一种错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管及其制备方法与流程

本发明涉及一种医用人工血管及其制备方法，具体的说是一种错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管及其制备方法。

背景技术：

据统计中国有超过3000万周围血管闭塞疾病（pad）患者和100多万终末期肾病患者，其中终末期肾病患者每年还以12万递增。为了挽救pad患者肢体和维系终末期肾病患者“生命通路”，血管的重建或动静脉通路的建立是最重要的治疗方式，而其中很大一部分患者由于自体血管条件的限制需要用到小口径人工血管（sdvps，直径≤6cm）。但目前的sdvps因植入后内壁缺乏内皮细胞覆盖和吻合口内膜过度增生，缺乏长期通畅性和良好生物相容性，膝下人工血管旁路术后4年的通畅率仅仅54%。尽管sdvps有着这些明显不足，但至今仍然没有一种“理想的”血管代用品有望在不久将来取代目前的sdvps。组织工程人工血管是一个非常有前景的领域，但是它的基础和应用研究还处于早期。因此对sdvps改良促进移植后血管内壁快速内皮化同时抑制内膜增生，从而改进其长期通畅性已迫在眉睫。目前人工血管的改良主要包括两个方面：材料工程学改进和药物蛋白等缓释涂层。

自半个多世纪前voorhees首次使用维尼纶人工血管以来，dacron、ptfe、polyurethanes（pu）等材料人工血管及它们的改良产品广泛应用于临床。近年来silicone（pdms）、poly(ether)urethane（petu）等材料的人工血管也进入动物实验或者临床实验。但是sdvps效果都不甚理想，为了进一步提高其长期通畅性，研究发现通过材料改变人工血管表面性状可抑制血栓形成和内膜增生，比如碳、聚丙烯硫化物-聚乙二醇（peg）和1,8-辛二醇柠檬酸聚合物（pog）等涂层的eptfe血管等都显示一定的抑制血栓形成和内膜增生效果。本申请发明人曾使用pdms涂层针织pet血管，并使用pva修饰其内表面，该人工血管消除了pet血管通常用牛血清预凝可能带来的风险，显示较好的抗血栓形成和抑制内膜增生的作用，同时具有良好的生物相容性、顺应性、渗透性、缝合性和耐穿刺性。将该人工血管植入羊颈动脉旁路模型中发现内膜增生较商用的牛血清预凝的pet血管明显减少。

药物缓释涂层是改进人工血管长期通畅性的另一个重要途径。目前常用于涂层缓释的药物有paclitaxel（ptx）、sirolimus、everolimus、zotarolimus等。ptx和sirolimus等缓释的支架已经成功使用于冠状动脉和周围动脉成形术中，并显示减少再狭窄的发生；baek等将ptx涂层于人工血管管腔内表面，将该血管用于猪动静脉瘘模型，与非涂层的人工血管对比，发现实验组血管均保持通畅内膜增生明显被抑制，而对照组血管仅一根血管保持通畅而且内膜增生明显。本申请发明人曾使用ptx缓释pdms涂层pva修饰来改良针织pet血管，将该血管植入羊颈动脉，研究证实与商用的牛血清预凝的pet血管对比，术后6周内膜增生明显减少，证实ptx-pdms在抑制内膜增生中的作用（参考文献leebk,kimyh,parkdw,etal.acuteandlong-termangiographicoutcomesofsidebranchstenosisafterrandomizedtreatmentofzotarolimus-,sirolimus-,andpaclitaxel-elutingstentforcoronaryarterystenosis.jkoreanmedsci.2012;27(12):1499-1506.）。

但是不管是血管材料改进和涂层应用，还是药物缓释都还面临着许多问题，除了内膜增生以外，血管内壁再内皮化仍困扰着人工血管研究人员。研究发现人工血管植入人体数年后，血管内壁内皮化仍局限在距吻合口1-2cm内，甚至ptx或sirolimus等涂层在抑制内膜增生的同时也抑制内皮细胞层形成或者导致内皮细胞功能异常，从而导致高血栓形成风险。为了提高人工血管内壁内皮化，有研究将内皮细胞或者内皮祖细胞种植于dacron或者eptfe血管内表面，术后发现人工血管内壁内皮化可达到40%-92%；另有研究将抗cd34抗体或抗内皮细胞钙粘蛋白抗体涂层于eptfe血管内表面或金属裸支架上去捕获循环血中的内皮祖细胞，植入后血管内壁内皮化明显增加；也有研究将血管内皮生长因子（vegf）或者vegf基因固化于人工血管内表面，通过vegf在植入血管局部促进内皮细胞迁徙、增殖和成熟，从而促进血管内壁内皮化。比如lahtinen等将vegf-165dna质粒涂层注射在移植的eptfe血管周围，研究发现vegf-165dna质粒能在局部转染并促进人工血管内壁早期内皮化，提高通畅性。这些研究均在不同程度上解决了人工血管内壁内皮化的问题，但在血管内皮化的同时，内皮细胞种植技术的细胞培养耗费大量时间和费用、专用实验室配备和细胞的免疫原性，抗cd34抗体和vegf固化等面临的内皮细胞增殖的难以控制、缓释技术的不完善和后期吻合口内膜增生等问题，尤其是后者尚待解决。

是否能找到一种方法既能抑制内膜增生又能促进人工血管内壁内皮化呢；最近有研究在尝试进行多成分缓释涂层，并且尝试使多个生物活性物质差异释放从而产生协同的生物学作用。有研究构建抗cd34抗体、vegf和碱性成纤维生长因子（bfgf）多涂层的支架，让涂层各成分之间产生协同作用，促进内皮祖细胞捕获、增殖和成熟；hongzhang等设计将不同缓释系统涂层在人工血管的内外表面分别缓释vegf和pdgf，促使vegf和pdgf在血管内外表面先后释放，早期vegf的释放促进血管内壁内皮化，随后pdgf释放促进vsmc增殖和细胞外基质的合成，从而支持内皮细胞防止其凋亡和加强血管壁结构。为达到即促进血管内皮化又抑制后期的内膜增生目的，假如能设计一个错时释放的双缓释涂层，早期促进血管内壁快速内皮化，随后持续抑制吻合口内膜增生，可能成为一个可行的方案。

vegf基因转染表达的vegf蛋白是目前已知最强的内皮细胞有丝分裂原，它通过刺激内皮祖细胞迁移和成熟促进血管生成和再内皮化，还可以促进损伤的内皮细胞迅速修复。vegf缓释涂层的人工血管或支架在动物模型中已多次被证实促进内皮细胞再生从而加快内壁的再内皮化。ptx是常用的抑制内膜增生的免疫抑制剂，在药物缓释支架、ptx涂层人工血管研究中都证实其具有强烈的抑制内膜增生作用，该作用主要通过抑制平滑肌细胞的增殖、粘附和迁移来实现。

高分子纳米材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）是经过美国fda批准应用于临床的一种具有生物可降解和生物相容性高分子聚合物。本申请发明人前期采用乳化蒸发法制备封装雷帕霉素的plga纳米微粒（rapa-plga-nps，雷帕霉素(rapa)聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)纳米微粒(rapa-plga-nps)），显示高封装率和载药效率，浸涂静脉后明显抑制大鼠颈静脉-颈动脉移植后内膜增生。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)纳米微粒（plga-nps）作为一种非病毒基因载体，因其持续的可控表达、高安全性和生物相容性，以及防止体内dna降解和促进质粒dna内吞而使目的基因易转染等特性，被广泛研究和应用于基因治疗。有研究报道将基因封装的plganps固化于支架内表面能在支架相连的动脉组织内高效转染和表达。另外bechler等将封装dna(ppkcδ)质粒的纳米材料涂层在球囊导管表面，通过该球囊导管在鼠损伤动脉位置持续扩张20分钟，3天后发现扩张局部血管组织内ppkcδ表达明显增加，14天与对照组相比内膜增生减少60%，证实封装基因的plganps在局部进行基因转染和表达的有效性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的缺点，提供一种错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管及其制备方法，达到植入早期vegf基因转染表达促进血管内壁快速内皮化，后期ptx持续缓释抑制随后的内膜增生的目的，确保多功能人工血管在促进内皮细胞迁移、增殖和成熟与抑制中膜血管平滑肌细胞增殖之间产生协同作用，从而保证植入后良好的血管内壁内皮化和长期的通畅性，可促进小口径人工血管长期通畅性的明显改善。

本发明解决以上技术问题的技术方案是：

一种错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管，包括人工血管，在人工血管的内外表面均喷涂有双层涂层，双层涂层的内涂层为ptx缓释pdms涂层ptx-pdms，双层涂层的外涂层为生物降解的封装vegf基因的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微粒缓释涂层plga-nps。

错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管的制备方法，包括以下步骤：

㈠将人工血管伸展至使用长度，将11gpdms溶于88g乙酸乙酯中形成配置溶液，然后将人工血管置入含有配置溶液的自动涂喷装置内，以80转/分钟不断旋转，5min后取出血管，在60℃下干燥，并重复这个过程3次；

㈡将ptx溶于pdms溶胀剂中，pdms溶胀剂为乙酸乙酯溶液，将步骤㈠涂有pdms涂层的人工血管浸入甲醇溶液中5分钟激活，然后用去离子水清洗干净，再浸入含有ptx的pdms溶胀剂中30min，取出血管后常温晾干，等离子消毒备用；

㈢取30ml二氯甲烷和丙酮混合溶液，二氯甲烷和丙酮的体积比为9∶1，在西林瓶中溶解plga至质量百分浓度5%作为油相，取vegf质粒1ml作为水相，混合水相和油相，磁力搅拌，探头超声乳化4分钟，加入质量百分浓度2%的pva溶液反复超声乳化，室温下旋转蒸发3h，挥发有机溶剂，形成封装vegf质粒的plga-nps，并用γ-射线照射灭菌，4℃保存备用；

㈣取制备好的封装vegf基因的plga纳米微粒，将之置入乙醇溶液中形成纳米微粒悬浮液，使用自动喷涂装置将配置好的所述纳米微粒悬浮液均匀地喷涂在步骤㈡涂有ptx缓释pdms涂层ptx-pdms的人工血管内外表面，4℃晾干后，重复2次喷涂过程，制备的人工血管采用等离子消毒，4℃下保存备用。

本发明所用的自动喷涂装置为现有设备，型号：sonoflux2000f，美国思诺泰企业sono-tek公司生产。

本发明对血管涂层的生物活性物质和涂层缓释技术进行调整、改进与创新，采用不同缓释系统，将ptx-pdms作为血管内涂层，生物降解的封装vegf基因的plga-nps作为外涂层，确保双缓释之间的错时释放，形成早期vegf基因释放和转染，促进内皮细胞迁移、增殖和成熟，随后ptx长时间的缓释抑制吻合口内膜过度增殖，形成错时释放的双缓释涂层技术，在促进内皮细胞粘附、增殖和成熟与抑制内膜过度增生上产生协同作用。这样由内层ptx-pdms涂层和外层封装vegf基因的plga-nps缓释涂层组成的小口径的pet血管，以达到植入早期vegf基因转染表达促进血管内壁快速内皮化，后期ptx持续缓释抑制随后的内膜增生的目的，确保多功能人工血管在促进内皮细胞迁移、增殖和成熟与抑制中膜血管平滑肌细胞增殖之间产生协同作用，从而保证植入后良好的血管内壁内皮化和长期的通畅性，可促进小口径人工血管长期通畅性的明显改善。

本发明进一步限定的技术方案是：

前述的错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管，其中ptx缓释pdms涂层ptx-pdms上打有穿过人工血管管壁的纳米微孔，plga-nps所述纳米微孔形成后喷涂在ptx-pdms上。

前述的错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管，其中纳米穿孔间隔均匀且有序排列。

前述的错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管，其中ptx缓释pdms涂层ptx-pdms包括均匀涂于人工血管表面的pdms和浸入pdms基质中的ptx，pdms的喷涂量为每平方厘米15-20mg。

前述的错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管的制备方法，其中步骤㈣中，为了增加人工血管表面涂层量，在喷涂所述纳米微粒悬浮液之前用激光在步骤㈡制备好的ptx-pdms人工血管表面打穿过人工血管管壁的纳米微孔。

前述的错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管的制备方法，其中vegf质粒为vegf-165基因质粒，vegf质粒浓度为1mg/ml。

前述的错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管的制备方法，其中人工血管涂层前后分别精确称量，确保每平方厘米pdms涂层为15-20mg。

本发明的有益效果是：⑴本发明构建生物降解的plga-nps和ptx-pdms两种不同缓释系统，通过缓释系统错时释放生物活性物质来改良人工血管，从而让多个生物活性物质发挥协同作用，避免了单个生物活性物质释放系统的局限性，或多生物活性物质释放系统同时释放所带了的效应之间抵消或者干扰。⑵本发明将vegf（vegf-165）基因和ptx同时用于改良小口径人工血管，通过不同缓释系统的错时释放，早期vegf基因转染表达促进血管内壁内皮化，后期ptx持续缓释抑制随后的吻合口内膜过度增生，从而促进人工血管内壁快速内皮化防止血栓形成，同时抑制后期吻合口过度增生狭窄，改善小口径人工的长期通畅性。

申请人通过研究发明，本发明的sdvps纵向和周向稳定性未受明显影响，但是刚性随着pdms涂层量的增加而增大，当pdms20mg/cm²时弹性最好；渗透性检测发现在pdms＞15mg/cm²时渗漏明显抑制，30mg/cm²时基本消失；pdms15-20mg/cm²时，顺应性与传统的sdvps无明显差异；因此，将pdms的喷涂量设定为每平方厘米15-20mg。体外模拟循环下的释放试验证实，vegf基因在循环30分钟后循环液中检测到，30小时后到达最大值，随后逐渐减少一周低量维持，而ptx在循环12h后开始检测到，48h后到达高峰（2-3µg/h），随后逐渐下降，10天后循环液中维持在8-9µg/l,显示二者之间良好的错时释放特征。将本发明的sdvps吻合在刚取出的动脉上置于模拟循环中，24h后ptx在吻合口处的浓度＞30µg/l/mm²，距吻合口5mm远处降至14.2µg/l/mm²，1cm远处未发现明显的ptx浓集。将本发明的sdvps植入羊颈动脉建立旁路模型，术后6周取材观察sdvps内膜增生情况，结果发现本发明的sdvps较商用的pet血管内膜增生明显减少（569.0±235.7μmvs1843.9±653.8μm，p＜0.05）。

附图说明

图1为本发明的立体结构示意图。

图2是本发明的结构示意图。

图3是图2的c-c剖面图。

图4是图2的d点局部放大图。

具体实施方式

实施例1

本实施例是一种错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管，结构如图1所示，包括人工血管1，在人工血管1的内外表面均喷涂有双层涂层，双层涂层均有两层涂层组成，内涂层为喷涂在人工血管1内外表面的ptx缓释pdms涂层ptx-pdms2，双层涂层的外涂层为喷涂在ptx缓释pdms涂层ptx-pdms2上的生物降解的封装vegf基因的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微粒缓释涂层plga-nps3。为了增加纳米微粒涂层plga-nps3的效率，增加人工血管表面涂层量，在ptx缓释pdms涂层ptx-pdms2上打有穿过人工血管管壁的纳米微孔4，纳米微孔4可以间隔均匀且有序排列。ptx缓释pdms涂层ptx-pdms包括均匀涂于人工血管表面的pdms和浸入pdms基质中的ptx，所述pdms的喷涂量为每平方厘米15-20mg。

本实施例使用未预凝的6mmpet人工血管（micron^tm,法国intervascular公司），利用自动化的涂层装置将pdms均匀涂于pet血管表面，达到每平方厘米15-20mgpdms，然后通过湿法共价/离子结合方法将ptx浸入pet血管涂层的pdms基质中。vegf-165基因质粒和gfp基因质粒分别从sinobiologicalinc公司（北京）和clontech公司（paloalto,ca,usa）购买，采用双乳液溶剂挥发法制备封装vegf-165基因质粒的plganps。将制备好的封装vegf-165基因质粒的plganps通过自动医用喷涂装置均匀喷涂于ptx-pdmspet血管的内外表面构建vegf-165基因和ptx双缓释的多功能人工血管（vegf/ptx-pdmspet血管）。

本实施例错时释放双缓释涂层多功能小口径人工血管的制备方法包括以下步骤：

首先将人工血管伸展至厂家指定的使用长度，将11gpdms溶于88g乙酸乙酯中配置成溶液，然后将人工血管置入含有配置溶液的自动涂层装置内，以80转/分钟不断旋转，5min后取出血管，在60℃下干燥，重复这个过程3次。pet血管涂层前后分别精确称量，确保每平方厘米pdms涂层在15-20mg，并使用测厚仪测量涂层后pet血管厚度。

将ptx溶于配置的pdms溶胀剂中，制备的pdms涂层的pet血管浸入甲醇溶液中5分钟激活，然后用去离子水清洗干净，再浸入配置的含有ptx的pdms溶胀剂中30min，取出血管后常温晾干，等离子消毒备用。

采用双乳化溶剂挥发法制备封装基因的plganps，采用乳酸单体和羟基乙酸单体比例为50∶50的plga。vegf-165基因质粒和gfp基因质粒从生物公司购买。具体步骤如下：取30ml二氯甲烷和丙酮（二氯甲烷/丙酮＝9∶1）混合溶液，在西林瓶中溶解plga至浓度为5%作为油相，取vegf-165gene质粒（1mg/ml）1ml作为内水相，混合水相和油相，磁力搅拌，探头超声乳化（250w）4分钟，加入2%pva溶液反复超声乳化，室温下旋转蒸发3h，挥发去有机溶剂，形成封装vegf-165gene质粒的plganps。封装gfpgene、封装罗丹明-b的plga的纳米微粒和封装空白质粒的nps用同样的方法制备。制备nps用γ-射线照射灭菌，4℃保存备用。

取制备好的封装vegf-165基因的plga纳米微粒，将之置入乙醇溶液中形成纳米微粒悬浮液，为了增加人工血管表面nps涂层量，用激光在制备好的ptx-pdmspet血管表面打上纳米微孔，使用自动喷涂装置将配置好的nps悬液均匀地喷涂在人工血管内外表面，4℃晾干后，重复2次喷涂过程，喷涂前和喷涂晾干后精确称量人工血管重量，计算喷涂封装vegfgene的plganps量。制备的血管等离子消毒，4℃下保存备用。

本实施例的vegf/ptx-pdmspet血管物理性能、体外活性物质释放动力学和基因转染检测具体如下：

物理性能检测：使用英斯特朗拉伸试验机（instron，4502）检测构建的人工血管的纵向和周向稳定（纵向和周向拉伸爆破时的应力）及弹性。使用6-0prolene缝线在在1/10圆周处间断缝合10针，边距约3mm（至少打7个结以防滑脱），两端固定在英斯特朗拉伸试验机上后，作牵拉实验,计算机自动控制应力,记录吻合口断裂时的应力读数，测定吻合固持强度。将血管沿纵轴剪开固定，用2-0直针穿刺血管测定穿刺阻力。取8cm长构建血管，远近端结扎,并经近端插入连通管接测压计和加压注入装置,然后300mmhg/s注入pbs液,记录管壁破裂开始渗水时的压力读数,测量渗透性。每组实验测10个样本，取平均值，并与未涂层的pet血管及商用的预凝pet血管做比较。结构显示图层不影响材料的稳定性，其纵向和径向应力与传统材料相媲美，而且随着pdms涂层含量的增减其稳定性尤其是径向稳定性增加明显，当涂层量超过20mgpdms/c㎡时，其弹性模量超过其它聚酯材料。

体外活性物质释放动力学检测：使用体外模拟循环装置（8mm直径封闭回路的硅胶管，涡轮泵提供循环动力），将8cm长构建的pet血管固定于循环中段，循环中充满含5%白蛋白pbs溶液，维持120mmhg压力持续循环，流量维持在500ml/min，持续循环30天，每天取样，取样时，将循环内pbs溶液全部取出，测定其中基因和ptx浓度，然后循环内充满新的含5%白蛋白pbs溶液，继续持续循环，等待下一个取样，做基因和ptx释放曲线。同时用封装罗丹明-b的plga纳米微粒喷涂的ptx-pdmspet血管固定于循环中段，方法同前，每10天取出血管用激光扫描共聚焦显微镜可视下观察血管中罗丹明-b残留情况。结果显示，开始循环三十分钟后，vegf基因在循环液（白蛋白5%））中检测到，30小时后到达最大值，随后逐渐减少一周低量维持，而ptx在循环12小时后循环液中检测到（白蛋白5%），48小时后达到最大值。根据介质循环量，我们计算一个释放速率是每小时2-3µg。随后，观察到浓度的降低。10天后，在介质中的ptx浓度稳定在8-9µg/l.，显示二者之间良好的错时释放特征。

体外基因转染实验：取24孔细胞培养板中20孔，分为5组，分别取vegf/ptx-pdmspet血管、vegfpdmspet血管、ptx-pdmspet血管、blank/ptx-pdmspet血管，各剪取5mm×5mm大小血管壁。第一组4孔孔底铺上vegf/ptx-pdmspet血管壁；第二组4孔孔底铺上vegfpdmspet血管壁；第三组4孔孔底铺上ptx-pdmspet血管壁；第四组4孔孔底铺上blank/ptx-pdmspet血管壁；第五组4孔孔底不铺人工血管，作为空白对照组。人脐静脉内皮细胞系ecv304细胞（实验室保存）复苏后接种于培养皿中，置5%co2,37℃，饱和湿度培养箱内培养。取对数生长期的ecv304细胞，用胰酶消化7分钟后，制成1×10⁵/ml的细胞悬液，将该细胞悬液按500μl/孔种植到上述准备好的培养孔中，置5%co2,37℃，饱和湿度培养箱内培养。按照同样的方法种植另外三个相同的细胞培养板。分别于种植后24h和48h取其中的2个培养板，进行下列检测：细胞染色固定，显微镜下计数；elsa法检测各组vegf蛋白表达；mtt法检测ecv304细胞活力。结果显示含有vegf基因组内细胞生长旺盛，呈集落样或直线样生长，细胞倍增时间3-3.5天左右，较其它组明显加快，该组别中vegf蛋白表达明显增高，随培养时间延长，其表达量逐渐升高，在第4天达到高峰，后逐渐降低。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。