圆苞车前子壳膳食纤维在制备肠道损伤防护制剂中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及圆苞车前子壳膳食纤维在肠道损伤防护中的新用途，包括圆苞车前子壳膳食纤维在制备预防肠道损伤药物或功能性食品中的应用。

技术背景

圆苞车前子壳膳食纤维提取自车前科车前属圆苞车前种子外壳，圆苞车前子外壳纤维含量丰富，其含量约占80％，此外，圆苞车前子外壳中还含有胶质、葡萄糖甙、蛋白质、多糖、维生素B1和胆碱等营养成分。膳食纤维具有吸水作用、粘滞作用、结合有机化合物、阳离子交换及细菌发酵作用，已经做为维持肠道健康、防治便秘的营养补充剂广泛应用。

文献报道圆苞车前子壳膳食纤维具有如下功效：1.帮助维持肠道菌群平衡；促进肠蠕动，提供有益菌所需养分，减少有害菌的数量；2.调节养分吸收；减少糖类吸收，调整血糖值、减少饥饿感，强化对糖尿病病情的控制；减少中性脂肪的吸收，降低心血管疾病发生率；3.具吸水、保水及膨润效果；增加排便量，使肠管内压正常、减少憩室病等的发生；4.促进唾液分泌：促进食物消化吸收。专利KR101487769报道利用圆苞车前子壳、米曲霉及芦荟提取物制成一种促进新陈代谢、增加肠道蠕动、防治便秘的食品，主要利用圆苞车前子壳改善粪便与肠道的润滑程度，防治便秘；专利KR20140028749也发明了一种主成份是圆苞车前子壳和藜草的保健食品，主要作用为减肥和改善便秘。此外专利CN105796662A发明了一种圆苞车前子壳粉和菊粉的组合物，具有润肠通便、改善人体肠道菌群分布、调节肠道健康，平衡矿物质吸收的作用。综上所述，圆苞车前子壳膳食纤维对肠道健康具有积极的促进作用。

肠道损伤是由包括在抗生素疗法、放射疗法、化疗、外科手术、肠道感染、炎性肠病、结肠炎、肠梗阻和慢性应激所引起的病理性损伤，临床主要表现为肠黏膜和血管结缔组织损伤，其中小肠、结肠及直肠均可受到不同程度的损伤。目前临床用治疗肠道损伤的药物虽然部分药物具有一定的药理活性，但是存在一些不可避免的缺点，包括作用浓度高、毒副作用强等。因此开发新型肠道损伤防护药物是医药领域开发的热点。

技术实现要素：

本发明提供了一种毒副作用小、疗效显著的圆苞车前子壳膳食纤维在制备肠道损伤防护药物或功能性食品中的应用，可有效缓解临床治疗肠道损伤药物不足的现状。

本发明解决的技术方案是，圆苞车前子壳膳食纤维在制备肠道损伤防护制剂中的应用，圆苞车前子壳膳食纤维提取自圆苞车前子壳，以圆苞车前种子外壳为原料，经碾磨后制得。

所述制剂为药物或功能性食品，制剂类型为：片剂、糖衣片剂、薄膜衣、片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、混悬剂或粉剂。

所述制剂包含药学上可接受的载体，药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂和吸附载体中的一种或几种。

所述肠道损伤包括在抗生素疗法、放射疗法、化疗、外科手术、肠道感染、炎性肠病、结肠炎、肠梗阻和慢性应激中引起的肠道损伤。

圆苞车前子壳膳食纤维服用剂量为100mg/kg，且经由口服给药。

对圆苞车前子壳膳食纤维的肠道防护作用进行动物实验验证，首先通过辐射照射诱导小鼠肠道损伤模型，比较预先饲喂圆苞车前子壳膳食纤维的小鼠肠道损伤程度及生存率，并通过比较实验组小鼠肠道上皮细胞形态、肠道通透性、炎症因子表达水平及细胞凋亡情况，系统评价圆苞车前子壳膳食纤维对肠道的防护作用。证明了圆苞车前子壳膳食纤维具有增加肠道损伤小鼠的生存率，维持肠道组织完整性，减少肠道细胞内炎症因子的表达，降低肠道细胞凋亡的发生率。说明圆苞车前子壳膳食纤维具有肠道损伤防护的作用。

本发明开辟了圆苞车前子壳膳食纤维在肠道损伤防护药物中的新用途，其具有安全有效，无不良反应等优势，能够有效用于肠道损伤防护药物或功能性食品的制备，具有广泛应用前景。

附图说明

图1是不同处理组小鼠存活天数统计结果；

图2是不同处理组小鼠体重变化情况；

图3是不同处理组小鼠腹泻情况统计结果；

图4是不同处理组小鼠小肠组织HE染色结果；

图5是不同处理组小鼠血清荧光强度检测结果；

图6是不同处理组小鼠血清中内毒素含量检测结果；

图7是不同处理组小鼠肠道菌群向肠系膜淋巴结及肝脏易位分析；

图8是不同处理组小鼠小肠上皮细胞中IFN-γ、iNOS及TNF-α分子的免疫组化结果；

图9是不同处理组小鼠小肠上皮细胞中IFN-γ、iNOS及TNF-α分子的Western-Blot分析；

图10是不同处理组小鼠小肠上皮细胞Tunnel染色结果；

图11是不同处理组小鼠小肠上皮细胞凋亡数目统计结果。

具体实施方式

本发明通过下列实施例予以进一步阐明，这些实施例是仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。

实施例1.圆苞车前子壳膳食纤维对辐射诱导的肠道损伤小鼠生存率及体重的影响

选用6-8周龄C57BL/6小鼠，雌雄各半(体重25±2g)，随机分为四组：

空白组：正常饲养，未经任何处理的小鼠10只；

肠道损伤阴性对照组：正常饲养1周后采用X射线照射机对小鼠腹腔进行照射(15Gy)10只；

实验组：正常饲养时向饲料中添加圆苞车前子壳膳食纤维，1周后进行采用X射线照射机对小鼠腹腔进行照射(15Gy)10只；

圆苞车前子壳膳食纤维空白对照组：正常饲养时向饲料中添加圆苞车前子壳膳食纤维的小鼠10只。

其中实验组及空白对照组饲喂圆苞车前子壳膳食纤维剂量为100mg/kg，每天1次。

考察四组小鼠的生存率。小鼠存活天数统计结果如图1所示，结果显示饲喂圆苞车前子壳膳食纤维对正常小鼠的生存率无影响，且圆苞车前子壳膳食纤维可有效延长辐射照射后小鼠的存活时间。同时发现肠道损伤阳性对照组小鼠在照射后1天即出现活动度显著下降，饮食量显著降低，而辐射照射前给予圆苞车前子壳膳食纤维的小鼠活动度显著优于对照组，小鼠体重变化情况见图2。说明圆苞车前子壳膳食纤维能够显著延长肠道损伤小鼠的生存率并有效改善肠道损伤小鼠的生存状态。

实施例2.圆苞车前子壳膳食纤维对辐射诱导的肠道损伤小鼠的肠道结构及功能的影响

辐射照射小鼠后发生肠道损伤，会导致小鼠发生腹泻，根据小鼠粪便形态将腹泻等级划分为四级：0(健康),1(轻度),2(中度),3(重度)。空白组，肠道损伤阴性对照组及实验组小鼠处理方式同实施例1，观察统计辐射处理后一周内小鼠腹泻情况，结果见图3。结果显示，预先饲喂圆苞车前子壳膳食纤维的小鼠经辐射照射后腹泻发生率及腹泻程度明显低于对照组。说明圆苞车前子壳膳食纤维能减轻辐射诱导的肠道功能紊乱。

为进一步观察小鼠肠道结构变化，取处死后小鼠的小肠组织，分别经固定、蜡块包埋，切片及HE染色，结果如图4所示，结果显示辐射处理会明显导致小鼠小肠绒毛断裂、脱落，小肠绒毛高度明显下降；而预先饲喂圆苞车前子壳膳食纤维的小鼠肠道结构与空白组类似，组织完整性明显优于对照组，且小肠绒毛高度明显高于对照组，同样说明了圆苞车前子壳膳食纤维对肠道组织的完整性具有保护作用。

为观察辐射处理后小鼠肠道通透性的影响，在辐射照射处理3.5天后处死小鼠，于处死前4h腹腔注射荧光染料FITC-Dextran(剂量：10mg/kg)，处死后立即取小鼠血清检测荧光强度。结果见图5，其中血清中的荧光强度与肠道完整性呈负相关，结果显示，预先饲喂圆苞车前子壳膳食纤维的小鼠经辐射照射后血清中的荧光强度显著低于对照组。通过鲎试验法测定血清中内毒素含量，结果见图6，结果显示实验组小鼠血清中内毒素含量显著低于对照组。以上结果说明圆苞车前子壳膳食纤维能够改善辐射诱导的肠道通透性下降，有助于维持肠道组织的完整性。

实施例3.圆苞车前子壳膳食纤维对辐射诱导的肠道损伤小鼠肠道菌群易位的影响

空白组，肠道损伤阴性对照组及实验组小鼠处理方式同实施例1，并于辐射照射处理3.5天后处死小鼠，取小鼠肠系膜淋巴结及肝脏分别进行细菌含量分析。具体方法为：首先利用荧光定量PCR法对已知数量的大肠杆菌进行16SrDNA的扩增，绘制基因循环阈值与细菌含量关系的标准曲线，再根据待测样品中的16SrDNA基因循环阈值计算相应的细菌含量。结果见图7，结果显示与正常小鼠相比，对照组小鼠经辐射照射后肠系膜淋巴结中的细菌含量显著升高，说明小鼠肠道菌群发生了明显的易位，而实验组预先饲喂圆苞车前子壳膳食纤维的小鼠肠道菌群易位情况得到了显著改善。此外，三组小鼠均为未发现肠道菌群易位到肝脏组织。说明圆苞车前子壳膳食纤维能有效缓解小鼠肠道损伤引发的菌群易位。

实施例4.圆苞车前子壳膳食纤维对辐射诱导的肠道损伤小鼠肠道中炎症细胞因子表达的影响

炎症是机体应对组织损伤的一种防御反应，表现在炎症相关细胞因子的表达增加并伴随组织器官的损伤。为探究圆苞车前子壳膳食纤维对辐射诱导的肠道损伤小鼠肠道中炎症关键细胞因子表达的影响，采用免疫组化及Western-Blot方法对小肠组织中IFN-γ(γ干扰素)、iNOS(诱导型一氧化氮合成酶)及TNF-α(肿瘤坏死因子α)的表达量进行分析。空白组，肠道损伤阴性对照组及实验组小鼠处理方式同实施例1，于辐射照射3.5天后处死小鼠，分别取小肠组织进行固定、蜡块包埋，切片及IFN-γ、iNOS及TNF-α分子的免疫染色，免疫组化结果见图8。采用Western-Blot方法以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参蛋白，对小肠组织中的IFN-γ、iNOS及TNF-α蛋白表达量进行分析，结果见图9。免疫组化及Western-Blot结果均表明辐射诱导的肠道损伤小鼠肠道中炎症因子IFN-γ、iNOS及TNF-α的表达量显著增加，与对照组相比预先饲喂圆苞车前子壳膳食纤维的小鼠肠道上皮细胞保持了较好的完整性，且炎症因子的表达量得到显著控制，其表达水平与空白组相当，说明圆苞车前子壳膳食纤维能显著改善小鼠肠道损伤引发的炎症反应。

实施例5.圆苞车前子壳膳食纤维对辐射诱导的小肠细胞凋亡的影响

为探究圆苞车前子壳膳食纤维对损伤肠道的细胞凋亡的影响，空白组，肠道损伤阴性对照组及实验组小鼠处理方式同实施例1，于辐射照射3.5天后处死小鼠，取小肠组织进行固定、蜡块包埋，切片及细胞Tunnel染色，结果见图10。其中正常细胞核染色后呈现蓝色，细胞发生凋亡后细胞核基因出现断裂，断裂基因被Tunnel试剂特异性染色，呈现红色，对发生凋亡的细胞个数进行统计，结果见图11。结果表明与空白组相比，对照组小鼠经辐射照射后肠道细胞凋亡数目显著增加，实验组由于预先饲喂了圆苞车前子壳膳食纤维，小鼠肠道细胞凋亡数目显著低于对照组，说明圆苞车前子壳膳食纤维能够减少辐射诱导的肠道细胞凋亡。