一种聚乙二醇修饰的具有pH响应性的高载药量纳米胶束或囊泡的制备方法与流程

本发明属于高分子材料和生物医学工程领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的具有ph响应性的高载药量的纳米胶束或囊泡的制备方法。

背景技术：

聚乙二醇(peg)是一种生物相容性好的聚合物，具有良好的水溶性、无毒无刺激、免疫原性低等特点，可通过肾脏排出体外，不会累积在体外，故广泛应用于生物医学领域。

由于聚乙二醇具有良好的血液相容性，故常用于药物释放载体、生物材料表面改性、组织工程材料等方面。聚乙二醇作为原材料制备的两亲性嵌段共聚物作为药物载体时，本身无药理作用，药物可通过自组装包裹进聚合物中或以共价键连接形成药物复合物。这种嵌段共聚物在药物控释载体中起着至关重要的作用,药物释放后,高分子载体不会在体内长时间积累,而是排出或水解后被吸收。

目前，聚乙二醇基的两亲性共聚物可以通过多种方式自组装成高效的药物载体，而装载在内的分子，涵盖了质粒-dna、羧基荧光素、疏水性的抗肿瘤药物、亲水性的药物或蛋白质、以及用于诊断/治疗的无机纳米粒子等。

传统的抗肿瘤药物多数为非选择性药物，不具有靶向效应，故大多情况下对正常细胞存在较大的杀伤力。为提高药物疗效，减少毒副作用，现常将化疗药物置于聚合物胶束、囊泡、脂质体等自组装体中，以期望起到对药物缓释、控制作用，以及对病变部位靶向给药、提高载药量等作用。同时，为提高药物控制缓释作用，对环境响应性的纳米囊泡、胶束等的研究越来越广泛，如糖响应性、ph响应性、温度响应性等。

目前，研究者们为进一步提高纳米粒子载药量，降低药物对正常细胞的毒副作用，常使用生物相容性好、无毒害的聚合物修饰抗肿瘤药物，期望进一步提高肿瘤的化学治疗水平。marinashamis等将抗肿瘤药物阿霉素和喜树碱分别连接到亲水基团上，并在另一端接入活性酶38c2，以提高载药量和生物活性(j.am.chem.soc.2004,126,6)；申有青等将药物喜树碱与低聚合度的聚乙二醇反应生成两亲性嵌段共聚物，然后通过自组装形成囊泡并包裹药物阿霉素(j.am.chem.soc.2010,132,4259-4265)；minheelee等将1,8-萘二甲酰亚胺作为荧光检测部位，并在其一端通过二硫键连接喜树碱，另一端连接rgd环肽作为靶向单位，成功实现了肿瘤治疗的靶向识别、检测，以及肿瘤治疗于一体(j.am.chem.soc.2012,134,12668−12674)。

本发明中，我们用生物相容性良好的聚乙二醇作为亲水段，药物多柔比星作为疏水段制备两亲性的嵌段共聚物，并引入对ph较敏感的顺式乌头酸酐，通过自组装获得纳米胶束和囊泡，从而提高传统纳米粒子的载药量，并提高对药物释放的控制能力，减少对人体正常组织的毒害作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的具有ph响应性的高载药量纳米胶束或囊泡的制备方法。

本发明的目的是在将聚乙二醇与抗癌药物多柔比星反应形成两亲性的嵌段共聚物，然后自组装形成纳米胶束和囊泡，突破原有的纳米粒子载药量低的缺陷。本发明采用了聚乙二醇为亲水链，抗癌药物多柔比星为疏水链，制备了一系列具有ph响应性的高载药量纳米胶束和囊泡。

本发明提出的一种聚乙二醇修饰的具有ph响应性的高载药量纳米胶束或囊泡的制备方法，具体步骤如下：

(1)将聚乙二醇单甲醚与丁二酸酐按摩尔比为1：(1~2)的比例溶解在四氢呋喃中，75℃回流12~48小时后，在沉淀剂a中沉淀2~3次，过滤，滤饼真空干燥至恒重，得到端羧基修饰的聚乙二醇；

(2)将季戊四醇、催化剂4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺按摩尔比为1.3：4：0.3的比例溶解在溶剂b中，配成季戊四醇溶液；再将步骤(1)得到的端羧基修饰的聚乙二醇溶解在溶剂b中，并以极缓慢的速度滴加到所述季戊四醇溶液中，充分搅拌2~3天；在沉淀剂a中沉淀2~3次，过滤，滤饼真空干燥至恒重，得到三羟基修饰的聚乙二醇；

(3)将盐酸多柔比星溶于去离子水中配成3.33-6.66g/l的盐酸多柔比星水溶液，再将顺式乌头酸酐溶于二氧六环中配成5-10g/l的溶液，并逐滴滴加到盐酸多柔比星水溶液中，搅拌，期间以0.5m的氢氧化钠溶液调节溶液的ph值为8.4-8.6；反应24小时，1mol/l的盐酸酸化至有沉淀产生，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干，干燥，得到羧酸修饰的多柔比星；

(4)将步骤(3)所得羧酸修饰的多柔比星、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶溶于10ml无水二甲基亚砜中，搅拌形成多柔比星溶液；再将步骤(2)所得的三羟基修饰的聚乙二醇溶于5ml无水二甲基亚砜中，并逐滴滴加到所述多柔比星溶液中，避光反应24小时。羧酸修饰的多柔比星、三羟基修饰的多柔比星、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶摩尔比为1：4：3：0.3。用3.5kda的透析袋透析2~3天，冷冻干燥，得到两亲性嵌段共聚物；

(5)将步骤(4)所得的两亲性嵌段共聚物溶于二甲基亚砜中，在超声条件下逐滴滴入去离子水中，透析2~3天后，即得聚乙二醇修饰的具有ph响应性的高载药量纳米胶束或囊泡。

本发明中，步骤(1)中所述聚乙二醇单甲醚的数均分子量范围为550~5000。

本发明中，步骤(1)和(2)中所述沉淀剂a均为甲醇、乙醚、正己烷或石油醚中任一种。

本发明中，步骤(2)中所述溶剂b为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺中任一种。

本发明的有益效果在于：制备两亲性嵌段共聚物的过程中接入顺式乌头酸酐，可有效提高化疗药物在肿瘤细胞内的释放；而抗癌药物与聚合物化学键接有效地提高了纳米胶束的载药量，提高了肿瘤治疗的效率，及对化疗组织的选择性。

附图说明

图1：为实施例1制备的聚乙二醇-多柔比星两亲性嵌段共聚物的结构式与¹hnmr谱图；

图2：为实施例2制备的聚乙二醇修饰的具有ph响应性的高载药量纳米囊泡的tem照片。

图3：为实施例3制备的聚乙二醇修饰的具有ph响应性的高载药量纳米胶束的tem照片。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1：

取分子量为750的聚乙二醇单甲醚0.75g、丁二酸酐0.12g溶解在30ml四氢呋喃中，75℃回流12小时，乙醚沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥至恒重，得到端羧基修饰的聚乙二醇；取季戊四醇34.0mg、4-二甲氨基吡啶0.13g和二环己基碳二亚胺0.61g溶于10ml二氯甲烷中配成季戊四醇溶液，将端羧基修饰的聚乙二醇0.75g溶于10ml二氯甲烷中，以极缓慢的速度滴加到季戊四醇溶液中，充分搅拌2天，乙醚沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥恒重，得到三羟基修饰的聚乙二醇；取盐酸多柔比星50mg溶于10ml去离子水中配成水溶液，顺式乌头酸酐50mg溶于10ml二氧六环中，并逐滴滴加到多柔比星水溶液中，期间以0.5m的氢氧化钠溶液调节体系ph在8.5左右，反应24小时，1mol/l盐酸酸化至有沉淀，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，真空干燥得到端羧酸修饰的多柔比星；取端羧酸修饰的多柔比星70.0mg、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐57.4mg和4-二甲氨基吡啶12.2mg溶于10ml无水二甲基亚砜中，搅拌形成多柔比星溶液。三羟基的聚乙二醇32.9mg溶于5ml无水二甲基亚砜，逐滴滴入多柔比星溶液中，避光反应24小时后，用3.5kda的透析袋透析3天，冷冻干燥，得到两亲性的聚乙二醇-多柔比星两亲性嵌段共聚物；取聚乙二醇-多柔比星嵌段共聚物5mg溶于1ml二甲基亚砜中，超声条件下滴加进5ml的去离子水中，透析3天后即得到具有ph响应性的高载药量纳米囊泡。

经透射电镜观察，制得的具有ph响应性的高载药量纳米囊泡大小均一，分散均匀。

实施例2：

取分子量为1000的聚乙二醇单甲醚1.0g、丁二酸酐0.16g溶解在30ml四氢呋喃中，75℃回流12小时，甲醇沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥至恒重，得到端羧基修饰的聚乙二醇；取季戊四醇34.0mg、4-二甲氨基吡啶0.13g和二环己基碳二亚胺0.61g溶于10ml三氯甲烷中配成季戊四醇溶液，将端羧基修饰的聚乙二醇1.0g溶于10ml三氯甲烷中，以极缓慢的速度滴加到季戊四醇溶液中，充分搅拌2天，乙醚沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥恒重，得到三羟基修饰的聚乙二醇；取盐酸多柔比星50.0mg溶于10ml去离子水中配成水溶液，顺式乌头酸酐50.0mg溶于10ml二氧六环中，并逐滴滴加到多柔比星水溶液中，期间以0.5m的氢氧化钠溶液调节体系ph在8.5左右，反应24小时，1mol/l盐酸酸化至有沉淀，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，真空干燥得到端羧酸修饰的多柔比星；取端羧酸修饰的多柔比星70.0mg、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐57.4mg和4-二甲氨基吡啶12.2mg溶于10ml无水二甲基亚砜中，搅拌形成多柔比星溶液。三羟基的聚乙二醇32.9mg溶于5ml无水二甲基亚砜，逐滴滴入多柔比星溶液中，避光反应24小时后，用3.5kda的透析袋透析3天，冷冻干燥，得到两亲性的聚乙二醇-多柔比星两亲性嵌段共聚物；取聚乙二醇-多柔比星嵌段共聚物5.0mg溶于1ml二甲基亚砜中，超声条件下滴加进5ml的去离子水中，透析3天后即得到具有ph响应性的高载药量纳米囊泡。

经透射电镜观察，制得的具有ph响应性的高载药量纳米囊泡大小均一，分散均匀。

实施例3：

取分子量为2000的聚乙二醇单甲醚2.0g、丁二酸酐0.16g溶解在30ml四氢呋喃中，75℃回流12小时，正己烷沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥至恒重，得到端羧基修饰的聚乙二醇；取季戊四醇34.0mg、4-二甲氨基吡啶0.13g和二环己基碳二亚胺0.61g溶于10ml二甲基甲酰胺中配成季戊四醇溶液，将端羧基修饰的聚乙二醇0.75g溶于10ml二甲基甲酰胺中，以极缓慢的速度滴加到季戊四醇溶液中，充分搅拌2天，正己烷沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥恒重，得到三羟基修饰的聚乙二醇；取盐酸多柔比星50.0mg溶于10ml去离子水中配成水溶液，顺式乌头酸酐50.0mg溶于10ml二氧六环中，并逐滴滴加到多柔比星水溶液中，期间以0.5m的氢氧化钠溶液调节体系ph在8.5左右，反应24小时，1mol/l盐酸酸化至有沉淀，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，真空干燥得到端羧酸修饰的多柔比星；取端羧酸修饰的多柔比星70.0mg、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐57.4mg和4-二甲氨基吡啶12.2mg溶于10ml无水二甲基亚砜中，搅拌形成多柔比星溶液。三羟基的聚乙二醇32.9mg溶于5ml无水二甲基亚砜，逐滴滴入多柔比星溶液中，避光反应24小时后，用3.5kda的透析袋透析3天，冷冻干燥，得到两亲性的聚乙二醇-多柔比星两亲性嵌段共聚物；取聚乙二醇-多柔比星嵌段共聚物5.0mg溶于1ml二甲基亚砜中，超声条件下滴加进5ml的去离子水中，透析3天后即得到具有ph响应性的高载药量纳米胶束。

经透射电镜观察，制得的具有ph响应性的高载药量纳米胶束大小均一，分散均匀。

实施例4：

取分子量为3000的聚乙二醇单甲醚3.0g、丁二酸酐0.18g溶解在30ml四氢呋喃中，75℃回流12小时，石油醚沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥至恒重，得到端羧基修饰的聚乙二醇；取季戊四醇34.0mg、4-二甲氨基吡啶0.13g和二环己基碳二亚胺0.61g溶于10ml二氯甲烷中配成季戊四醇溶液，将端羧基修饰的聚乙二醇0.75g溶于10ml二氯甲烷中，以极缓慢的速度滴加到季戊四醇溶液中，充分搅拌2天，石油醚沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥恒重，得到三羟基修饰的聚乙二醇；取盐酸多柔比星50.0mg溶于10ml去离子水中配成水溶液，顺式乌头酸酐50.0mg溶于10ml二氧六环中，并逐滴滴加到多柔比星水溶液中，期间以0.5m的氢氧化钠溶液调节体系ph在8.5左右，反应24小时，1mol/l盐酸酸化至有沉淀，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，真空干燥得到端羧酸修饰的多柔比星；取端羧酸修饰的多柔比星70.0mg、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐57.4mg和4-二甲氨基吡啶12.2mg溶于10ml无水二甲基亚砜中，搅拌形成多柔比星溶液。三羟基的聚乙二醇32.9mg溶于5ml无水二甲基亚砜，逐滴滴入多柔比星溶液中，避光反应24小时后，用3.5kda的透析袋透析3天，冷冻干燥，得到两亲性的聚乙二醇-多柔比星两亲性嵌段共聚物；取聚乙二醇-多柔比星嵌段共聚物5.0mg溶于1ml二甲基亚砜中，超声条件下滴加进5ml的去离子水中，透析3天后即得到具有ph响应性的高载药量纳米胶束。

经透射电镜观察，制得的具有ph响应性的高载药量纳米胶束大小均一，分散均匀。

实施例5：

取分子量为5000的聚乙二醇单甲醚5.0g、丁二酸酐0.2g溶解在30ml四氢呋喃中，75℃回流12小时，正己烷沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥至恒重，得到端羧基修饰的聚乙二醇；取季戊四醇34.0mg、4-二甲氨基吡啶0.13g和二环己基碳二亚胺0.61g溶于10ml二甲基甲酰胺中配成季戊四醇溶液，将端羧基修饰的聚乙二醇0.75g溶于10ml二甲基甲酰胺中，以极缓慢的速度滴加到季戊四醇溶液中，充分搅拌2天，正己烷沉淀3次，过滤，滤饼真空干燥恒重，得到三羟基修饰的聚乙二醇；取盐酸多柔比星50.0mg溶于10ml去离子水中配成水溶液，顺式乌头酸酐50.0mg溶于10ml二氧六环中，并逐滴滴加到多柔比星水溶液中，期间以0.5m的氢氧化钠溶液调节体系ph在8.5左右，反应24小时，1mol/l盐酸酸化至有沉淀，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，真空干燥得到端羧酸修饰的多柔比星；取端羧酸修饰的多柔比星70.0mg、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐57.4mg和4-二甲氨基吡啶12.2mg溶于10ml无水二甲基亚砜中，搅拌形成多柔比星溶液。三羟基的聚乙二醇32.9mg溶于5ml无水二甲基亚砜，逐滴滴入多柔比星溶液中，避光反应24小时后，用3.5kda的透析袋透析3天，冷冻干燥，得到两亲性的聚乙二醇-多柔比星两亲性嵌段共聚物；取聚乙二醇-多柔比星嵌段共聚物5.0mg溶于1ml二甲基亚砜中，超声条件下滴加进5ml的去离子水中，透析3天后即得到具有ph响应性的高载药量纳米胶束。

经透射电镜观察，制得的具有ph响应性的高载药量纳米胶束大小均一，分散均匀。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。