一种镇痛药配方及其提取方法和测试方法与流程

【技术领域】

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种镇痛药配方及其提取方法和测试方法。

背景技术：

金不换(veratrillabailloniifranch)为龙胆科、黄秦艽属，多年生草本，又名黄秦艽(《云南省药品标准》)，滇黄芩(《云南中草药》)，丽江金不换，大苦参、黄龙胆(《全国中草药汇编》)等，始载于《中华本草》；本品以根入药，味苦，性寒，有毒，具有清热，消炎，解毒，杀虫，活络止痛之功效，可用于肺热咳嗽，扁桃体炎，胃炎，痢疾，慢性胆囊炎，肾炎，乳腺炎，蛔虫病，烧伤，跌打损伤，痈疮肿毒等病症。据现代临床研究，金不换除以上痛证外还可治疗支气管炎及乌头碱中毒，解草乌和附片的中毒，是一味可治疗各种痛症的良药，在云南民间，如大理，丽江，怒江等地均使用，也是一种极具开发利用前景的民族民间药。

金不换一般生于海拔3000～4600m处的高山草地、灌丛中，或阴湿草地上，主要分布于西藏东南部、云南西北部与四川西部，印度阿萨姆及印度东北部也有部分分布。主产地为云南剑川、洱源、鹤庆和云龙等。

金不换经系统化学成分预试验证明除含有生物碱外，还有含有如皂甙、内酯、油脂、强心苷等数种成分，具有多种疗效，在我国民族医药中应用广泛。如，在苗药中，有将金不换用作清热，消炎，保肝，利胆，解毒的良药，以及用来治疗胃痛，腹痛，菌痢，黄疸性肝炎等疾病；在藏药中，用金不换以清热、消炎、解毒、杀虫；在纳西药中用以清热解毒，消炎，以及治疗痢疾，肺热所致咳嗽，慢性支气管炎与拮抗乌头碱中毒等；在苗药中，用以止痛，清热解毒；在白药中，用以治疗急、慢性胃炎，肠炎等炎症，以及治疗胃脘胁痛，肺热所致咳嗽，烧伤等；在彝药中，用以治疗人畜中毒；在傈僳族用药中，用以治疗肺热所致咳嗽，阿米巴痢疾，黄疸型肝炎，蛔虫，痈疮肿毒等。金不换的众多相关药理作用仍具有相当大的研究价值。

雪上一枝蒿(aconitumbrachypodumdie1)为毛莨科乌头属多年生草本植物，是民间习用药物之一，资源丰富，性温，味苦、辛，有大毒，具有祛风除湿，消肿止痛之功效。主要用于治疗风湿性关节炎、关节疼痛等症。但临床用药毒性较大，常因使用剂量过大或用药时间过长诱发中毒。

技术实现要素：

本发明实施例要解决的技术问题是现有技术中没有对金不换用来缓解雪上一枝蒿的功效做有力的研究和论证，并且，没有一经过客观论证的配方能够在保证雪上一枝蒿的疗效基础上，降低其毒副作用。

本发明实施例采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种镇痛药配方，包括：

从金不换提取的活性成分wvbf；

从雪上一枝蒿中提取的总生物碱cfa；

所述活性成分wvbf和总生物碱cfa按照预设的比例进行混合，得到所述镇痛药；其中，所述预设的比例包括wvbf和cfa之间的质量比重为1:2或者1:5。

优选的，所述wvbf的提取具体包括：

取金不换生药材，置于容器中，并向所述容器加入蒸馏水；

将所述容器放置在电热炉上加热至蒸馏水沸腾，加热3h后抽滤得到第一份提取液；

分别再加热2h后进行抽滤得到第二份提取液，以及再加热1h后进行抽滤得到第三份提取液；

合并所示第一份提取液、第二份提取液和第三份提取液，减压除去溶剂得干燥粉末。

优选的，在金不换生药材为500g时，所述容器具体采用3l容量的烧杯，则所述蒸馏水的剂量为2l。

优选的，所述雪上一枝蒿的总生物碱cfa提取方法包括：

取雪上一枝蒿块根粉末，置于容器中，并加入95％乙醇；

水浴加热容器至沸腾，3h后抽滤；

分别再加热2h后进行抽滤，以及再加热1h后进行抽滤；

抽滤后合并提取液，减压回收溶剂得到浸膏；

浸膏加入浓度为2％的h2so4溶液进行混悬，石油醚脱脂，氨水调整ph到9，三氯甲烷萃取至有机相澄清，合并萃取液，浓缩干燥，得到总生物碱cfa。

优选的，所述在雪上一枝蒿块根粉末500g时，所述容器具体采用圆底烧瓶，则所述取雪上一枝蒿块根粉末，置于容器中，并加入95％乙醇具体实现为：

将所述雪上一枝蒿块根粉末500g，置于3000ml圆底烧瓶中，加入2l浓度为95％乙醇；

其中，所述浓度为2％的h2so4溶液的剂量为1l。

第二方面，本发明还提供了一种镇痛药配方的提取方法，包括雪上一枝蒿的总生物碱cfa提取，方法包括：

取雪上一枝蒿块根粉末，置于容器中，并加入95％乙醇；

水浴加热容器至沸腾，3h后抽滤；

分别再加热2h后进行抽滤，以及再加热1h后进行抽滤；

抽滤后合并提取液，减压回收溶剂得到浸膏；

浸膏加入浓度为2％的h2so4溶液进行混悬，石油醚脱脂，氨水调整ph到9，三氯甲烷萃取至有机相澄清，合并萃取液，浓缩干燥，得到总生物碱。

优选的，所述在雪上一枝蒿块根粉末500g时，所述容器具体采用圆底烧瓶，则所述取雪上一枝蒿块根粉末，置于容器中，并加入95％乙醇具体实现为：

将所述雪上一枝蒿块根粉末500g，置于3000ml圆底烧瓶中，加入2l浓度为95％乙醇；

其中，所述浓度为2％的h2so4溶液的剂量为1l。

优选的，还包括金不换中活性成分wvbf提取，则所述提取方法还包括：

取金不换生药材，置于容器中，并向所述容器加入蒸馏水；

将所述容器放置在电热炉上加热至蒸馏水沸腾，3h后抽滤；

分别再加热2h后进行抽滤，以及再加热1h后进行抽滤；

合并提取液，减压除去溶剂得干燥粉末。

优选的，所述在金不换生药材为500g时，所述容器具体采用3l容量的烧杯，则所述蒸馏水的剂量为2l。

优选的，实验前按照不同比例混合后，用dmso助溶，配成10mg/ml的母液，再根据实验需要用蒸馏水稀释至所需药物浓度。

第三方面，本发明还提供了一种镇痛药配方的测试方法，所述测试方法包括cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试、cfa配伍wvbf的急性毒性测试、cfa配伍wvbf对热板法小鼠痛阈值测试和cfa配伍wvbf对冰醋酸所致扭体反应测试，具体的：

根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试，确定能够缓解心血管毒性表型和/或不诱发明显的心血管毒性表型的一组或者多组配比；

根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf的急性毒性测试，得到各组配比的ld50值；

根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf对热板法小鼠痛阈值测试，得到各自对应预设时段的镇痛率；

根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf对冰醋酸所致扭体反应测试，得到各自对应预设时段的扭体抑制率。

优选的，所述根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试，具体包括：

在饲养有斑马鱼的六孔板中分别水溶给予66.6μg/ml的cfa、及其与wvbf不同的配比：1:5、1:2、2:1和5:1浓度，设置溶剂对照组和正常对照组；

供试品处理斑马鱼4小时后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在显微镜下记录并统计斑马鱼心率，计算相对心率，并观察有无心律不齐；若发生心律不齐，则分别计数心房率和心室率；

供试品处理斑马鱼24小时后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼，同样在显微镜下观察有无心包水肿、血流异常、血栓和/或出血，并统计其发生率；

其中，所述发生率大于第一预设阈值而小于第二预设阈值，则表明能够缓解心血管毒性表型；所述发生率小于第一预设阈值，则表明不诱发明显的心血管毒性表型。

优选的，所述根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf的急性毒性测试，得到各组配比的ld50值，具体由限度实验和主实验完成，其中限度实验包括：

将2000mg/kg的受试物给予1只动物，若该动物死亡，则进行主试验；

若该动物存活，依次将受试物给予另外4只动物，动物总数为5只；其中，若1只动物在试验后期死亡，而其它动物存活，应停止对其它动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡，并且，后期死亡的动物应与其它死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价：若有3只或3只以上动物死亡时，ld50小于2000mg/kg，并进行主试验；若有3只或3只以上动物存活时，ld50大于2000mg/kg；；

其中，主实验包括：

固定级数因子为0.5，剂量组距为3.2，若尝试当前剂量的动物存活，第2只动物给予数组中高一级的剂量；若第1只动物死亡或濒死状态，第2只动物给予低一级的剂量；

每次给药1只动物，间隔至少48h，并观察动物；当满足停止实验标准之一时：①出现在最高剂量下有连续3只动物存活；②在6只动物中有5只连续发生在高一级剂量死亡、在低一级剂量生存的生死转换；③第一只动物发生转换之后至少有4只动物进入实验，并且其ld50估算值的范围超出临界值。

优选的，根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf对热板法小鼠痛阈值测试，得到各自对应预设时段的镇痛率，具体包括：

雌性昆明种小鼠，给药前筛选体重18～22g的合格小鼠，将小鼠放在预热至55℃的恒温水浴器金属底板上，保持水温恒定，其中，水温变化在±0.5℃以内；

以小鼠接触热板至舔后足反应的时间作为该小鼠的痛阈值，选定痛阈值在5～30s的小鼠进行试验，超出此范围或跳跃者弃之不用；筛选得到小鼠60只，随机分为6组，每组10只，包括空白对照组、阳性对照组、cfa组、cfa与wvbf配伍组；重复测小鼠正常痛阈值，取2次正常痛阈平均值作为该鼠给药前痛阈值；其中，给药一次后，测定小鼠给药后30、60、90分钟的痛阈值。

优选的，根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于cfa配伍wvbf对冰醋酸所致扭体反应测试，得到各自对应预设时段的扭体抑制率，具体包括：

选取雌性昆明种小鼠60只，分成6组；按预设剂量灌胃给药30分钟后，腹腔注射0.6％冰醋酸溶液0.1ml/kg；注射完毕后，将小鼠放在分开的盒子里，30分钟内记录小鼠扭体次数。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果在于：本发明所提出的wvbf和cfa之间的质量比重，经过本发明测试实验证明，在中枢镇痛方面1:2比例给药组有减毒存效作用，而1:5比例给药组有减毒增效作用。本发明的效果在于发现了在减毒存效作用和减毒增效作用条件下的特定的wvbf和cfa配比阈值，给予本领域技术人员依据相应的配比阈值设计相应的镇痛药提供了有效依据。

进一步的，本发明还给予减毒增效作用的最优比值区间，为1:5～1:20。经过推演，当比值超过1:20时，增效效果就会呈现减弱趋势。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明实施例提供的一种镇痛药配方中提取活性成分wvbf方法流程图；

图2是本发明实施例提供的一种镇痛药配方中提取总生物碱cfa方法流程图；

图3是本发明实施例提供的一种镇痛药配方测试方法流程图；

图4是本发明实施例提供的不同配比cfa-wvbf对斑马鱼心率的影响结果图；

图5a是本发明实施例提供的cfa组诱发的斑马鱼心血管毒性正常对照图；

图5b是本发明实施例提供的cfa组诱发的斑马鱼心血管毒性溶剂对照图；

图5c是本发明实施例提供的cfa组诱发的斑马鱼心血管毒性在cfa浓度为66.6μg/ml的对照图；

图5d是本发明实施例提供的cfa组诱发的斑马鱼心血管毒性在配比为1：5情况下的对照图；

图5e是本发明实施例提供的cfa组诱发的斑马鱼心血管毒性在配比为1：2情况下的对照图；

图5f是本发明实施例提供的cfa组诱发的斑马鱼心血管毒性在配比为2：1情况下的对照图；

图5g是本发明实施例提供的cfa组诱发的斑马鱼心血管毒性在配比为5：1情况下的对照图；

图6a是本发明实施例提供的供试品诱发的斑马鱼心血管毒性正常对照图；

图6b是本发明实施例提供的供试品诱发的斑马鱼心血管毒性溶剂对照图；

图6c是本发明实施例提供的供试品诱发的斑马鱼心血管毒性在cfa浓度为66.6μg/ml的对照图；

图6d是本发明实施例提供的供试品诱发的斑马鱼心血管毒性在配比为1：5情况下的对照图；

图6e是本发明实施例提供的供试品诱发的斑马鱼心血管毒性在配比为1：2情况下的对照图；

图6f是本发明实施例提供的供试品诱发的斑马鱼心血管毒性在配比为2：1情况下的对照图；

图6g是本发明实施例提供的供试品诱发的斑马鱼心血管毒性比为5：1情况下的对照图；

图7是本发明实施例提供的不同比例下的小鼠ld50的柱状图；

图8是本发明实施例提供的cfa与wvbf配比对小鼠的镇痛百分率时效关系比较图；

图9是本发明实施例提供的雪上一枝蒿配伍黄秦艽对小鼠热板实验的镇痛作用配比图；

图10是本发明实施例提供的cfa配伍wvbf对醋酸所致扭体次数图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明的描述中，术语“内”、“外”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不应当理解为对本发明的限制。

此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1:

本发明实施例1提供了一种镇痛药配方，包括：从金不换提取的活性成分wvbf(waterextractofveratrillabailloniifranch)；从雪上一枝蒿中提取的总生物碱cfa；所述活性成分wvbf和总生物碱cfa按照预设的比例进行混合，得到所述镇痛药；其中，所述预设的比例包括wvbf和cfa之间的质量比重为1:2或者1:5。

本发明实施例所提出的wvbf和cfa之间的质量比重，经过本发明后续实施例4-8的测试实验证明，在中枢镇痛方面1:2比例给药组有减毒存效作用，而1:5比例给药组有减毒增效作用。本发明的效果在于发现了在减毒存效作用和减毒增效作用条件下的特定的wvbf和cfa配比阈值，给予本领域技术人员依据相应的配比阈值设计相应的镇痛药提供了有效依据。

其中，减毒增效作用的最优比值区间，为1:5～1:20。经过推演，当比值超过1:20时，增效效果就会呈现减弱趋势。

实施例2:

本发明实施例2对于实施例1中涉及的所述活性成分wvbf的提取，提供了具体的实现方法，如图1所示，具体包括：

在步骤201中，取金不换生药材，置于容器中，并向所述容器加入蒸馏水。

在步骤202中，将所述容器放置在电热炉上加热至蒸馏水沸腾，加热3h后抽滤得到第一份提取液。

在步骤203中，分别再加热2h后进行抽滤得到第二份提取液，以及再加热1h后进行抽滤得到第三份提取液。

在步骤204中，合并所示第一份提取液、第二份提取液和第三份提取液，减压除去溶剂得干燥粉末。

本发明实施例为实施例1中的金不换提取的活性成分wvbf，提供了具体可行的实验方法。在本发明实施例中，对于采用不同量的金不换生药材，各试剂和仪器的选用也不尽相同，在本发明实施例中，提供了金不换生药材为500g的实现环境下各试剂和仪器的选用配置，其中，相应的所述容器具体采用3l容量的烧杯，则所述蒸馏水的剂量为2l。

其中，所述活性成分wvbf在与总生物碱cfa配比进行实验前，需要用蒸馏水稀释至所需浓度。

实施例3:

本发明实施例3对于实施例1中涉及的所述雪上一枝蒿的总生物碱cfa的提取，提供了具体的实现方法，如图2所示，具体包括：

在步骤301中，取雪上一枝蒿块根粉末，置于容器中，并加入95％乙醇。

在步骤302中，水浴加热容器至沸腾，3h后抽滤。

在步骤303中，分别再加热2h后进行抽滤，以及再加热1h后进行抽滤。

在步骤304中，抽滤后合并提取液，减压回收溶剂得到浸膏。

在步骤305中，浸膏加入浓度为2％的h2so4溶液进行混悬，石油醚脱脂，氨水调整ph到9，三氯甲烷萃取至有机相澄清，合并萃取液，浓缩干燥，得到总生物碱cfa。

本发明实施例为实施例1中的雪上一枝蒿提取的总生物碱cfa，提供了具体可行的实验方法。在本发明实施例中，对于采用不同量的雪上一枝蒿，各试剂和仪器的选用也不尽相同，在本发明实施例中，提供了雪上一枝蒿块根粉末500g的实现环境下各试剂和仪器的选用配置，其中，所述容器具体采用圆底烧瓶，则所述取雪上一枝蒿块根粉末，置于容器中，并加入95％乙醇具体实现为：

将所述雪上一枝蒿块根粉末500g，置于3000ml圆底烧瓶中，加入2l浓度为95％乙醇；其中，所述浓度为2％的h2so4溶液的剂量为1l。

其中，所述总生物碱cfa在与活性成分wvbf配比进行实验前，需要用蒸馏水稀释至所需浓度。

实施例4:

在提出了如实施例1所述的一种镇痛药配方后，为了进一步支撑其配比的科学性和有效性，本发明实施例进一步提供了一种镇痛药配方的测试方法来对其配比进行验证，所述测试方法包括cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试、cfa配伍wvbf的急性毒性测试、cfa配伍wvbf对热板法小鼠痛阈值测试和cfa配伍wvbf对冰醋酸所致扭体反应测试，如图3所示，具体包括以下步骤：

在步骤401中，根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试，确定能够缓解心血管毒性表型和/或不诱发明显的心血管毒性表型的一组或者多组配比。

在步骤402中，根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf的急性毒性测试，得到各组配比的ld50值。

在步骤403中，根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf对热板法小鼠痛阈值测试，得到各自对应预设时段的镇痛率。

在步骤404中，根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf对冰醋酸所致扭体反应测试，得到各自对应预设时段的扭体抑制率。

本发明实施例分别从毒性评价测试和药效评价测试两个维度入手，对本发明实施例中涉及的配比及其相邻配比的测试实验，论证本发明实施例1中所提出的配比的指示性作用和优越性。

实施例5:

在本发明实施例中，对于步骤401中的根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试，提供了一套拥有具体可实现参数值和相应实验内容，阐述如下：

在饲养有斑马鱼的六孔板中分别水溶给予66.6μg/ml的cfa、及其与wvbf不同的配比：1:5(其相对水含量为66.6μg/ml)、1:2(其相对水含量为66.6μg/ml)、2:1(其相对水含量为6.6μg/ml)和5:1(其相对水含量为66.6μg/ml)浓度，设置溶剂对照组(对照组中二甲基亚砜dmso作为助溶，配成10mg/ml的母液，再根据实验需要用蒸馏水稀释至所需药物浓度，其中dmso的含量小于1％，所述1％为母液与蒸馏水的体积比)和正常对照组。供试品处理斑马鱼4小时后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在显微镜下记录并统计斑马鱼心率(t)，计算相对心率，并观察有无心律不齐，如发生心律不齐，则分别计数心房率和心室率。统计学处理结果用mean±se表示；供试品处理斑马鱼24小时后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼，同样在显微镜下观察有无心包水肿、血流异常、血栓及出血，并统计其发生率；

其中，所述发生率大于第一预设阈值而小于第二预设阈值，则表明能够缓解心血管毒性表型；所述发生率小于第一预设阈值，则表明不诱发明显的心血管毒性表型。

上述cfa与wvbf配比心血管毒性测试评价结果如图4所示，为不同配比cfa-wvbf对斑马鱼心率的影响(n＝10)，具体的：

供试品处理斑马鱼4小时后，正常对照组，cfa(66.6μg/ml)、及不同配伍组与溶剂对照组(心率为167次/分，相对心率为100％)比较，各供试品浓度组p均>0.05，其中p为统计学检验，提示5个(“cfa”、“1:5”、“1:2”、“2:1”和“5:1”)供试品在本实验浓度下对斑马鱼心率没有影响，并斑马鱼心房率均与心室率相同，提示5个供试品均不诱发斑马鱼心律不齐。其中，p值小于0.05被认为有显著差异，说明有药效，反之没有药效。

供试品处理斑马鱼24小时后，cfa(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼出现较严重的心血管毒性，表现为心包水肿、血流减慢和心率减慢，发生率分别为56.7％、80％和80％，但未见血栓形成和出血；1:5(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼均未见明显的心血管毒性表型，与正常对照组斑马鱼相似；1:2(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼出现较严重的心血管毒性，表现为血流减慢和尾静脉血栓，发生率分别为80％和67.7％，但未见心包水肿和出血；2:1(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼出现严重的心血管毒性，表现为血流减慢和尾静脉血栓，发生率分别为100％和100％，但未见心包水肿和出血；5:1(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼出现严重的心血管毒性，表现为血流减慢和尾静脉血栓，发生率分别为100％和100％，但未见心包水肿和出血，如图5(cfa组诱发的斑马鱼心血管毒性表型图，由心包水肿表征，图中标注“a”的为cfa，配比以cfa:wvbf的顺序显示)和图6所示(供试品诱发的斑马鱼心血管毒性表型图，由尾静脉血栓表征，图中标注“a”的为cfa，配比以cfa:wvbf的顺序显示)。

其中，供试品处理斑马鱼24小时后，溶剂对照组与正常对照组相比无显著性差异(图5b)，cfa(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼出现较严重的心血管毒性，表现为心包水肿、血流减慢和心率减慢，但未见血栓形成和出血(图5c，6c)；1:5(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼均未见明显的心血管毒性表型，与正常对照组斑马鱼相似(图5d，6d)；1:2(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼出现较严重的心血管毒性，表现为血流减慢和尾静脉血栓，但未见心包水肿和出血(图5e，6e)；2:1(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼出现严重的心血管毒性，表现为血流减慢和尾静脉血栓，但未见心包水肿和出血(图5f，6f)；5:1(66.6μg/ml)浓度组斑马鱼出现严重的心血管毒性，表现为血流减慢和尾静脉血栓，但未见心包水肿和出血(图5g，6g)。

实施例6:

在本发明实施例中，对于步骤402中的所述根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf的急性毒性测试，得到各组配比的ld50值，具体由限度实验和主实验完成，所述一组或者多组配比具体为cfa-wvbf配比为5:1，2:1，1:2和1:5。

其中限度实验包括：

2000mg/kg剂量水平的限度试验：将受试物给予1只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，依次将受试物给予另外4只动物，动物总数为5只。如果1只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价：有3只或3只以上动物死亡时，ld50小于2000mg/kg；有3只或3只以上动物存活时，ld50大于2000mg/kg；如果有3只动物死亡，则进行主试验。

测试结果为：按cfa-wvbf比例为5:1，2:1，1:2，1:5分别给2000mg/kg给予7只雄性小鼠，7只小鼠死亡，转入主实验。

需要强调的是，本实验室前期研究发现，雪上一枝蒿对雄性动物的毒性更加明显，不同性别老鼠对其敏感性不一样，为了避免性别因素造成的干扰，优选的，只选择雄性小鼠进行实验。

其中，主实验包括：

固定默认级数因子sigma为0.5，相应剂量组距3.2，剂量即从以下序列中选择：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg。因为没有受试物的致死估计值，所以第1只动物给药剂量从175mg/kg开始，其中剂量序列包括：1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg和2000mg/kg。如果该动物存活，第2只动物给予高一剂量(即上述剂量序列中位于175mg/kg右侧的的550mg/kg)；如果第1只动物死亡或濒死状态，第2只动物给予低剂量(即上述剂量序列中位于175mg/kg左侧的的55mg/kg)。在此程序中每次给药1只动物，间隔至少48h，并认真观察动物。当满足停止实验标准之一时，停止实验。其中实验标准包括：①出现在最高剂量下有连续3只动物存活；②在6只动物中有5只连续发生在高一级剂量死亡、在低一级剂量生存的生死转换；③第一只动物发生转换之后至少有4只动物进入实验，并且其ld50估算值的范围超出临界值(2.5倍)。

cfa配伍wvbf的急性毒性测试评估如下：

cfa与wvbf配伍组比例5:1，2:1，1:2，1:5的ld50分别为55.00，155.77，162.71，174.98mg/kg。图7为不同比例下小鼠ld50的柱状图，其中，cfa与wvbf配伍组比例5:1，2:1，1:2，1:5的ld50分别为55.00，155.77，162.71，174.98mg/kg。

实施例7:

在本发明实施例中，对于步骤403中，根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于所述cfa配伍wvbf对热板法小鼠痛阈值测试，得到各自对应预设时段的镇痛率，给予了具体实现案例包括：

在本实施例中，选用雌性昆明种小鼠。给药前筛选合格小鼠，体重18～22g。将小鼠放在预热至55℃的恒温水浴器金属底板上，保持水温恒定，水温变化在±0.5℃以内，以小鼠接触热板至舔后足反应的时间(s)作为该小鼠的痛阈值，选定痛阈值在5～30s的小鼠进行试验，超出此范围或跳跃者弃之不用。筛选后合格小鼠60只，按体重随机分为6组，每组10只，包括空白对照组、阳性对照组(阿司匹林组)，cfa组，cfa与wvbf5:1，2:1，1:2，1:5配伍组。其中1:2，1:5配伍组分别灌胃给予等剂量(20mg/kg)的混合药物水溶液，cfa组灌胃给予剂量为20mg/kg的药物水溶液，阿司匹林组灌胃给药剂量200mg/kg，空白对照组灌胃给予等体积的生理盐水，灌胃给药体积为0.1ml/10g。重复测小鼠正常痛阈值，取2次正常痛阈平均值作为该鼠给药前痛阈值。给药一次后，测定小鼠给药后30、60、90分钟的痛阈值。为避免组织损伤，如痛阈值超过60s，即停止测试而按60s记录。热板法镇痛百分率计算方法为：镇痛百分率＝(给药后痛域值–给药前痛域值)/(给药前痛域值)*100％。

cfa配伍wvbf对热板法小鼠痛阈值的影响的测试评估如下：

热板法实验数据显示，cfa组和配伍给药各组在给药后30,60,90分钟后均能显著提高小鼠的痛阈值(与空白对照组比较p<0.05，p<0.01)。其中cfa与wvbf混合比例1:2给药组与阿司匹林组及cfa组的镇痛百分率相近(均在100％左右)。cfa与wvbf1:5给药组的镇痛百分率在30,60,90分钟相对于cfa组均有明显提高(分别为138.4％，176.7％，191.7％)，各组在给药后30,60,90分钟的时效关系见图8所示，热板法实验数据显示，与空白对照组比较，cfa组和配伍给药各组在给药后30,60,90分钟后均能显著提高小鼠的痛阈值(p<0.05，p<0.01)。其中cfa与wvbf混合比例1:2给药组与阿司匹林组及cfa组的镇痛百分率相近。cfa与wvbf1:5给药组的镇痛百分率在30,60,90分钟相对于cfa组均有明显提高。

实施例8:

在本发明实施例中，对于步骤404中，根据所述cfa与wvbf配比心血管毒性评价测试得到的一组或者多组配比，用于cfa配伍wvbf对冰醋酸所致扭体反应测试，得到各自对应预设时段的扭体抑制率，具体包括：

为避免小鼠性别差异对扭体实验的影响，选取雌性昆明种小鼠60只，分成6组。根据图9所示的对应各组的剂量灌胃给药30分钟后，腹腔注射0.6％冰醋酸溶液0.1ml/kg。注射完毕，立即将小鼠放在分开的盒子里，为防止室温较低对小鼠扭体的影响，扭体实验在恒温实验房中进行，30分钟内记录小鼠扭体次数。(出现腹部收缩内陷、躯干扭曲与后腿伸展及蠕等行为视为扭体一次)。扭体抑制率计算方法为：扭体抑制率＝(空白对照组平均扭体数–给药组平均扭体数)/(空白对照组平均扭体数)*100％。图9表明，单纯给予雪上一枝蒿和配伍给药组均能明显抑制小鼠腹腔注射冰醋酸所致扭体反应(与空白对照组比较p<0.05，p<0.01)。阳性对照组药物阿司匹林能有效抑制小鼠由冰醋酸所致的扭体反应。其中1:1和1:2给药组的镇痛效应与阿司匹林相近(40％左右)，但明显低于雪上一枝蒿组(76.4％)。1:5给药组的镇痛效应(81.3％)较雪上一枝蒿组(76.4％)略高。各组扭体抑制率的比较见图8。

如图10所示，为cfa配伍wvbf对醋酸所致扭体次数图，其中，*p<0.05和**p<0.01，有显著差异，说明具有镇痛作用。与对照组比较。扭体实验结果表明，单纯给予cfa和配伍给药组均能明显抑制小鼠腹腔注射冰醋酸所致扭体反应(与空白对照组比较p<0.05，p<0.01)。阳性对照组药物阿司匹林能有效抑制小鼠由冰醋酸所致的扭体反应。其中cfa：wvbf为1:2给药组的镇痛效应与阿司匹林相近(40％左右)，但明显低于雪上一枝蒿组(76.4％)。cfa：wvbf为1:5给药组的镇痛效应(81.3％)较雪上一枝蒿组(76.4％)略高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。