灰肉红菇多糖在治疗系统性红斑狼疮中的医用用途的制作方法

本发明公开了灰肉红菇多糖在治疗系统性红斑狼疮中的医用用途，提供了灰肉红菇多糖的新的医用用途，属于医药技术领域。

背景技术：

系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus,sle）是一种临床常见的自身免疫性疾病,以自身抗体产生、补体激活和免疫复合物沉积为主要病理特征。sle发病的主要特征就是自身免疫耐受异常，因此免疫学因素被广泛重视。研究表明，sle病人外周血cd3+cd4+t细胞下降，cd3+cd8+上升，il-10水平上调。il-10具有免疫刺激和免疫抑制双重作用。有研究表明，il-10可刺激系统性红斑狼疮患者pbmcs产生抗dsdna抗体，sle患者体内水平在活动期和缓解期都显著高于健康人群。中国sle的发病率为0.31%-0.70%，该病病程长，反复迁延，致残率高，对人体危害极大。由于sle病因及发病机制尚不明确，因此目前对sle的治疗并没有完全有效的方法，只能临床缓解不能治愈。目前，治疗sle的主要方法是激素疗法，但是长期服用激素副作用大，而且激素减停极有可能导致病情加重。因此，寻找一种新的天然药物治疗sle具有非常重要的现实意义和应用前景。

灰肉红菇（russulagriseocarnosa）于2009年由王向华首次在我国被记录为新种，并首次命名为灰肉红菇。灰肉红菇起初被误认为正红菇（russulavinosa）,目前尚无人分离出菌种。红菇属担子菌亚门，层菌纲，红菇目，红菇科，红菇属，是一类大型真菌。“本草纲目”所载，红菇味清、性温、开胃、止泻、解毒、滋补、常服之益寿也。“神农本草”记载，红菇可用于治疗眼目不明，可泻肝经之火，散热舒气。现代科学技术研究也表明，灰肉红菇具有多种药理作用如抗菌作用、抗氧化作用,改善贫血,祛湿,增强机体免疫力,预防心脏病,降血糖、血脂作用及抗癌功能。

目前，我国关于食药用菌多糖的研究受到广泛关注，由于其高效、天然、无毒副作用特征展现出广阔的研究和应用前景。我国地大物博，大量食药用菌亟待开发。经检索未见灰肉红菇多糖在治疗系统性红斑狼疮疾病中的医用用途文件报道。

技术实现要素：

本发明公开了一种灰肉红菇多糖在治疗系统性红斑狼疮中的医用用途，以灰肉红菇干品原料，采用特异的提取方法和有效的纯化方式获得一种灰肉红菇多糖（简称：prg1-2），用于制备治疗系统性红斑狼疮的药物。

本发明的目的在于提供一种灰肉红菇多糖的制备方法，包括以下步骤：

1）粉碎灰肉红菇子实体：

将野生灰肉红菇子实体晒干至质量不再改变，采用粉碎仪将其粉碎，并进行100目筛过滤，密封保存用于提取多糖；

2）水提法抽提粗多糖：

向灰肉红菇子实体粉末加入超纯水，于高温水浴浸提一段时间后，将浸提液用双层滤纸过滤，所得滤液为浸提液,采用旋转蒸发仪将浸提液浓缩至初始体积的1/20；优选，称取40g步骤1）中所获粉末；优选于90℃水浴中浸提；优选，浸提3h；优选，将浸提液浓缩至50ml；

3）醇沉：

向浓缩液中加入4倍浓缩液体积的无水乙醇并充分混匀，在4℃条件下静置过夜,保留沉淀，并采用75%乙醇洗涤充分，将沉淀冻干备用；优选，4℃静置12h;

4）sevage法去蛋白：

将步骤3）所得沉淀物采用超纯水溶解，分别加入等体积的正丁醇：氯仿（1:4）混合溶液后，离心，保留上清，共重复三次；优选，2000g离心20min；

5）透析：

将步骤4）所得多糖用超纯水溶解后，在超纯水中进行透析后，冻干；

6）醇沉：

将步骤5）多糖样品再次用超纯水溶解，离心取上清，再用终浓度80%乙醇醇沉，离心去上清液，将沉淀冻干备用;优选，超纯水溶解后采用5000rpm,离心10min，取上清；优选，80%乙醇醇沉后，采用5000rpm，离心10min；

7）离子交换层析纯化：

将6）醇沉样品采用超纯水溶解获得灰肉红菇子实体的粗多糖，采用超纯水平衡deae-52柱，将粗多糖溶液缓慢上样，先用水洗脱，去除掉中性糖，再分别采用含有0.1，0.2,0.3mnacl水溶液洗脱柱子，收集0.2mnacl水溶液洗脱下的样品；

8）分子筛层析纯化：

采用0.2mnacl水溶液平衡分子筛，将含有0.2mnacl水溶液洗脱下的多糖样品进行sephadexg100分子筛柱层析,并采用0.2mnacl水溶液进行洗脱，收集第一个洗脱峰，即得prg1-2。

本发明的积极效果在于：

提供了灰肉红菇多糖在治疗系统性红斑狼疮疾病新的医用用途，通过动物模型试验，灰肉红菇多糖具有调节t细胞亚群活性，降低il-10，ds-dna抗体和尿蛋白作用，对于系统性红斑狼疮的治疗具有疗效显著，安全可靠，毒副作用小等特点，为系统性红斑狼疮的治疗又提供了一种新的药物。

附图说明

图1为本发明deae层析分离灰肉红菇粗多糖；

图2为本发明分子筛层析分离灰肉红菇多糖prg1。

具体实施方式

本发明的具体实施方式用来对本发明的构成进行进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

灰肉红菇子实体粗多糖的制备方法，依次进行以下步骤：

1）将采摘新鲜的灰肉红菇子实体晾晒至质量不再改变，彻底去除水分；

2）采用粉碎仪破碎烘干的子实体，过100目筛去除较大颗粒；

3）称取40g灰肉红菇子实体粉末，加入1l超纯水，于90℃的水浴中浸提3h。将浸提液用双层滤纸过滤，所得滤液为浸提液，采用旋转蒸发仪将浸提液浓缩至50ml；

4）向浓缩浸提液中缓慢加入4倍浓缩液体积的无水乙醇并充分混匀，

40℃静置12-16h,保留沉淀，并采用75%乙醇充分洗涤后冻干；

5）将沉淀物用10ml超纯水重悬溶解，与10ml正丁醇、氯仿混合液（正丁醇：氯仿=4:1）混合，常温下，充分震荡，3000g离心20min,取上层水相，此步骤重复3次；

6）将步骤（5）水相样品用超纯水溶解后，在超纯水中进行透析后，冻干；

7）将步骤（6）多糖样品再次采用超纯水溶解，5000rpm,离心10min取上清，再用终浓度80%乙醇醇沉，5000rpm,离心10min去上清液，将沉淀冻干备用。

实施例2

灰肉红菇子实体多糖prg1-2的分离纯化方法，依次进行以下步骤：

1）离子交换层析：采用超纯水重悬灰肉红菇粗多糖冻干粉,0.22μm滤膜过滤。预先采用超纯水平衡deae-52柱，将粗多糖溶液以1ml/min速度缓慢上柱，2倍柱体积的超纯水洗涤柱子，再分别采用含有0.1mnacl,0.2mnacl和0.3mnacl水溶液以1.0ml/min的流速洗脱柱子，并收集所有洗脱下来的多糖样品，将0.2mnacl洗脱下样品prg1进行下一步纯化；

2）将上一步的prg1进行分子筛分离纯化。首先采用含有0.2mnacl水溶液平衡sephadexg100,将prg1上样，以1ml/min流速洗脱，并收集第二个洗脱峰即为prg1-2。

通过以下动物实验进一步证明灰肉红菇多糖在治疗系统性红斑狼疮疾病的新的医用用途：

灰肉红菇子实体纯化多糖prg1-2对系统性红斑狼疮mrl/lpr小鼠的影响：

1、将40只8周龄sle雌性mrl/lpr小鼠随机分为如下4组，每组10只,每天灌胃给药，连续给药3周；

2、测定小鼠血清il-10和ds-dna水平：

采用il-10mouseelisakit(invitrogen)和mousedsdnaelisakit（creativediagnostics）测定给药3周后各组小鼠血清中il-10和ds-dna抗体水平；

3、测定小鼠脾细胞t细胞亚群(cd3⁺cd4⁺,cd3⁺cd8⁺)：

采用机械法分离小鼠脾细胞，并对其进行裂解红细胞处理，采用2%fbs的pbs缓冲液将细胞浓度调整至2×10⁶cells/ml，每只小鼠制备两个样品管，每管100μl，按如下表格加入流式抗体（bdbiosciences）。室温避光孵育30min,采用1ml2%fbs的pbs缓冲液（500g,5min）洗涤，并采用500μl2%fbs的pbs缓冲液重悬，用于流式检测；

4）小鼠尿蛋白水平测定：

采用尿蛋白检测试剂盒（北京九强生物技术股份有限公司）测定给药3周后各组小鼠尿蛋白水平；

5）实验结果：

与sle小鼠对照组比较（表1），prg1-2给药组均能显著降低il-10，ds-dna抗体和尿蛋白水平，且随着prg1-2剂量增加，il-10，ds-dna抗体和尿蛋白水平降低越显著，这说明本发明对于sle小鼠治疗效果显著；

表1prg1-2对sle小鼠血清il-10，ds-dna和尿蛋白水平的影响：

此外，t细胞亚群分析结果表明，与sle小鼠对照组比较（表2），在灌胃给药prg1-2后，给药组小鼠的cd3⁺cd4⁺亚群比例呈剂量依赖方式上升，而给药组小鼠的cd3⁺cd8⁺亚群比例呈剂量依赖方式下降，具有纠正sle小鼠t细胞亚群比例失衡状态的作用。

表2prg1-2对sle小鼠血清il-10，ds-dna和尿蛋白水平的影响

结论，prg1-2具有降低sle小鼠il-10，ds-dna，尿蛋白作用，并能纠正t细胞亚群失衡，说明通过本发明制备的prg1-2治疗sle小鼠效果显著，可用于治疗系统性红斑狼疮的药物中的应用。