一种基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种医用材料，具体涉及一种基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片及其制备方法与应用。

背景技术：

皮肤是人体最大的器官，具有重要的物理、化学及生物学屏障功能，全层皮肤缺损创面的修复是外科领域的一个基本问题，全层皮肤缺损不仅需要创面及时和永久的覆盖而且要能最大限度地恢复功能和外观，尽早修复缺损皮肤并最大可能恢复功能和外观已成为治疗重要目标；皮肤组织的修复和功能恢复中，血管化成为瓶颈问题。猪小肠主要由4层组成，由里到外分别为粘膜层，粘膜下层、肌层和浆膜层。猪小肠粘膜下层由一层致密的结缔组织构成，主要成分为i、iii型胶原纤维，含有少量细胞及部分较大的血管、淋巴管和神经。

近期研究显示，sis材料对于消化道缺损的修复具有较好效果。delafuente等的实验中，12只大鼠40%的胃壁被全层切除，双层sis材料被用于修复胃壁缺损，术后3周胃壁病理检查结果显示：所有大鼠的胃壁缺损均已被肉芽和纤维组织所修复，所有大鼠均存活，体重增加，且无腹膜炎表现。而且，badylak等的实验提示多层sis材料具有较高的结构强度，完全可满足食管缺损修复的力学强度要求。但是，单纯的sis材料修复消化道后，易出现吻合部位的狭窄。究其原因为该材料是一种无细胞、富含胶原，并含有黏附生长因子的一种生物材料。单纯的sis材料植入体内后，非常容易接收宿主细胞，而植入手术引起的创伤反应，往往导致成纤维细胞过度增值，最终以瘢痕修复形成狭窄。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片及其制备方法，得到的新型生物补片是很好的生物支架材料，其结构成分和空间三维结构十分相似，在临床的实验中表现出了很好的生物相容性，促伤口愈合性，更重要的是对各种组织再生又重塑性，尤其是对皮肤的创伤愈合有修复效果，对皮肤的再生有重要意义。

本发明公开了一种基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片的制备方法，包括以下步骤，将脱细胞猪小肠粘膜下层与添加剂复合，得到基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片；所述添加剂包括生长因子、药物中的一种或两种。

上述技术方案中，所述生长因子包括血管内皮生长因子、神经生长因子、表皮生长因子，所述药物包括抗生素、肝素；可以将分泌生长因子的细胞接种于脱细胞猪小肠粘膜下层表面，然后进行体外培养，得到脱细胞猪小肠粘膜下层与细胞复合材料；然后将脱细胞猪小肠粘膜下层与细胞复合材料进行反复冻融，最后去除细胞得到复合生长因子的脱细胞猪小肠粘膜下层，优选将分泌生长因子的细胞进行传代培养；取生长状况良好的第3代分泌生长因子的细胞，用胰蛋白酶消化后离心制成细胞悬液，取细胞悬液接种于脱细胞猪小肠粘膜下层表面；所述体外培养的时间为3d；也可以将脱细胞猪小肠粘膜下层浸泡在含有添加剂的溶液中1～5h，得到复合添加剂的脱细胞猪小肠粘膜下层。

上述技术方案中，以猪小肠粘膜下层为原料，采用高低渗透压法和去污剂法结合制备脱细胞猪小肠粘膜下层；比如取猪小肠，清洗后通过机械刮除法去掉浆膜层和肌层，然后将剩下的小肠粘膜下层在含有0.05%～1%过氧乙酸、1%～10%乙醇的溶液中浸泡处理0.5～5h，再用去离子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡1～6h，再依次使用高渗溶液浸泡1～3h、去污剂溶液浸泡1～3h、低渗溶液浸泡1～3h、去污剂溶液浸泡2h；然后置入0.1～1mol/lnaoh溶液中浸泡1～30min；再用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，γ射线消毒，得到脱细胞猪小肠粘膜下层。

本发明制备的基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片可以在制备皮肤缺损修复材料中的应用；所述皮肤缺损包括糖尿病足溃疡、烧伤、化学烧伤、外伤引起的皮肤缺损。

本发明制备的基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片应用于临床促进皮肤修复可以通过以下两种途径实施：

基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片作为暂时贴附物覆盖于皮肤缺损表面以促进上皮细胞和内皮细胞的增殖，对皮肤和毛细血管等组织进行修复并在此修复过程中更强地抗炎、抗瘢痕及促进杯状细胞分化；

基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片作为永久性移植替代物移植于皮肤缺损表面以促进上皮细胞和内皮细胞的增殖，对皮肤和毛细血管等组织进行修复并在此修复过程中更强地抗炎、抗瘢痕及促进杯状细胞分化。

本发明制备的基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片是很好的生物支架材料，结构成分和空间三维结构十分相似，在临床的实验中表现出了很好的生物相容性，促伤口愈合性，更重要的是对各种组织再生又重塑性；这种生物支架材料对皮肤的创伤愈合有有效的修复效果，对皮肤的再生有重要意义。

本发明制备的基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片支持表面上皮生长，其含有多种细胞因子等活性成分，是一种理想的支持上皮细胞生长的物质，可延长其生命，维持其克隆；而且无免疫原性，可作为异基因支架材料，用于移植不会导致免疫介导的炎性反应。

本发明制备的基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片在多种跨种交叉移植实验中均表现为无免疫原性，直接诱发实验无应答反应，含有的多种因子可抑制辅助t细胞的活化并参与t细胞的凋亡，可部分抑制辅助t细胞的扩增，并以转移生长因子β依赖方式抑制白介素-12、γ干扰素的分泌，这种抑制可通过加入外源重组il-12而解除，在体外，可完全抑制辅助th2的增值；其存在α-1、α-gal抗原决定簇，但不激活人血清的补体；有良好的细胞相容性，可促进多种细胞在材料上黏附，生长和分化，是可提供细胞生长、迁移并有空间定位的三维材料。

本发明将生长因子、药物等与脱细胞猪小肠粘膜下层通过特殊工艺结合，使皮肤修复速度加快，减少伤口感染几率；采用本发明的基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片，猪小肠粘膜下层移植手术操作简单易行，实施过程安全可靠，易于实施，原料来源广泛，脱细胞猪小肠粘膜下层作为支架材料应用广泛，制备方便。

本发明的基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片的脱细胞猪小肠粘膜下层作为支架材料，为细胞增殖提供了良好的细胞外基质结构，vegf、egf、ngf等生长因子可以促进血管生成，神经组织修复和表皮组织的修复，加快结膜上皮的修复以及杯状细胞的分化。加入抗生素等药物可有效防止细菌感染，减少伤口感染几率，减轻皮肤修复过程中炎症细胞浸润，减少结膜组织再塑性过程中的瘢痕形成；此复合生物材料可以作为新的组织工程材料用于皮肤表面重建治疗。

本发明的基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片的主要应用形式为暂时性贴敷或移植复合生物材料于皮肤缺损组织表面以促进皮肤组织重建，并在此过程中达到更好的促进毛细血管、神经组织、表皮组织的生成以及抑制炎症和抗瘢痕的效果；尤其是涉及糖尿病足溃疡糖尿病足溃疡、烧伤、化学烧伤（碱烧伤）与各种外伤引起的皮肤损伤。

附图说明

图1为实施例一中空白对照组小鼠创缘照片图；

图2为实施例一实验1周后小鼠创缘照片图；

图3为实施例二中空白对照组小鼠创缘照片图；

图4为实施例二实验1周后小鼠创缘照片图；

图5为实施例三中空白对照组小鼠创缘照片图；

图6为实施例三实验1周后小鼠创缘照片图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员了解，本发明的实施例并非对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。

实施例一

将新鲜猪小肠清洗干净，通过机械刮除的方法去掉浆膜层和肌层，然后将剩下的小肠粘膜下层在含有0.1%过氧乙酸、10%乙醇的溶液中浸泡处理1h，用去离子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡2h，再依次使用高渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h，低渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h。将制得的脱细胞猪小肠粘膜下层放1mol/lnaoh溶液中浸泡1min；仔细用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，γ射线消毒。

上述操作中所述的高渗溶液各物质成分为：1l高渗溶液含58.44g氯化钠、6.06gtris、2.92gedta、1l纯化水；低渗溶液各物质成分：1l低渗溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l纯化水；去污剂溶液各物质成分：1l去污剂溶液含15g十二烷基磺酸钠、1l纯化水。

将内皮细胞进行传代培养，取生长状况良好的第3代内皮细胞和雪旺细胞，用胰蛋白酶消化后离心制成细胞悬液，取细胞悬液接种于脱细胞猪小肠粘膜下层表面，放入培养箱中培养3d，取培养结束的脱细胞猪小肠粘膜下层与细胞复合材料进行反复冻融处理，脱去细胞，得到复合生长因子vegf的脱细胞猪小肠粘膜下层，即基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片。具体冻融方法：将脱细胞猪小肠粘膜下层与细胞复合材料置于液氮中10min，37℃复温10min，重复操作3次。脱细胞处理后，用生理盐水清洗至无浑浊后，冻干备用，使用前生理盐水复水15min。

使用上述复合生长因子vegf的脱细胞猪小肠粘膜下层在zdf糖尿病鼠身上进行动物实验。实验1周后，创缘均未出现明显坏死及发黑，缺损片边缘周围出现轮廓光整的组织增生，缺损周围皮肤开始出现收缩，缺损部位均无脓液形成及出血，炎症反应轻，渗出少，效果图见图2，附图1为空白对照，肉芽组织不多，炎细胞浸润明显，少量上皮长入。

实施例二

将新鲜猪小肠清洗干净，通过机械刮除的方法去掉浆膜层和肌层，然后将剩下的小肠粘膜下层在含有0.5%过氧乙酸、10%乙醇的溶液中浸泡处理2h，用去离子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡2h，再依次使用高渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h，低渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h。将制得的脱细胞猪小肠粘膜下层放0.5mol/lnaoh溶液中浸泡5min；仔细用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，γ射线消毒。

上述操作中所述的高渗溶液各物质成分为：1l高渗溶液含58.44g、氯化钠、6.06gtris、2.92gedta、1l纯化水；低渗溶液各物质成分：1l低渗溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l纯化水；去污剂溶液各物质成分：1l去污剂溶液含15g十二烷基磺酸钠、1l纯化水。

将雪旺细胞进行传代培养，取生长状况良好的第3代内皮细胞和雪旺细胞，用胰蛋白酶消化后离心制成细胞悬液，取细胞悬液接种于脱细胞猪小肠粘膜下层表面，放入培养箱中培养3d，取培养结束的脱细胞猪小肠粘膜下层与细胞复合材料进行反复冻融处理，脱去细胞，得到复合生长因子ngf的脱细胞猪小肠粘膜下层，即基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片。具体冻融方法：将脱细胞猪小肠粘膜下层与细胞复合材料置于液氮中10min，37℃复温10min，重复操作3次。脱细胞处理后，用生理盐水清洗至无浑浊后，冻干备用，使用前生理盐水复水15min。

上述复合生长因子ngf的脱细胞猪小肠粘膜下层移植用于治疗糖尿病足溃疡，使用上述复合生长因子ngf的脱细胞猪小肠粘膜下层在zdf糖尿病鼠身上进行动物实验。实验1周后，创缘均未出现明显坏死及发黑，缺损片边缘周围出现轮廓光整的组织增生，缺损周围皮肤开始出现收缩，缺损部位均无脓液形成及出血，炎症反应轻，渗出少，效果图见图4，附图3为空白对照组，见真皮浅层仍可见血痂附着炎反应明显，真皮浅层炎反应下方明显肉芽组织形成，胶原纤维增生明显，上皮覆盖未完整。

实施例三

将新鲜猪小肠清洗干净，通过机械刮除的方法去掉浆膜层和肌层，然后将剩下的小肠粘膜下层在含有0.5%过氧乙酸、5%乙醇的溶液中浸泡处理1h，用去离子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡4h，再依次使用高渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h，低渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h。将制得的脱细胞猪小肠粘膜下层放0.5mol/lnaoh溶液中浸泡5min；仔细用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，γ射线消毒。

上述操作中所述的高渗溶液各物质成分为：1l高渗溶液含58.44g氯化钠、6.06gtris、2.92gedta、1l纯化水；低渗溶液各物质成分：1l低渗溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l纯化水；去污剂溶液各物质成分：1l去污剂溶液含15g十二烷基磺酸钠、1l纯化水。

将内皮细胞和雪旺细胞进行传代培养，取生长状况良好的第3代内皮细胞和雪旺细胞，用胰蛋白酶消化后离心制成细胞悬液，取细胞悬液接种于脱细胞猪小肠粘膜下层表面，放入培养箱中培养3d，取培养结束的脱细胞猪小肠粘膜下层与细胞复合材料进行反复冻融处理，脱去细胞，得到复合生长因子vegf和ngf的脱细胞猪小肠粘膜下层，即基于猪小肠粘膜下层的复合型生物补片。具体冻融方法：将脱细胞猪小肠粘膜下层与细胞复合材料置于液氮中10min，37℃复温10min，重复操作3次。脱细胞处理后，用生理盐水清洗至无浑浊后，冻干备用，使用前生理盐水复水15min。

上述复合生长因子vegf和ngf的脱细胞猪小肠粘膜下层移植用于治疗糖尿病足溃疡，使用上述复合生长因子ngf和ngf的脱细胞猪小肠粘膜下层在zdf糖尿病鼠身上进行动物实验。实验1周后，创缘均未出现明显坏死及发黑，缺损片边缘周围出现轮廓光整的组织增生，缺损周围皮肤开始出现收缩，缺损部位均无脓液形成及出血，炎症反应轻，渗出少，效果图见图6，附图5为空白对照组，血痂厚，部分剥离，创面充血明显，毛细血管少，周围表皮细胞增殖移行不明显，上皮层较薄，细胞排列致密凌乱，未见皮肤附属结构。

实施例四

将新鲜猪小肠清洗干净，通过机械刮除的方法去掉浆膜层和肌层，然后将剩下的小肠粘膜下层在含有0.5%过氧乙酸、5%乙醇的溶液中浸泡处理1h，用去离子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡4h，再依次使用高渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h，低渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h。将制得的脱细胞猪小肠粘膜下层放0.8mol/lnaoh溶液中浸泡5min；仔细用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，γ射线消毒。

上述操作中所述的高渗溶液各物质成分为：1l高渗溶液含58.44g氯化钠、6.06gtris、2.92gedta、1l纯化水；低渗溶液各物质成分：1l低渗溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l纯化水；去污剂溶液各物质成分：1l去污剂溶液含15g十二烷基磺酸钠、1l纯化水。

将脱细胞猪小肠粘膜下层浸泡在含有肝素的溶液中2h，得到复合添加剂的脱细胞猪小肠粘膜下层；移植用于治疗糖尿病足溃疡，实验1周后，创缘均未出现明显坏死及发黑，缺损片边缘周围出现轮廓光整的组织增生，缺损周围皮肤开始出现收缩，缺损部位均无脓液形成及出血，炎症反应轻，渗出少；空白对照组，血痂厚，部分剥离，创面充血明显。

实施例五

将新鲜猪小肠清洗干净，通过机械刮除的方法去掉浆膜层和肌层，然后将剩下的小肠粘膜下层在含有0.5%过氧乙酸、5%乙醇的溶液中浸泡处理1h，用去离子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡4h，再依次使用高渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h，低渗溶液浸泡2h，去污剂溶液浸泡2h。将制得的脱细胞猪小肠粘膜下层放0.2mol/lnaoh溶液中浸泡5min；仔细用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，γ射线消毒。

上述操作中所述的高渗溶液各物质成分为：1l高渗溶液含58.44g氯化钠、6.06gtris、2.92gedta、1l纯化水；低渗溶液各物质成分：1l低渗溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l纯化水；去污剂溶液各物质成分：1l去污剂溶液含15g十二烷基磺酸钠、1l纯化水。

将脱细胞猪小肠粘膜下层浸泡在含有肝素的溶液中2h，得到复合添加剂的脱细胞猪小肠粘膜下层；移植抗生素治疗小鼠烧伤，实验1周后，创缘均未出现明显坏死及发黑，缺损片边缘周围出现轮廓光整的组织增生，缺损周围皮肤开始出现收缩，缺损部位均无脓液形成及出血，炎症反应轻，渗出少；空白对照组，血痂厚，部分剥离，周围表皮细胞增殖移行不明显，上皮层较薄，细胞排列致密凌乱，未见皮肤附属结构。