的预先设定功率的808 nm波长的近红外激光照射分散液，通过FLIR E60红外热像仪记录材料在不同功率条件下分散液温度随时间的变化情况及对应的红外热成像照片。从图5可以看出，γ-PGA/MoS₂纳米团簇能有效地进行光热转换而升高温度。相同的材料浓度时，施加的激光密度越高，能量越大，进而水温升高越高。具体来说，用密度为1 w/cm²的NIR激光照射浓度为1mg/mL的纳米团簇溶液，1 min内溶液温度即可以升高近40℃（39.93℃）；继续施加激光，溶液的温度趋于稳定，5 min内温度基本上不在变化，激光致升温过程和溶液与外界的温度扩散达到动态平衡。保持激光密度不变，溶液浓度降低至0.5 mg/mL时，其仍保持良好的光热转化特性，激光照射 1min溶液温度即上升26.5℃。在密度为0.6 W/cm²的NIR激光照射下，纳米团簇溶液的温度变化仍十分明显，1 min内可以升高逾20℃（20.46℃）；同样，在后续几分钟的激光辐射中，溶液温度变化不再明显，并逐渐与散热过程达到平衡。图5（b）为与（a）图对应的红外成像图片，进一步定性地证明了γ-PGA/MoS₂纳米团簇具有优异的光热转化特性。

实施例5

细胞相容性实验：选用L929细胞为样本，用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法验证γ-PGA/MoS₂纳米团簇的生物相容性。具体步骤如下：收集对数期L929细胞，以10000细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，置于CO₂培养箱中培养24 h后，向各孔中加入梯度浓度的γ-PGA/MoS₂纳米团簇并培养24 h。根据CCK-8试剂盒说明书，向每孔中加入100 μL CCK-8工作液。继续培养1 h后，利用BioTek酶标仪读取450 nm处的吸光值，分析评价不同浓度材料对L929细胞的分裂的影响。CCK-8实验结束后，用生理盐水清洗3次，使用相差显微镜（Leica DM IL LED，德国）观察与材料共培养24 h后的L929细胞的微形貌。每孔加入1ml的台盼蓝染色液。染色10 min后，用生理盐水洗净台盼蓝染色液3次，使用相差显微镜（Leica DM IL LED，德国）观察台盼蓝对细胞的染色情况。如图6（a），CCK-8结果表明在材料浓度为0.4 mg/mL时，L929细胞的成活率仍然超过80%（80.5±1.6%），证明此浓度的材料对细胞成活率的影响仍不明显。图6（b，c）分别为对照组（未与纳米团簇共培养）和实验组（细胞与0.4mg/mL纳米团簇共培养24h）的细胞形貌，除了部分材料富集在细胞膜周围外，细胞的形貌并未被明显破坏，细胞仍然贴壁（96孔细胞培养板）生长。为了更直观地观察与材料共培养24h后细胞的成活情况，本研究用台盼蓝溶液对图6（c）中的细胞进行了染色处理。在台盼蓝染色过程中，死亡的细胞会被染成明显的蓝色，而成活的细胞不会被台盼蓝染色。从图6（d）中可以看出，图6（c）中细胞的成活情况良好，进一步证实了CCK-8的结论（图6（a））。综上所述，在实验浓度范围内（0-0.4 mg/mL），无论CCK-8分析，细胞形貌观察，抑或是台盼蓝染色均证明了纳米团簇具有良好的生物相容性。

实施例6

称取0.1236 g四水合钼酸铵、0.2283g硫脲和1 g γ- PGA（分子量 1000kDa），与20 mL 蒸馏水混合，室温下搅拌0.5 h，得澄清透明溶液。将所得溶液转移至100 mL容积的对位聚苯内衬的不锈钢反应釜中密封。将反应釜置入高温烘箱中220 ℃热处理12 h，待自然冷却至室温后，离心分离反应混合物，并用50%（体积分数）的乙醇胺溶液和蒸馏水各洗涤3次，即得γ-PGA/MoS₂纳米团簇。