一种水溶性聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物及其制备方法与流程

本发明属于医药合成技术领域，具体涉及一种水溶性聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物及其制备方法。

背景技术：

一氧化碳(CO)由于其对血红蛋白的强亲和力而普遍认为是一种高毒致命的气体分子。由于其无色无味并且难以识别到，CO中毒事件经常发生。尽管CO具有高毒性，近年来科学研究也表明，CO可以在生物体内通过人体血红素的分解以及其它一系列代谢活动产生，并发挥着重要的生理或病理作用，是一种重要的信使分子。通过CO载体及一氧化碳释放分子(CORMs)可作为解决生理环境下传输CO的新方法。然而，现有大部分CORMs先导结构水溶性较差，需有机溶剂溶解后进行释放CO研究，难以用于以水为介质的生物体系。

J.Lewis等人首次发现了羧酸与Ru₂(CO)₄双金属骨架结构桥连配位形式。1977年，H.Schumann等人得到丙酸桥跨含双电子的三叔丁基膦轴向配位的锯马钌羰基物的单晶结构，验证了双配位模式。在此结构中，多功能化的羧酸及含N、P、S原子配体作为配位外界，可分别调控双层锯马结构的稳定性及生物响应性。近年来，锯马羰基钌结构开始应用于生物医学、催化及材料等研究领域(Dalton Trans,1997年,4351-4356页)。

M.J.小组发现水溶性CORM-3与蛋白质可快速配位，并失去所有的非羰基配体和一分子的CO，形成蛋白CORM加合物。在溶液体系中、细胞内及老鼠体内，此加合物可自发的释放出CO，表现出抗炎作用。选择功能聚合物的骨架结构，与CORM先导物结合，可以调控目标CORMs水溶解性和靶向释放性能(Angew.Chem.,2015年,第127卷1188-1191页)。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于克服现有锯马结构存在的水溶性较差的缺点，提供一种热稳定较好、毒性较低且具有较好的水溶性和生物相容性、能够实现缓释一氧化碳的非离子型水溶性聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，以及该化合物的制备方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是该水溶性聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物的结构式如下所示：

该化合物的结构式为：

结构式中L′代表二甲基亚砜、吡啶、三苯基膦中的任意一种，m为乙二醇结构单元的聚合度，该化合物的分子式为[Ru₂(CO)₄(μ²-η²-O₂CCH₂CH₂CO₂-mPEG_n)₂(η¹-L′)₂]，分子式中mPEG代表聚乙二醇单甲醚，n为聚乙二醇单甲醚的数均分子量，n的取值为1000～10000，优选n的取值为2000～5000。

上述水溶性聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物的制备方法为：在无水无氧和惰性气体保护下，将Ru₃(CO)₁₂和聚乙二醇单甲醚丁二酸酯(mPEG_n-OOCCH₂CH₂-COOH)按摩尔比为1:2～4加入甲苯中，110～130℃反应6～12小时，然后将反应液降至40～60℃；将配体溶解于二氯甲烷和甲醇体积比为1:1的混合溶剂后加入反应液中，搅拌反应1～3小时，其中配体的加入量为Ru₃(CO)₁₂摩尔量的2～4倍；反应结束后，过滤、干燥、纯化，得到水溶性聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，具体反应方程式如下：

上述制备方法中，优选Ru₃(CO)₁₂与聚乙二醇单甲醚丁二酸酯、配体的摩尔比为1:3:3。

上述的聚乙二醇单甲醚丁二酸酯中聚乙二醇单甲醚部分的数均分子量为1000～10000，优选聚乙二醇单甲醚部分的数均分子量为2000～5000，其是以甲苯为溶剂，在氮气保护下将数均分子量为1000～10000的聚乙二醇单甲醚和丁二酸酐、三乙胺按摩尔比为2:4:3，60℃回流反应8小时制备得到。

上述的配体是二甲基亚砜、吡啶、三苯基膦中的任意一种。

本发明的有益效果如下：

1、本发明通过对水溶性较差的锯马结构的桥连配体进行聚乙二醇化修饰，不仅增加了锯马结构的热稳定性、生物相容性，降低了分子的毒性，并且极大地增加了分子的水溶性。

2、本发明合成方法简单，所得聚乙二醇化锯马型化合物在紫外光照射下能够迅速释放CO分子，较好的水溶解性是该化合物在药物应用领域方面的敲门砖。

3、本发明聚乙二醇化锯马型化合物的半衰期均在150s以上。

附图说明

图1是实施1～6制备的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物logP与t_1/2关系的柱状图。

图2是实施例1制备的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物对不同浓度RAW264.7细胞存活率影响的柱状图。

图3是实施例1制备的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物对不同浓度HT29细胞存活率影响的柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

制备分子式如下的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物：

[Ru₂(CO)₄(μ²-η²-O₂CCH₂CH₂CO₂-mPEG₂₀₀₀)₂(η¹-SO(CH₃)₂)₂]

称取200mg(0.31mmol)Ru₃(CO)₁₂和1.9688g(0.93mmol)聚乙二醇单甲醚丁二酸酯(mPEG₂₀₀₀-OOCCH₂CH₂-COOH)置于Schlenk瓶中，采用真空线操作技术，在N₂保护下加入5mL干燥的甲苯作为溶剂，120℃加热回流反应8小时，然后将反应液降温至50℃；将66.05μL(0.93mmol)二甲基亚砜溶解于2mL二氯甲烷和甲醇体积比为1:1的混合溶剂后加入到上述降温至50℃的反应液中，50℃搅拌反应2小时，反应结束后过滤，向滤液中加无水乙醚放入冰箱，待析出沉淀后抽滤，室温真空干燥，得到深黄色粉末244mg，即聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，其产率为56％。

所得产物的结构表征数据为：IR(CH₂Cl₂,cm^-1):V(co)＝2047vs,2002m,1973vs,V(co-ester)＝1736m,V(co-acid)＝1574m,1444m；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.17(t,4H,CH₂),3.88-3.42(m,PEG),3.36(s,6H,OCH₃),2.56(dd,8H,CH₂CH₂CO₂),2.07(s,12H,CH₃)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ200.12(CO),186.01(COOCH₂),172.28(COO),71.90(PEG),70.53(PEG),68.92(PEG),63.85(PEG),58.98(OCH₃),41.93(CH₃),31.51(CH₂),30.16(CH₂)。

实施例2

制备分子式如下的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物：

[Ru₂(CO)₄(μ²-η²-O₂CCH₂CH₂CO₂-mPEG₂₀₀₀)₂(η¹-NC₅H₅)₂]

在实施例1中，所用的二甲基亚砜用等摩尔吡啶替换，其它步骤与实施例1相同，得到淡绿色粉末状固体276mg，即聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，其产率为48％。

所得产物的结构表征数据为：IR(CH₂Cl₂,cm^-1):V(co)＝2024vs,1973m,1940vs,V(co-ester)＝1735m,V(co-acid)＝1581m,1448m；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.67(d,4H,NC₅H₅),7.84(t,2H,NC₅H₅),7.51-7.40(m,4H,NC₅H₅),4.12(t,4H,CH₂),3.84-3.40(m,PEG),3.36(s,6H,OCH₃),2.52-2.56(dd,8H,CH₂CH₂CO₂),2.37(s,4H,CH₂)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ203.97(CO),184.74(COOCH₂),172.60(COO),151.78(NC₅H5),137.40(NC₅H5),124.90(NC₅H₅),71.90(PEG),70.53(PEG),69.02(PEG),63.45(PEG),58.99(OCH₃),31.57(CH₂),30.51(CH₂)。

实施例3

制备分子式如下的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物：

[Ru₂(CO)₄(μ²-η²-O₂CCH₂CH₂CO₂-mPEG₂₀₀₀)₂(η¹-PPh₃)₂]

在实施例1中，所用的二甲基亚砜用等摩尔三苯基膦替换，其它步骤与实施例1相同，得到亮黄色粉末状固体285mg，即聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，其产率为61％。

所得产物的结构表征数据为：IR(CH₂Cl₂,cm^-1):V(co)＝2024vs,1979m,1956vs,V(co-ester)＝1734m,V(co-acid)＝1577m,1456m；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.48(dd,12H,Ph),7.37(d,18H,Ph),4.08-4.03(m,4H,CH₂),3.82-3.42(m,PEG),3.35(s,6H,OCH₃),2.22(t,8H,CH₂CH₂CO₂),2.02(t,4H,CH₂)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ205.23(CO),186.39(COOCH₂),172.59(COO),133.74(Ph),133.12(Ph),129.74(Ph),128.23(Ph),71.92(PEG),70.55(PEG),69.05(PEG),63.30(PEG),59.01(OCH₃),31.71(CH₂),29.84(CH₂)。

实施例4

制备分子式如下的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物：

[Ru₂(CO)₄(μ²-η²-O₂CCH₂CH₂CO₂-mPEG₅₀₀₀)₂(η¹-SO(CH₃)₂)₂]

在实施例1中，所用的mPEG₂₀₀₀-OOCCH₂CH₂-COOH用等摩尔mPEG₅₀₀₀-OOCCH₂CH₂-COOH替换，其它步骤与实施例1相同，得到淡黄色粉末状固体456mg，即聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，其产率为69％。

所得产物的结构表征数据为：IR(CH₂Cl₂,cm^-1):V(co)＝2047vs,2002m,1973vs,V(co-ester)＝1736m,V(co-acid)＝1606m,1403m；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(s,8H,CH₂),4.16(t,4H,CH₂),3.80-3.39(m,PEG),3.36(s,6H,OCH₃),2.60(s,8H,CH₂CH₂CO₂),2.11(s,6H,CH₃)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ201.21(CO),186.75(COOCH₂),172.33(COO),71.99(PEG),70.57(PEG),69.02(PEG),63.75(PEG),58.99(OCH₃),42.03(CH₃),31.61(CH₂),29.96(CH₂)。

实施例5

制备分子式如下的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物：

[Ru₂(CO)₄(μ²-η²-O₂CCH₂CH₂CO₂-mPEG₅₀₀₀)₂(η¹-NC₅H₅)₂]

在实施例4中，所用的二甲基亚砜用等摩尔吡啶替换，其它步骤与实施例1相同，得到亮黄色粉末状固体481mg，即聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，其产率为72％。

所得产物的结构表征数据为：IR(CH₂Cl₂,cm^-1):V(co)＝2024vs,1792m,1940vs,V(co-ester)＝1735m,V(co-acid)＝1601m,1451m；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.64(d,4H,NC₅H₅),7.81(t,2H,NC₅H₅),7.46-7.37(m,4H,NC₅H₅),4.08(d,4H,CH₂),3.93-3.38(m,PEG),3.33(s,6H,OCH₃),2.49(d,8H,CH₂CH₂CO₂)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ205.49(CO),186.30(COOCH₂),174.22(COO),153.18(NC₅H₅),138.81(NC₅H₅),126.31(NC₅H₅),73.29(PEG),71.91(PEG),70.42(PEG),64.85(PEG),60.37(OCH₃),32.97(CH₂),31.92(CH₂)。

实施例6

制备分子式如下的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物：

[Ru₂(CO)₄(μ²-η²-O₂CCH₂CH₂CO₂-mPEG₅₀₀₀)₂(η¹-PPh₃)₂]

在实施例4中，所用的二甲基亚砜用等摩尔吡啶替换，其它步骤与实施例1相同，得到亮黄色粉末状固体486mg，即聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，其产率为71％。

所得产物的结构表征数据为：IR(CH₂Cl₂,cm^-1):V(co)＝2024vs,1979m,1951vs,V(co-ester)＝1735m,V(co-acid)＝1577m,1470m；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.48(s,12H,Ph),7.37(s,18H,Ph),4.05(s,4H,CH₂),3.90-3.41(m,PEG),3.35(s,6H,OCH₃),2.21(s,8H,CH₂CH₂CO₂),2.02(d,4H,CH₂)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ206.63(CO),187.98(COOCH₂),173.97(COO),135.14(Ph),134.53(Ph),131.14(Ph),129.63(Ph),73.33(PEG),71.96(PEG),70.45(PEG),64.70(PEG),60.40(OCH₃),33.11(CH₂),31.24(CH₂)。

为了证明本发明的有益效果，发明人对实施例1～6制备的聚乙二醇羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物(以下简称待测物)进行了各种性能测试，具体测试情况如下：

1、水溶性测试

采用油水分配系数测定法测试待测物的水溶性，结果见图1和表1。

表1水溶性测试结果

由表1和图1可见，本发明聚乙二醇化羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物的水溶性均较好。

2、细胞毒性试验

以小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)和人结直肠癌细胞(HT29)为例，采用实施例1制备的聚乙二醇化羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物进行试验，具体试验如下：

(1)细胞处理

取冻存的RAW264.7细胞系，在37℃快速解冻后，1000转/分钟离心5分钟，用培养基清洗1～2次(因为在冷冻的过程中加入了对细胞繁殖生长有害的物质)，用培养基重悬后再离心，所得RAW264.7细胞加入完全培养基进行培养，每天换一次培养基，观察细胞生长状况，长满后备用。

(2)细胞活力测试

待RAW264.7细胞长满后调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL，在37℃、5％CO₂培养箱内培养24小时。然后在96孔板中按实验分组加入不同浓度的(0、50、100、200、300、400、500μmol/L)聚乙二醇化羧酸酯桥跨锯马羰基钌化合物，每孔150μL，每组三个复孔，培养2小时。随后，将培养的不同浓度的细胞分别用365nm紫外灯光照20分钟和不光照，并放置暗处8小时后进行MTT检测：每孔加入15μL四唑盐(MTT)，在37℃、5％CO₂培养箱内培养避光孵育4小时，吸净孔内的液体，加入200μL DMSO，室温于摇床震荡10分钟，用酶标仪在492nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞增殖影响的分析，测试结果见图2和图3。

由MTT结果可知：RAW264.7细胞光照条件下的IC₅₀值为572.8μmol/L，RAW264.7细胞不光照条件下的IC₅₀值为539.9μmol/L；HT-29细胞不光照条件下的IC₅₀为526.9μmol/L，而光源诱导后，细胞IC₅₀为637.6μmol/L。

由图2的实验结果可见，365nm光源照射后，细胞的存活率随浓度的增加由76.7％减小到12.7％。与避光条件下的细胞凋亡趋势相类似。说明细胞毒性随浓度的增加而减小。

由图3的实验结果可见，当加入的释放分子浓度逐渐增大时，细胞存活率逐渐减小，而当加入的释放分子浓度从250μmol/L增大到500μmol/L时其细胞的存活率减小31.9％，当达到1000μmol/L时，细胞的存活率为29.7％。说明细胞毒性随浓度的增加而减小。