穿心莲内酯在制备提高博来霉素抗肿瘤效果的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医用配品，具体涉及穿心莲内酯新的药物用途。

背景技术：

穿心莲内酯(andrographolide，以下简称andro)，天然植物穿心莲的主要有效成份，具有祛热解毒，消炎止痛之功效，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊疗效，被誉为天然抗生素药物。体外实验证明：穿心莲对培养的乳腺癌细胞dna合成有抑制作用。目前，尚没有实验证明穿心莲内酯单独用药对肿瘤有抑制作用。也尚没有穿心莲内酯可增强博来霉素抗肿瘤疗效以及降低其毒副作用的相关文献报道。

化疗是目前最常用的治疗肿瘤的方式，博来霉素(bleomycin，以下简称blm)是一种比较常见的临床化疗药物。blm，一种来自于轮枝链霉菌的糖肽抗生素，广谱抗肿瘤药物，能有效对抗各种癌症如淋巴瘤，睾丸肿瘤，食管癌和鳞状细胞癌，淋巴瘤，睾丸肿瘤和恶性胸腔积液等。blm作为临床抗肿瘤药物最大的优势是，其在抗肿瘤的同时没有明显的骨髓抑制作用，同时对机体的免疫功能也没有抑制作用。然而，同大多数化疗药物一样，blm也有不容忽视的副作用：长期使用blm会导致肺炎样症状及肺纤维化症状，因而长期使用博来霉素治疗肿瘤也是非常危险的。目前大多数的化疗药物都有不同程度的骨髓抑制及免疫抑制副作用，所以作为没有这两项缺点的化疗药物blm在临床应用上还是很有前景的。但现在还没有能降低博来霉素肺纤维化这一毒副作用的技术手段和有效药物。因此寻找一种能降低blm肺纤维化副作用的药物是很急迫的。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供穿心莲内酯的新用途，即穿心莲内酯在制药中的新用途。

具体地说，上述穿心莲内酯在制药中的新用途是，穿心莲内酯在制备提高博来霉素抗肿瘤效果的药物中的应用。

上述应用中，所述药物中穿心莲内酯的重量百分比含量为76.92％-86.96％。

上述应用中，所述的药物为注射剂或常见的口服剂。

本发明所述的药物组合物可根据本领域已知的方法制备,即将有效成分与医学上可接受的辅料混合制成常规的药物制剂，如片剂、胶囊、注射液、粉针剂或滴丸。

本发明的有益效果是，我们通过采用h22细胞(2×10⁶cells/只)对昆明小鼠造腹水瘤模型，采用灌胃给予不同浓度andro溶液、腹腔注射blm溶液(15mg/kg)以及联合给药来治疗h22腹水瘤小鼠，从而评价andro是否能够提高blm肿瘤效果。实验一通过andro、blm以及两者联合应用对小鼠腹水体积的影响以及检测腹水中腹水瘤细胞的凋亡率来证明andro是否能够增强blm的抗肿瘤作用；实验二通过对andro、blm以及两者联合处理过的腹水瘤小鼠的肺组织做组织病理学检查以检测肺纤维化程度，来证明andro是否具有肺保护作用，即能够减轻blm诱导的肺纤维化。通过两个实验来观察andro能否增强blm治疗肿瘤的作用以及减轻blm引起肺纤维化的副作用。

结果表明andro和blm联合用药有效地改观了腹水瘤小鼠的精神状态，减少了腹水瘤小鼠的腹围直径、腹水量，提高了小鼠腹水瘤细胞的凋亡率，显著地增强了博来霉素的抗肿瘤效果。同时通过对组织切片的观察显示，andro和blm联合用药能有效改善blm对肺部组织造成的肺炎样症状及肺纤维化症状，对肺组织有保护作用。预示着andro可以提高blm的抗肿瘤效果，显示了其在制备提高blm抗肿瘤效果药物中的良好前景。

以下具体实验说明了andro与blm联合应用过程中andro的增强blm的抗肿瘤作用，表明了本发明的有益效果。其中andro为本实验教研室自主制成的粉剂。

一.andro增强blm的抗肿瘤作用实验。

1.1实验材料

雄性昆明(km)小鼠(18-22g)购自于广东省医学实验动物中心(证书号scxk2013-0085)98％的穿心莲内酯购自于美国的sigma-aldrich公司，博来霉素购自于日本化药有限公司，h22细胞，获自americantypeculturecollection(rockville，md，usa)，胎牛血清(fbs)和rpmi1640培养基购自gibco(grandisland，ny，us)，磷酸盐缓冲盐水(pbs)，青霉素和链霉素由hyclone(logan，utah，us)提供。

1.2实验分组

取spf级18～22g的雄性km小鼠10只做正常组，腹腔注射生理盐水，剩下的84只雄性km小鼠采用h22细胞(2×10⁶cells/只)给小鼠腹腔注射法造腹水瘤模型。5天后挑选80只造模成功的腹水瘤小鼠随机分为模型对照组、blm组、andro低剂量组(andro-l)、andro中剂量组(andro-m)、andro高剂量组(andro-h)、andro-l+blm组、andro-m+blm组、andro-h+blm组。

1.3实验方法

分组后开始给药，blm组腹腔注射blm溶液(15mg/kg，用生理盐水配制)，andro-l、andro-m、andro-h组分别灌胃andro溶液(用cmc-na配制，浓度依次为25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)，andro-l+blm、andro-m+blm、andro-h+blm组分别腹腔注射blm溶液(15mg/kg)联合灌胃andro溶液(浓度依次为25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)，正常组和模型对照组灌胃给药cmc-na，每天一次，连续给药7天，最后一次给药24小时后处死，收集腹水和肺组织。

1.4检测指标和检测方法

1.4.1观察各组小鼠的一般状态

在实验过程中，每天观察各组小鼠饮食、毛发、精神状态和体型的变化等。

1.4.2观察各组小鼠体质量和腹围变化以及死亡情况。

自接种之日起，每日定时监测9组小鼠体重、腹围和死亡状况并记录，结果进行统计学处理，绘制表格。

1.4.3流式细胞仪检测小鼠腹水中的腹水瘤细胞的凋亡率

处死小鼠，收集好腹水，在4℃，3000rpm的条件下离心3分钟，然后用pbs洗涤2次，使用0.2％台盼蓝分析细胞活力染色并由countstar自动细胞计数器检测，收获细胞。所有组的细胞离心并用冰冷的pbs洗涤两次，然后重悬于结合缓冲液中。最后，将细胞进行膜联蛋白v-fitc-碘化丙啶(pi)双染色并通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。

1.5统计分析

所有数据采用spss17.0forwindows统计分析软件进行统计学处理，各组间差异比较用方差分析，以p<0.05为差异有显著性。

1.6实验结果

1.6.1各组小鼠生活状态

接种5天后空白对照组和穿心莲内酯单独用药的低中高组小鼠体重均迅速增加，随后逐渐出现精神萎靡不振、呆滞少动、步态不稳，反应性差，进水进食减少，晚期腹部膨隆，呈恶液质状态。穿心莲内酯与博来霉素联合组除了低剂量组体重增加较快，精神萎靡之外其余两组体重增加较慢，精神较好。

1.6.2各组小鼠的体重、腹围和腹水体积情况

与模型组相比，blm组，andro-l+blm组、andro-m+blm组和andro-h+blm组的体重和腹围均有显著性差异(p<0.01),andro-l组、andro-m组和andro-h组的体重和腹围均没有显著性差异(p>0.05)。与blm组相比，andro-l+blm组(p<0.05)、andro-m+blm组和andro-h+blm组(p<0.01)的腹围均有显著性差异。详见下表1、表2：

表1：实验小鼠体重(g)变化表

a：p＜0.05，aa：p＜0.01，与空白组比较；b：p＜0.05，bb：p＜0.01，与模型组比较；c：p＜0.05，与blm组比较

表2：实验小鼠腹围直径(mm)表

a：p＜0.05，aa：p＜0.01，与空白对照组比较；b：p＜0.05，bb：p＜0.01，与模型组比较；c：p＜0.05，cc：p＜0.01，与blm组比较

与模型组相比，blm组(p＜0.05)，andro-l+blm组、andro-m+blm组和andro-h+blm组(p＜0.01)的腹围均有显著性差异。与blm组相比andro-m+blm组和andro-h+blm组的腹围均有显著性差异(p＜0.05)。详见图1。

结果表明，blm和andro联合用药能显著降低腹水瘤小鼠的体重、腹围和腹水体积。

1.6.3各组小鼠的腹水瘤细胞的凋亡率

与模型组相比，blm组和blm+andro组腹水瘤细胞凋亡率明显上升(p<0.01)并且小鼠腹水瘤细胞的凋亡率会随着andro剂量的增加而提高；与blm组相比，andro-h+blm组的腹水瘤细胞凋亡率有了明显的提高(p<0.05)。结果显示，blm和andro联合用药能显著提高小鼠腹水瘤细胞的凋亡率。详见图2。

二.穿心莲内酯减轻blm诱导的肺炎样症状及肺纤维化实验

2.1实验分组

同andro增强blm的抗肿瘤作用实验中的1.2。

2.2实验方法

所用的肺组织来源于andro增强blm的抗肿瘤作用实验中的1.3收集保存的肺组织。将小鼠的肺组织标本快速用生理盐水洗净，用10％的福尔马林固定肺组织，肺组织用常规组织技术加工并用石蜡进行包埋。将用石蜡包埋的样品切成5mm厚的切片，放在载玻片上，用苏木精和伊红进行染色，进行病理学观察；用masson三色染色法对胶原沉积进行染色，通过特征蓝色进行识别。根据以下标准评价肺损伤：肺泡充血程度、肺泡壁的厚度以及肺泡的增大程度，实质中结缔组织的增生程度，胶原沉积和炎症。组织病理学损伤以0-4的标度评分(0代表正常，没有损伤，1为25％，轻度损伤，2为25-50％，中度损伤，3为50-75％，重度损伤，4为75-100％，极度损伤)。根据4个标准的得分的综合对肺损伤进行综合评价。根据肺损伤的程度判断andro是否能减轻blm诱导的肺炎样症状及肺纤维化。

2.3统计分析

所有数据采用spss17.0forwindows统计分析软件进行统计学处理，各组间差异比较用方差分析，以p<0.05为差异有显著性。

2.4实验结果

结果显示正常组(图3a1，b1)和模型组(图3a2，b2)的肺部组织切片无明显病理变化，能观察到正常的支气管和肺泡以及少量的胶原沉积；blm组(图3a3，b3)的肺部组织切片病理变化明显，肺泡壁变厚，肺泡和血管充血，血管外周细胞和支气管细胞出现炎症浸润，肺纤维化和胶原沉积，肺损伤严重程度高；andro-l+blm组(图3a4，b4)、andro-m+blm组(图3a5，b5)和andro-h+blm组(图3a6，b6)的病理状况较blm组逐步减弱，肺损伤严重程度依次下降。图3的柱状图显示:和正常组相比，blm组的肺损伤严重程度最高(p<0.01)；和blm组相比，andro-l+blm组、andro-m+blm组和andro-h+blm组的肺损伤严重程度均有明显降低(p<0.01)，并且肺损伤严重程度随andro的剂量的增加而减弱。证明了andro能减轻blm诱导的肺炎样症状及肺纤维化。

附图说明

图1为blm以及blm和andro联合用药组的小鼠腹水体积柱状图。

图2为blm以及andro和blm联合用药对小鼠腹水瘤细胞凋亡率的影响的效果图，其中，a图为流式细胞仪结果图，b图为肿瘤细胞凋亡率柱状图。

图3为blm以及andro和blm联合用药对小鼠肺组织的影响的效果图，其中，上部为肺组织免疫组化显微照片，下部为肺损伤等级柱状图。

具体实施方式

按照医药工业中已知的方法，将andro作为blm的联合增效减毒作用的药物，与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂相混合，制成不同剂型的药物组合物。包括口服药剂或注射药剂，所述口服药剂可以为滴丸、软胶囊等；所述注射药剂可以为注射用乳剂，注射乳剂可为静脉注射用乳剂、肌肉注射用乳剂或皮下注射用乳剂。

以下实施例并不表示本发明只限于该实施例。

实施例1(自乳化软胶囊)

穿心莲内酯5g,加入500ml的油相(油酸乙酯5ml)、乳化剂(吐温-8027ml)和助乳化剂(正丁醇18ml),用超声波使其溶解,所得的溶液与明胶经自动旋转轧囊机压制成软胶囊,5mg/粒，即可口服与blm联合应用于肿瘤治疗。

实施例2(滴丸)

穿心莲内酯150g，取等量的聚乙二酵6000、聚乙二酵4000,混合均匀，加热熔解，加入穿心莲内酯，混匀，滴制成丸，包薄膜衣，即可口服与blm联合应用于肿瘤治疗。