一种加强型人乳头瘤病毒HPV‑16/18的二价DC疫苗的制作方法

本发明涉及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗。

背景技术：

人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒a属，易于感染人类表皮和粘膜鳞状上皮，是导致宫颈癌和生殖器湿疣以及部分肛门癌、口腔癌的主要因素。持续性感染高危型hpv-16，hpv-18可能引起宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等恶性肿瘤。宫颈癌是目前唯一病因明确的恶性肿瘤，99.7％的宫颈癌病例因hpv感染造成，世界卫生组织及国际癌症中心也确认高危型hpv病毒持续感染是宫颈癌的主要病因，因此，hpv疫苗又被人们习惯性成为子宫颈癌疫苗。据不完全统计，每年全世界有50万女性因感染hpv而患宫颈癌，其中20万死于该肿瘤，hpv病毒与艾滋病、癌症被世界卫生组织列为人类三大绝症。

hpv-16/18可导致70％的宫颈癌病例，还可能造成男性和女性的生殖器湿疣,性生活是其传播的主要渠道，常规的保护措施，比如说避孕套，并不能完全阻断hpv病毒的传播，所以说注射疫苗就成了预防hpv最好的方式。

hpv病毒基因组是闭合环状的双链dna分子，长约7.2-8kb，编码8个开放阅读框(openreadingframe)，分为早期转录区(earlyregion，e区)、晚期转录区(lateregion，l区)和控制区(longcontrolregion)3个功能区，早期转录区长约4.5kb，编码六个非结构性早期蛋白：e1，e2，e4-e7，参与病毒的复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能；晚期转录区长约2.5kb，编码核心衣壳蛋白l1和次要衣壳蛋白l2，组成病毒的衣壳；控制区长约800-900bp，位于e8和l1之间，该区含有hpv基因组dna的复制起点和hpv基因表达所需的调控元件，负责调控dna的复制和表达。病毒颗粒由l1、l2衣壳蛋白组成，直径约45-55nm，呈无包膜的20面体对称的核衣壳结构，表面有72个壳微粒。

dc俗称树突状细胞(dendriticcells，dcs)，因成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名，是体内功能最强、唯一能活化静息t细胞的专职抗原呈递细胞(antigenpresentingcells，apc)，能摄取、加工及呈递抗原，是启动、调控和维持t细胞介导的免疫反应的中心环节。

目前dc疫苗已应用于部分肿瘤的监视和治疗，以dc为基础的疫苗制备方式主要有以下几种：(1)抗原多肽致敏的dc，如利用纯化或重组的肿瘤特异性抗原多肽致敏dc，这种方法靶向性良好。但目前已经确定的抗原多肽有限，单一的抗原多肽只限定于特定的hla类型，且肿瘤细胞很容易通过抗原突变逃脱机体针对单一抗原标为的免疫作用。(2)全部抗原致敏的dc，使用病毒感染细胞(或肿瘤细胞)的裂解产物、蛋白提取物、凋亡产物刺激dc，这类疫苗包括了所有的病毒抗原，也易于制备，能够引发多克隆的ctl免疫应答。但是该方案需要感染组织量较大，而且最佳刺激量难以确定。此外，病毒感染细胞也含有机体自身的抗原，有诱发自身免疫反应的危险。(3)基因转染dc，即利用编码病毒抗原的rna/dna致敏dc。此方法通过pcr扩增病毒抗原的全部或者部分dna序列，而后将核酸以病毒或非病毒介导的方法导入dc内，目的抗原可在细胞内形成持久的表达。此法可客服抗原刺激dc后，因抗原-mhc复合物解离或者mhc分子降解对其诱导的免疫应答所产生的不利影响。

dc疫苗不仅能诱导产生大量效应t细胞迁移至病毒感染部位，还能保持效应t细胞在易感染部位的长期存在，起到免疫监视的作用。

技术实现要素：

本发明提供了一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗以解决上述背景技术问题的不足之处。

本发明的方案是：

一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗，包括经基因修饰的树突状细胞，所述经基因修饰的树突状细胞中的重组基因序列由粒细胞-巨噬细胞刺激因子、人乳头瘤病毒hpv-16与hpv-18的l1转录区串联。

作为优选的技术方案，所述的粒细胞-巨噬细胞刺激因子为序列表seqidno.1所示的核苷酸序列。

作为优选的技术方案，所述hpv16的l1抗原序列为序列表seqidno.2所示的核苷酸序列。

作为优选的技术方案，所述hpv18的l1抗原序列为序列表seqidno.3所示的核苷酸序列。

作为优选的技术方案，还包括将dc细胞负载人源化重组基因的方法：将所述重组基因序列插入到慢病毒表达载体plent-c-gfp中，得到plent-(gm-csf)-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp载体；同时，将脐带血单个核细胞在gmp实验室，所述脐带血单个核细胞经诱导成imdc，将包装于慢病毒的hpv16/18-l1序列感染imdc，并将imdc经成熟因子诱导成熟得到dc疫苗。

作为优选的技术方案，还包括所述脐带血单个核细胞诱导成imdc的制备方法：收集健康产妇脐带血50ml，利用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，培养基中，37℃,5％的co2条件下培养2-3小时后，倒掉悬浮死细胞，留取贴壁细胞，并加入细胞因子rhil-4，终浓度：50ng/ml，rhgm-gsf的终浓度100ng/ml，诱导单个核细胞分化成dc，每隔48小时更换新培养基，培养第5天得到imdc。

作为优选的技术方案，所述imdc经成熟因子诱导得到成熟的dc疫苗，所述imdc第6天加入成熟因子tnf-α，诱导得到成熟的dc细胞。

一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗用于制备预防疾病的二价dc疫苗的用途。

作为优选的技术方案，所述预防疾病为宫颈癌，但并不局限于宫颈癌，好包括预防直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等高危型hpv感染引起的其它恶性肿瘤。

由于采用了上述技术方案，一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗，包括经基因修饰的树突状细胞，所述经基因修饰的树突状细胞中的重组基因序列由粒细胞-巨噬细胞刺激因子、人乳头瘤病毒hpv-16与hpv-18的l1转录区串联；本发明用hpv-16、hpv-18的l1区抗原负载于成熟的dc细胞，并以粒细胞-巨噬细胞刺激因子作为导引子增强l1序列的表达；该dc细胞可将抗原与mhc分子结合，形成l1多肽—mhc分子复合物，并递呈给t细胞，从而启动mhc-i类特异性ctl反应和mhc-ii类特异性cd4+thl反应，对hpv16和hpv18进行精确性、特异性、靶向性、主动性地击杀。同时，dc还通过其高表达的共刺激分子(cd80/b7-1、cd86/b7-2、cd40等)提供t细胞活化所必须的第二信号，从而彻底打破hpv感染者的免疫耐受状态，使患者的免疫系统像正常人感染细胞病毒一样，产生针对hpv的特异性抗体，来对抗、攻击并最终清除hpv；由于减掉了dc细胞对抗原的摄取、加工过程，该dc疫苗提高了t淋巴细胞对hpv感染细胞的吞噬效率，并能对hpv的再次入侵提供保护性的长期免疫记忆功能。

附图说明：

图1是本发明所述hpv16/18重组基因模块示意图；

图2是本发明所述的慢病毒表达载体plent-(gm-csf)-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp的示意图，其中，顺时针序列为正向基因片段，逆时针序列为逆向基因片段；

图3是本发明所述的脐带血诱导的imdc体式显微镜下视野图；

图4是本发明成熟dc细胞体式显微镜下视野图；

图5是本发明脐带血诱导的imdc表面分子标记cd83+表达的量流式图；

图6是本发明成熟dc细胞表面分子标记cd83+表达的量流式图；

图7是本发明脐带血诱导的imdc表面分子标记cd86+表达量的流式图；

图8是本发明成熟dc细胞表面分子标记cd86+表达量的流式图；

图9是本发明通过qpcr测得的plent-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp和plent-(gm-csf)-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp分别作为慢病毒表达载体使得dc细胞表面hpv16-l1和hpv18-l1的相对表达量，其中，*代表具有数据具有显著差异，**代表数据具有极显著差异。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例一：imdc的诱导

(1)收集健康产妇脐带血50ml，利用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，培养基(购自takara公司，gt-t551)中，37℃,5％的co2条件下培养2-3小时后，倒掉悬浮死细胞，留取贴壁细胞，并加入细胞因子rhil-4(终浓度：50ng/ml)，rhgm-gsf(终浓度100ng/ml)，诱导单个核细胞分化成dc，每隔48小时更换新培养基，培养第5天得到imdc，通过倒置显微镜观察dc成熟前细胞形态，流式细胞术检测细胞表面分子标记cd83+和cd86+的表达，综合鉴定诱导的imdc。

实施例二：hpv-16，hpv-18的l1序列修饰成熟dc细胞

(1)慢病毒的包装制备：应用基因克隆技术，pcr扩增hpv-16，hpv-18的l1基因全长cdna序列，连接入慢病毒表达载体plent-c-gfp中，构建l1抗原的慢病毒表达载体，通过pcr和核酸测序鉴定。进行病毒滴度测定。

(2)将构建的l1慢病毒载体感染imdc，将感染的imdc培养6h后加入成熟因子tnf-α，诱导得到成熟的dc细胞，通过倒置显微镜观察dc成熟后细胞形态，流式细胞术检测细胞表面分子标记cd83+和cd86+的表达，综合鉴定诱导的mdc。该mdc可直接注射作为预防hpv16和hpv18的疫苗。

为验证有无gm-csf对dc细胞表面hpv16-l1和hpv18-l1表达，qpcr测定plent-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp和plent-(gm-csf)-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp分别作为慢病毒表达载体对dc细胞内hpv16/18的mrna相对表达的影响。hpv16-l1的qpcr引物为：hpv16-fw：5’-gaattcatttgccagatcca-3’，hpv16-rv：5’-ataccaacacccaatggttg-3’；hpv18-l1的qpcr引物为：hpv18-fw：5’-gggtgcagttacctgaccca3’,hpv18-rv:5’-aggccaacacctaaaggctg-3’。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

序列表

gm-csf信号肽核酸人工序列

seqidno.1

<110>山东兴瑞生物科技有限公司

<120>一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗

<130>2016

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>2

<211>75

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgctgctgctggtgaccagcctgctgtgcgagctggagccccaccccgcctttctgctg60

atccccgacatccag75

hpv-16-l1的核苷酸序列

seqidno.2

<110>山东兴瑞生物科技有限公司

<120>一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗

<130>2016

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1416

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgtcattatggcttccttcagaggctaccgtatacttacctcctgttccagttagtaaa60

gtcgtttctacagatgaatacgttgctagaactaatatttattatcatgctggtacttct120

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caatttccattgggtagaaaatttttgttgcaagcttag1419

hpv-18-l1的核酸序列

seqidno.3

<110>山东兴瑞生物科技有限公司

<120>一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗

<130>2016

<160>1

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<211>1416

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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