止血可流动物的制作方法

本发明涉及止血组合物领域、作为止血剂的特定化合物或组合物的用途、制备止血组合物的方法以及止血方法。

背景技术：

无论是外伤还是内伤、创伤或手术都会导致出血。这种出血可能或多或少都很重要。通过一组称为“止血”的生理现象来防止和停止出血。止血有助于修复血管破裂，并且通常确保维持血管和组织完整性。

当血管受伤时，触发包括各种阶段的自然机制以阻止血液流动。首先，减缓出血的血管收缩持续15至60秒，并诱导复杂的级联反应。在血小板栓塞周围形成由纤维蛋白组成的纤维网：形成最终的血栓，并且通过因子xiii保护其免于过早溶解，因子xiii稳定纤维蛋白。最后，纤维蛋白网更紧密(收缩)并且伤口的边缘聚集在一起：伤口收缩。在稳定的交联纤维蛋白内，成纤维细胞然后可以生长并组织成血栓内的结合基质并最终闭合伤口。

循环血液中不存在固体纤维蛋白；如果存在则其会立即阻碍重要的血管。然而，存在纤维蛋白的前体纤维蛋白原。在凝血酶(其合成被凝血因子激活)的作用下，纤维蛋白原被转化为不溶性纤维蛋白。

最后，在伤口成功愈合后数天或数周，纤维蛋白簇在纤维蛋白溶解期间被破坏。

尽管存在这种生化现象，但特别是在伤口太大的情况下或者在弥漫性出血的情况下，通常需要“人工地”进行止血。

存在“机械”解决方案以帮助获得止血，比如压力、结扎和电凝，它们用作一线治疗。然而，这些解决方案在某些许多情况下几乎没有或没有效果，比如渗出毛细血管出血、血管形成的器官比如脾脏或肝脏的出血、导致弥漫性出血的出血，例如骨骼，和/或神经外科手术。

还存在“化学”解决方案，特别是在某些当前止血产品中实施的。所述化学解决方案的组分通常是“吸收性”或“活性”类型的。

吸收性止血产品，特别是包含多糖比如再生氧化纤维素或藻酸盐，主要通过机械作用和简单吸收起作用。它们经常出现过度溶胀的问题。如果所述溶胀导致液体特别是血液的快速吸收，则当在“封闭”环境中使用例如与硬脑膜接触或在泌尿科中时，它也会导致不希望的压力。

此外，某些产品，特别是包含植物多糖比如纤维素或藻酸盐的产品，可在其再吸收过程中进一步引起炎症反应和/或可导致宿主不能识别的降解产物。其结果是希望除去这些产物，使它们不会留在体内，从而不会产生这些不利影响。

活性止血产品，比如含有凝血酶或纤维蛋白的产品，通常是血液衍生产品。这些产品涉及过敏和疾病传播的风险，特别是在疾病载体不会通过经典应用的治疗失活的情况下。此外，所述下游治疗通常是复杂的和/或昂贵的。最后，一般来说，它们可能需要在使用前进行准备，这在紧急情况下可能是一种约束，实际上是一种麻烦。

此外，含有纤维蛋白和凝血酶的产品基于它们对包括产品的两种血液衍生产品之间的相互作用的作用模式。偶尔可以在不与血液相互作用的情况下进行反应，在这种情况下，产品被认为是漂浮的。换句话说，产品被继续流动的血液推开，可能导致产品变稀或凝结并在血液顶部形成凝胶，这是血液流动未被阻塞的情况。因此不能实现止血。

止血粉末及其制备方法和使用方法已在2012年11月1日公布的参考文献wo2012/146655的国际申请中公开，其内容通过引用整体并入本申请中。

这种止血粉末具有令人满意的吸收能力、良好的止血能力、几乎没有不利影响、良好的锚定在伤口边缘的能力以及在使用它和/或有限溶胀的血流中的令人满意的渗透。

除了这些良好的止血性能之外，这种止血粉末还表现出的优点是具有非常好的流动性，这使其能够喷洒在出血区域上。它可以在大多数外科手术中施用，比如剖腹手术、腹腔镜检查、体腔镜检查(coelioscopy)以及机器人手术技术。

止血粉末可以直接应用于出血区域而无需外科医生的特殊准备，这是另一个优点。

有时可能需要使用特定的粉末分配器以使止血粉末在非常特定的出血区域上的应用变得容易。

技术实现要素：

本发明的目的是提出一种易于使用的止血产品，特别是不需要复杂的制备过程，其可以进一步容易地应用于特定区域以覆盖整个感兴趣的出血区域。

本发明的另一个目的是提出一种止血产品，与现有的止血产品相比，该止血产品具有良好的止血功效和增强的功效。

本发明的另一个目的是提出一种用于制备可立即使用而无需大量制备的止血产品的试剂盒，其中对止血产品的处理最少，并且可以例如用于若干种外科手术中。

为此，我们提出了一种用于制备如所附权利要求中限定的止血可流动物的试剂盒和方法。

更具体地，我们提出了一种制备止血可流动物的试剂盒，包括：

-止血粉末，其具有的组合物包括：

o原纤维型的非交联胶原，其包含的纤维胶原和/或原纤维胶原的含量相对于胶原的总重量为至少70重量％；

o至少一种单糖；和

o至少一种糖胺聚糖；

-盐水溶液，其与止血粉末混合，以形成止血可流动物。

优选地，用于止血粉末组合物的胶原不是交联的。在组合物中使用非交联胶原尤其旨在简化制造过程。

在另一优选的方面，盐水溶液是纯的，仅包括蒸馏水和氯化钠的混合物，这意味着溶液中不存在添加剂组分。

这种试剂盒的优选但非限制性的方面，单独地或组合地使用，如下：

-在所述止血粉末的组合物中：

o所述胶原的量相对于止血粉末的组合物的总重量为80至90重量％；

o所述至少一种单糖的量相对于止血粉末的组合物的总重量为1至12.5重量％；以及

o所述至少一种糖胺聚糖的量相对于止血粉末的组合物的总重量为2至25重量％。

-在所述止血粉末的组合物中：

o所述胶原的量相对于止血粉末的组合物的总重量为80至90重量％；

o所述至少一种单糖的量相对于止血粉末的组合物的总重量为2.5至7.5重量％；以及

o所述至少一种糖胺聚糖的量相对于止血粉末的组合物的总重量为5至12.5重量％。

-在所述止血粉末的组合物中：

o所述胶原的量相对于止血粉末的组合物的总重量为84至88重量％；

o所述至少一种单糖的量相对于止血粉末的组合物的总重量为4至6重量％；以及

o所述至少一种糖胺聚糖的量相对于止血粉末的组合物的总重量为8至10重量％。

-在所述止血粉末的组合物中，所述至少一种单糖是葡萄糖，并且所述至少一种糖胺聚糖是硫酸软骨素。

-在所述止血粉末的组合物中，所述至少一种糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物。

-所述止血粉末的组合物还包含至少一种凝血因子，其的量相对于止血粉末的组合物的总重量低于0.1重量％。

-所述凝血因子是凝血酶。

-所述盐水溶液包含或包括蒸馏水和氯化钠，其中，所述氯化钠的量相对于盐水溶液的总重量为0.5至1.5重量％，最优选的量相对于盐水溶液的总重量为0.9重量％。

-所述试剂盒包含1g至2g的止血粉末和4ml至10ml的盐水溶液。

-所述盐水溶液的质量为所述止血粉末的质量的2至10倍，优选为止血粉末的质量的4至5倍。

-所述止血粉末封闭在分配器中，所述分配器具有形成有波纹管的容器部分和布置在所述容器部分上的喷嘴部分，其中，所述喷嘴部分具有用于采用盐水溶液填充容器部分的开口，以与止血粉末混合从而形成止血可流动物。

-所述容器部分具有的形状设计成促使止血粉末与盐水溶液水合从而形成止血可流动物。

-所述分配器还包括盖，其设计成可拆卸地联接到所述喷嘴部分，以便闭合进出所述容器部分的任何开口。

我们还提出了一种用于采用上述试剂盒制备止血可流动物的方法，包括以下步骤：

a.在容器中提供止血粉末；

b.在封闭止血粉末的容器中加入一定量的盐水溶液，闭合并摇动所述容器，以促进止血粉末的水合，从而形成止血可流动物。

这种方法的优选但非限制性方面，单独地或组合地使用，如下：

-该方法包括随后的步骤c)，其中，封闭止血可流动物的容器在某个搁置时间段保持直立。

-在步骤b)中，加入容器中的盐水溶液的量为试剂盒的盐水溶液的量的50至100％。

-在步骤b)中，加入容器中的盐水溶液的量为5至10ml，优选为7ml。

-在步骤b)中，摇动容器10至30秒，优选20秒。

-在步骤c)中，所述搁置时间段为至少30秒，优选至少60秒，甚至更优选至少90秒。

-在步骤c)中，所述搁置时间段为30至120秒，优选90秒。

附图说明

本发明的其他特征和优点将从以下描述中变得清楚，该描述仅出于说明性目的给出，绝不是限制性的，并且应该参考附图阅读，其中：

-图1是用于施加本文提出的止血可流动物的分配器的图示；

-图2是图1的分配器的图示，其中盖是打开的；

-图3是图1的分配器的盖的示意性侧视图；

-图4是图1的分配器的喷嘴部分的示意性侧视图；

-图5是图1的分配器的容器部分的横截面；

-图6是如示例10中所述的电泳结果的示例。

具体实施方式

在以下描述中，没有相反的陈述，相对于止血粉末组合物的总干重给出重量百分比。

在本发明的上下文中，“止血粉末组合物的总干重”是指不含溶剂特别是水的止血粉末组合物的总重量，因此是相对于无水产品的总重量。

此外，组分的重量和所得百分比可以对应于这些组分的无水重量，换言之，对应于不包括其可能含有的水的组分的重量。这也可以应用于获得的百分比。

止血粉末组合物可包含的胶原含量相对于止血粉末组合物的总重量大于或等于70重量％，特别是大于或等于75重量％，特别是大于或等于77重量％，实际上大于或等于80重量％。

此外，止血粉末组合物可包含的胶原含量相对于止血粉末组合物的总重量小于或等于99重量％，特别是小于或等于96重量％，特别是小于或等于93重量％，实际上小于或等于90重量％。

因此，止血粉末组合物可包含的胶原含量相对于止血粉末组合物的总重量为70至99重量％，特别是75至96重量％，特别是77至93重量％，实际上为80至90重量％。优选地，胶原含量为止血粉末组合物总重量的约86重量％。

胶原是哺乳动物的主要结构蛋白。胶原由原胶原(tc)分子构成，其长度约为280-300nm，直径约为1.5nm。

术语“纤维胶原”是指纤维形式的胶原，对应于原纤维的组合。纤维通常具有1μm至10μm的直径。术语“原纤维胶原”是指原纤维形式的胶原。更确切地说，原纤维通常具有10nm至1μm的直径。因此，原纤维由交替排列的原胶原分子形成，并且这些原纤维可以布置为形成胶原纤维。纤维和/或原纤维胶原通常是不可溶的，而非原纤维胶原是高度可溶的。

纤维胶原和原纤维胶原的定义特别可以是由markusbuehler在“naturedesignstoughcollagen:explainingthenanostructureofcollagenfibrils,”inpnas,august15,2006,vol.103,no.33,pp.12285-12290中给出的定义。

已发现超过28种不同的胶原，并分为3大类：原纤维型胶原、非原纤维型胶原和facit胶原。

原纤维型胶原是主要包含原纤维和/或纤维胶原且几乎不包含任何非原纤维胶原(例如i型胶原)的胶原。类似地，非原纤维型胶原是主要包含非原纤维胶原的胶原。非原纤维类型的一些胶原可仅包括非原纤维胶原(例如iv型或v型胶原)。

胶原的工业提取和纯化通常在于初始组织的破坏，以1)除去每种或大部分污染蛋白，和2)根据产品的最终用途获得所需的结构化水平。胶原提取通常在酸性或碱性条件下进行，该条件允许溶解非原纤维的单分子可溶性胶原。最终的胶原天然含有原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原的混合物。原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原之间的比例取决于为提取和提取过程选择的组织。

最终产品不同于通过仅原纤维胶原和仅非原纤维胶原的人工混合物获得的胶原。在题为“extractionofcollagenfromconnectivetissuebyneutralsaltsolutions”(proceedingsofthenationalacademyofsciencesvolume41numberijanuary15,1955bygross,johnh.highbergerandfranciso.schmitt)的文章中，示出了在特定的提取过程之后获得的原纤维和非原纤维胶原之间的差异，如前所述，这导致这两种胶原的混合物。

在本发明的止血粉末中，胶原是原纤维型的，并且包含的纤维和/或原纤维胶原的量相对于胶原的总重量为至少60重量％，特别是至少70重量％，特别是至少75重量％，实际上至少80重量％。

更特别地，胶原包含的纤维和/或原纤维胶原的重量相对于止血粉末组合物中的胶原的总重量为至少85％，特别是至少90％，特别是至少95％，实际上至少98％。

优选地，组合物包含的纤维和/或原纤维胶原的含量相对于组合物中的胶原的总重量为85至95重量％，最优选为85至90重量％。

这意味着在优选实施例中，止血粉末的组合物因此包含的非原纤维胶原的含量相对于组合物中的胶原的总重量为5至15重量％，最优选为10至15重量％。

具有相对于非原纤维胶原的这种比例的纤维和/或原纤维胶原的组合物是非常有利的，特别是用作止血粉末制剂。实际上，纤维和/或原纤维胶原应以足够的量存在以进行止血，并且非原纤维胶原也应该具有足够的量用于产品的内聚力而不是太大量以避免过度溶胀。

胶原可选自i型胶原或i型和iii型胶原。胶原可以从所有物种特别是猪、牛或马物种的各种来源组织特别是皮肤和/或肌腱中提取。

胶原大多数可以由从皮肤和/或肌腱中提取的猪源纤维胶原制成。在从肌腱中提取的胶原的情况下，提取可以如在国际申请wo2010/125086中所述。

上述胶原，特别是纤维和/或原纤维胶原，可以来自酸性或碱性提取。根据一特别实施例，所述胶原来自碱性提取。根据一特别实施例，胶原可以如在专利申请fr2944706中所述。

优选地，胶原来自碱性提取，其能够使提取的胶原中的纤维和/或原纤维胶原的含量最大化。此外，可以优化这种碱性提取，以控制提取的胶原中的原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原的比例。与酸性提取不同，碱性提取允许蛋白多糖的水解。这种作用导致组织的破坏和纤维的分离而不改变它们的形状。在酸性条件下，纤维中内胶原分子的溶胀导致它们在该过程中的部分破坏，释放出更大量的非原纤维可溶性胶原。

胶原可以在提取后原样使用，即无需进一步处理，或者可以交联，特别是通过经典的交联方式，比如热脱水、使用桥联剂，例如甲醛和/或戊二醛；通过氧化多糖，例如根据在国际申请wo2010/125086中描述的方法；和/或通过氧化支链淀粉或糖原。然而，交联胶原不是优选的，因为它使制造过程复杂化，而不一定增加止血效力。

优选地，组合物中使用的胶原因此不经历任何进一步处理，特别是它不是交联的。使用非交联胶原尤其具有简化制造过程的优点。

止血粉末的组合物包含至少一种单糖，单独地或与其他单糖混合。所述单糖可选自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物。存在于本发明组合物中的单糖(单独地或与单糖混合)特别是葡萄糖。

止血粉末的组合物可包含的单糖含量相对于组合物的总重量为1至12.5重量％，特别是1.5至10重量％，特别是2至8重量％，特别是2.5至7.5重量％。最优选地，单糖含量相对于组合物的总重量为约5重量％。

止血粉末的组合物可包含的胶原/单糖重量比为5至100，特别是7至65，更特别是10至50，还更特别是11至40。最优选地，该组合物包含的胶原/单糖重量比为约19。

单糖，特别是核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物，且特别是葡萄糖，可以特别地使得可以获得主要包含纤维和/或原纤维胶原和单糖的颗粒，所述颗粒具有所需的特征，特别是尺寸和密度。在胶原混合物中加入单糖还可以减少组合物中的电荷，这使得能够形成适于放置在容器内的粉末，比如管、鼓风机、喷雾器或施用分配器。

特别地，单糖的存在可以使得获得所需密度和/或尺寸的颗粒更容易和/或更便宜，特别是在改善组合物粉末的止血性能方面。

在没有任何添加剂的情况下研磨胶原纤维会导致纤维尺寸减小并降低粉末密度。此外，最终制剂含有大量电荷，这会阻止最终产品的操作。在研磨胶原之前添加单糖导致制剂硬化以进行混合，从而允许快速研磨(限制变性)，因此能够制备具有降低的电荷的粉末(适于将粉末放入容器，比如分配器)和适于施用和重构组合物的最终密度。

与预期的不同，单糖的这种结合对产品的最终活性没有影响。特别是，它不会改变最终产品的生物活性。单糖没有止血作用。

此外，单糖的这种结合不会使其表现为发泡剂，如wo01/97873中的情况。在wo01/97873中，稀释溶液的加热导致明胶的形成。可以制备高浓度的明胶以获得非常浓缩的溶液，但最终产品含有明胶而不是胶原。已知明胶比胶原更少止血，因为血小板聚集需要胶原原纤维的存在和明胶中不存在的天然胶原的结构。

根据一实施例，所述组合物包括优选包含颗粒，颗粒包括优选包含胶原和单糖，其特别选自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物，特别是葡萄糖。

该组合物可包含至少一种凝血因子。所述凝血因子是本领域技术人员所熟知的。优选地，凝血因子之一是凝血酶。甚至更优选地，止血粉末的组合物仅包含凝血酶作为凝血因子。

所述凝血因子，特别是凝血酶，可以来自动物来源(从动物组织和液体中提取)或来自重组来源(由遗传修饰细胞的培养物产生)。凝血因子可以是例如从人体组织和液体中提取的凝血酶。

当存在凝血因子特别是凝血酶时，其含量相对于止血粉末组合物的总重量优选为小于0.1重量％。

在凝血酶的情况下，通常使用国际单位(iu)。因此，组合物可以包含的凝血酶含量为0.01iu/mg至20iu/mg组合物，特别是0.05iu/mg至10iu/mg，特别是0.1iu/mg至5iu/mg，实际上为0.2iu/mg至2iu/mg。最优选地，凝血酶的含量(如果有的话)为约0.83iu/mg组合物。

除了单糖之外，组合物还可包含至少一种其他碳水化合物，其可以是糖胺聚糖。这种碳水化合物可以是组合物的一部分，有或没有凝血因子比如凝血酶。

所述糖胺聚糖可选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物，特别是硫酸软骨素。

糖胺聚糖可以提高止血组合物吸收血液的速度。更特别地，糖胺聚糖可以加速血液和止血产品特别是胶原和凝血酶之间的接触。

该组合物可包含的糖胺聚糖含量相对于组合物的总重量为2至25重量％，特别是3至20重量％，特别是4至15重量％，特别是5至12.5重量％。最优选地，糖胺聚糖(如果有的话)的含量为组合物总重量的约9重量％。

该组合物可包含的胶原/糖胺聚糖重量比为2.5至50，特别是3.5至35，更特别是5至25，还更特别是6.5至20。

根据一实施例，所述组合物包含至少一种特别是一种单糖和至少一种特别是一种糖胺聚糖，特别是如上所定义的糖胺聚糖，特别是以上面定义的量。

碳水化合物非常特别地是单糖和糖胺聚糖。

该组合物可包含的碳水化合物含量相对于组合物的总重量为2至25重量％，特别是5至23重量％，特别是7至21重量％，特别是10至18重量％。

该组合物可包含的胶原/碳水化合物重量比为2至40，特别是2.5至30，更特别是3至20，还更特别是3.5至15。

表述“碳水化合物的总重量”是指上面定义的单糖的重量和上述其他碳水化合物的重量之和。

根据一实施例，该组合物包含，优选地包括：

-主要包含相对于胶原的总重量为至少50重量％的纤维和/或原纤维胶原含量的胶原，和

-至少一种特别是一种单糖。

特别地，该组合物包含，优选地包括：

-胶原，特别是其的量相对于组合物的总重量为70至99重量％，特别是75至96重量％，特别是77至93重量％，实际上为80至90重量％，其中所述胶原包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50重量％，和

-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其的量相对于组合物的总重量为1至12.5重量％，特别是1.5至10重量％，特别是2至8重量％，特别是2.5至7.5重量％。

根据另一实施例，该组合物包含，优选地包括：

-主要包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50重量％的胶原，

-至少一种特别是一种单糖，

-至少一种特别是一种凝血因子。

特别地，该组合物包含，优选地包括：

-胶原，特别是其的量相对于组合物的总重量为70至99重量％，特别是75至96重量％，特别是77至93重量％，实际上为80至90重量％，其中所述胶原含量包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50重量％，

-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其的量相对于组合物的总重量为1至12.5重量％，特别是1.5至10重量％，特别是2至8重量％，特别是2.5至7.5重量％，和

-至少一种特别是一种凝血因子，特别是凝血酶，其的量为0.01iu/mg至20iu/mg组合物，特别是0.05iu/mg至10iu/mg，特别是0.1iu/mg至5iu/mg，实际上为0.2iu/mg至2iu/mg。

根据另一实施例，该组合物包含，优选地包括：

-主要包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50重量％的胶原，

-至少一种特别是一种单糖，和

-至少一种特别是一种糖胺聚糖。

特别地，该组合物包含，优选地包括：

-胶原，特别是其的量相对于组合物的总重量为70至99重量％，特别是75至96重量％，特别是77至93重量％，实际上为80至90重量％，其中所述胶原含量包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50重量％，

-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其的量相对于组合物的总重量为1至10重量％，特别是1至12.5重量％，特别是1.5至10重量％，特别是2至8重量％，特别是2.5至7.5重量％，和

-至少一种糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素，其的量相对于组合物的总重量为2至25重量％，特别是3至20重量％，特别是4至15重量％，特别是5至12.5重量％。

根据另一实施例，该组合物包含，优选地包括：

-包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50重量％的胶原，

-至少一种特别是一种单糖，

-至少一种特别是一种凝血因子，和

-至少一种特别是一种糖胺聚糖。

特别地，该组合物包含，优选地包括：

-胶原，特别是其的量相对于组合物的总重量特别是干重为70至99重量％，特别是75至96重量％，特别是77至93重量％，实际上为80至90重量％，其中所述胶原包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50重量％，

-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其的量相对于组合物的总重量为1至10重量％，特别是1至12.5重量％，特别是1.5至10重量％，特别是2至8重量％，特别是2.5至7.5重量％，

-至少一种凝血因子，特别是凝血酶，其的量为0.01iu/mg至20iu/mg组合物，特别是0.05iu/mg至10iu/mg，特别是0.1iu/mg至5iu/mg，实际上为0.2iu/mg至2iu/mg，和

-至少一种糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素，其的量相对于组合物的总重量为2至25重量％，特别是3至20重量％，特别是4至15重量％，特别是5至12.5重量％。

根据非常特别的实施例，该组合物包含，优选地包括：

-原纤维型胶原，主要包含纤维和/或原纤维胶原，所述原纤维型胶原例如通过在碱性介质中提取而获得，并且其的量相对于组合物的总重量为约85重量％，

-葡萄糖，其的量相对于组合物的总重量为约4.9重量％，

-凝血酶，其的量为0.2iu/mg至2iu/mg组合物，和

-硫酸软骨素，其的量相对于组合物的总重量为约10重量％。

根据另一特别实施例，该组合物包含，优选地包括：

-原纤维型胶原，主要包含纤维和/或原纤维胶原，所述原纤维型胶原例如通过在碱性介质中提取而获得，并且其的量相对于组合物的总重量为约85重量％，

-葡萄糖，其的量相对于组合物的总重量为约5重量％，和

-硫酸软骨素，其的量相对于组合物的总重量为约10重量％。

在本发明的上下文中，表述“约x％的量”是指±20％的变化，换句话说，约10％的量表示8至12％，特别是±10％的变化，实际上是±5％。

当加入粉末形式的凝结因子，特别是凝血酶时，凝结因子的这种粉末优选与已经制备的胶原/单糖的均匀分子混合物的粉末混合。

当加入糖胺聚糖(例如硫酸软骨素)和凝血因子(例如凝血酶)时，优选首先将它们混合在一起，并将该混合物加入到先前的胶原/单糖混合物(已经研磨成粉末)中。

凝血酶不受碳水化合物或胶原稳定化。凝血酶从不与单糖溶液接触(与wo98/57678相反)，其防止蛋白质的任何变性和粉末的再水合，这会导致无法再适当地将粉末干燥。

粉末形式的组合物特别可以包含或包括：

-包含或包括原纤维型胶原和至少一种单糖特别是葡萄糖的颗粒，其中特别是所述颗粒具有如本说明书中所定义的尺寸、粒度和/或密度，和

-任选地，包含或包括至少一种糖胺聚糖特别是硫酸软骨素和/或至少一种凝血因子特别是凝血酶的颗粒，其中特别是所述颗粒具有如本说明书中所定义的尺寸、粒度和/或密度。

止血粉末的组合物有利地包含至少50重量％的尺寸在200μm和400μm之间的颗粒。

构成止血粉末的颗粒有利地具有的平均粒度为10μm至500μm，特别是50μm至400μm。

有利地，构成所述止血粉末的颗粒的至少90重量％特别是100重量％可以通过网眼为500μm特别是400μm的筛网。

构成所述止血粉末的颗粒的至少90重量％特别是至少95重量％可以通过筛网保持，筛网的网眼为10μm，特别是20μm，实际上为30μm，实际上为50μm。

选择该重新分配以使粉末水合。由于颗粒尺寸太小，粉末不会形成与所需规格和方面一致的水合基质。

粉末形式的止血组合物特别包含：

-包含胶原和单糖的颗粒，和

-任选地，至少糖胺聚糖和/或凝血因子，比如凝血酶。

止血粉末的组合物可包含：

-包含胶原、单糖和任选的至少一种糖胺聚糖和/或凝血因子的颗粒，

-包含胶原、单糖和任选的凝血因子的颗粒和任选的糖胺聚糖颗粒，

-包含胶原和单糖的颗粒和包含至少一种糖胺聚糖和/或凝血因子的颗粒。

在本发明的上下文中，表述“干燥粉末”是指组合物包含有限含量的溶剂，特别是水。所述有限含量相对于组合物的总重量可以为小于5重量％，特别是小于3重量％，特别是小于1重量％。

所述干燥形式可通过简单蒸发所用溶剂、通过有机溶剂脱水获得。

如上所述，所描述的止血粉末由非交联胶原形成，因为它在制造过程方面更简单，并且已经证明即使粉末的胶原没有交联，也具有良好的止血效果。

本发明人惊奇地发现，尽管胶原没有交联，但是将上述特定止血粉末与盐水溶液混合使得能够形成具有粘度的止血产品，允许其直接施用于出血区域以促进止血。

这确实不是预期的，因为相反已知的是从胶原基粉末和盐水溶液的混合物制备止血胶原糊状物需要使用交联胶原来起作用并且是稳定的。这已在1990年1月2日以参考文献us4891359公布的美国专利中特别公开。已知交联通过向相应的分子结构添加化学键来赋予分子稳定性，分子通常需要那些额外的化学键，使其成为含水形式。

因此，根据优选实施例，如上所述的干燥止血粉末，其中胶原没有交联，因此用盐水溶液水合以形成止血可流动物，其将施用于出血区域。

如本文所用的术语“可流动物”适用于其稠度使得组合物能够在没有施加任何应力的情况下维持某种形状的组合物，而如果在组合物上施加应力比如压力则可变形。

可流动物不是液体，也不是海绵，也不是粉末，而是一种具有一定粘度的糊状物、凝胶或基质。优选地，可流动物的粘度在20pa.s和10000pa.s之间(对应于0.0001(pa.s)^-1和0.05(pa.s)^-1之间的流动性范围)。

可流动物是指例如能够通过注射器和/或套管的组合物。

在本说明书中，我们无差别地提及止血可流动物、可流动止血剂和止血基质以指定相同的特定组合物。

因此，进行止血粉末和盐水溶液的混合，以制备如上所述的止血可流动物。

盐水溶液优选是手术室中使用的标准无菌盐水溶液。

它优选包括的蒸馏水所具有的氯化钠的量为0.5-1.5％，优选为约0.9％。

盐水溶液优选是纯的，这意味着它包括氯化钠在蒸馏水中的混合物，而不添加任何其他组分。

盐水溶液可以以不同的形式储存，比如在大容器中散装，或在确定体积的特定容器中储存，比如预填充的注射器。

优选地，盐水溶液是用于产生止血可流动物的试剂盒的一部分，这样的试剂盒还包含容器中的特定量的止血粉末。

优选地，试剂盒的止血粉末储存在如图1和2所示的特定分配器中。

在制备止血可流动物之前，所有活性组分因此以粉末形式一起包含在分配器内。这对于几个方面非常有利。它首先使产品的储存变得容易，因为必须特别注意具有止血粉末的容器，而不是真正的盐水溶液，这是常用的产品。这在制造方面也是非常有利的，因为在储存之前仅必须对止血粉末进行灭菌，例如，如果一些组分首先与盐水溶液(例如凝血酶)混合且然后混合到止血粉末中则不是这种情况。

优选地，分配器1具有容器部分10和喷嘴部分20，其适于施用来自容器部分10的止血可流动物。

在图5中更好地示出的容器部分10优选地具有有利于盐水溶液与止血粉末的混合并增强止血粉末的水合速度的形状。

另外，容器部分10可以具有波纹管11，该波纹管11使得使用者能够通过仅手动压缩波纹管11来施用止血可流动物，以便将止血可流动物通过喷嘴部分20从分配器1中推出。

因此，喷嘴部分20设计成在压缩容器部分12的波纹管11时允许止血可流动物流出分配器。

为了便于使用者手动压缩波纹管11，喷嘴部分20可包括手指支撑元件21，使得至少一个但优选两个手指可定位在该手指支撑元件21上以保持分配器1抵抗施加在波纹管11上的压缩力。

优选地，如图4所示，手指支撑元件21包括从分配器1的纵向轴线径向突出的两个细长构件，所述纵向轴线对应于波纹管11的压缩轴线。

喷嘴部分20还优选地设计成使使用者能够通过喷嘴部分20用盐水溶液填充容器部分10，这避免了必须从容器部分10移除喷嘴部分20并防止污染待水合的止血粉末的风险。

为此，喷嘴部分20可以例如包括管道22，盐水溶液可以通过管道22注入容器部分10内。这样的管道22也设计成使得当波纹管11被压缩时止血可流动物通过管道22而容易地流出分配器1。

优选地，分配器还包括盖30，其设计成可拆卸地联接在喷嘴部分20上。

该盖30优选地能够实现分配器1的气密密封，这在储存和混合阶段期间是特别有利的。

当不使用分配器1时，盖30优选地如图1所示闭合。这可以帮助限制污染装置内部的风险。

在分配器中使用并在图3中示出的盖30优选地是拧开盖，其易于移除、打开和闭合。

一个试剂盒的止血粉末的量优选为1g至2g。

一个试剂盒的盐水溶液的量优选为4ml至10ml，更优选为5ml至10ml。

根据优选实例，试剂盒包含1.65g止血粉末以与7ml纯盐水溶液混合。

优选地，在试剂盒中，用于使止血组合物水合的盐水溶液的质量为止血粉末的质量的2至10倍，优选为止血粉末的质量的4至5倍。

当使用者例如外科医生想要使用所提出的止血可流动物时，他可以使用上述试剂盒来进行制备。

为此，使用者通过移除相应的盖30来打开包含止血粉末的施用分配器(也称为施用器)。

然后，使用者必须将一定量的无菌盐水溶液转移到分配器1中。

根据分配器1中止血粉末的量，所用盐水溶液的量为5ml至10ml，优选7ml。

为了将盐水溶液转移到分配器1的容器部分10中，使用者可以例如使用注射器。这种注射器优选地设置在试剂盒中，使得其体积对应于通过止血粉末的水合形成止血可流动物所需的盐水溶液的精确量。

在将盐水溶液转移到分配器1中的同时，容器部分10优选地旋转，例如围绕其自身轴线旋转，以便于将盐水溶液结合到止血粉末中。如果盐水溶液由使用者手动结合，则容器部分10的旋转也可以用手完成。然而，该过程可以根据需要自动化。

在转移盐水溶液的同时轻敲和/或轻微摇动容器部分10也可以有利于促进盐水溶液掺入止血粉末中。

一旦将盐水溶液转移到分配器1中，优选地通过使用分配器1的盖30来闭合喷嘴部分20的开口，并且摇动容器以将止血粉末与盐水溶液混合。

摇动优选进行持续至少15秒，甚至更优选至少30秒。然而，就止血粉末的水合而言，10秒至30秒例如20秒的摇动时间已经是有效的。

摇动优选地手动进行，但也可以自动化。

当手动完成时，混合可以包括使分配器1上下移动一定次数。例如，分配器1可以上下移动至少10至30次，优选20次。为了提高混合效率，也可以翻转分配器1，然后上下移动一定次数。在手动混合的第二阶段，分配器1也可以上下移动至少10至30次，优选20次。

在摇动之后，优选将装入已形成的止血可流动物的分配器1搁置至少30秒，优选至少60秒，甚至更优选至少90秒。

搁置时间可能在30秒至120秒之间，优选约90秒。

该搁置时间段使得止血粉末的水合和初始溶胀能够形成水合的止血可流动物。

由此形成的止血可流动物具有均匀的优点。特别地，止血可流动物在分配器内具有基本上均匀的流动性。这是特别有利的，因为无论是来自分配器的产品的开始还是产品的剩余部分，止血可流动物的施用都将是相同的。

一旦通过止血粉末与盐水溶液的水合形成止血可流动物，止血可流动物可用几小时，例如至少8小时，没有任何属性或性能损失。

当止血可流动物准备好时，它可以如下使用：

-步骤1：用纱布/垫或吸力从目标出血部位吸干多余的血液，以便止血可流动物直接施用于出血源。在施用之前，伤口表面应尽可能干燥。

-步骤2：通过挤压波纹管将止血可流动物施用到出血源。应该施用足够的产品来覆盖整个出血源。

-步骤3：立即使用纱布/垫，最好用盐水浸湿，绝不使用血液，以将止血材料保持在目标出血部位，抵靠着出血表面，使其与损伤相符。

-步骤4：将止血材料维持在目标出血部位一段时间，例如至少2-3分钟，以形成止血凝块复合物。轻轻抬起纱布并检查该区域。

-步骤5：如果尚未实现止血，则重复步骤1-4或使用另一种止血治疗方法。

-步骤6：打开后丢弃任何未使用的产品。

取决于止血可流动物的粘度(相应的流动性)，可以避免步骤3，特别是如果止血可流动物足够粘稠以在不施加任何纱布/垫的情况下保持就位。

为了获得更好的效果，建议不要通过物理操作来破坏凝块复合物。

此外，一旦出血停止，应通过温和冲洗来除去任何过量的未结合止血凝块的止血可流动物。

所提出的止血可流动物的一个优点是它可被一次使用，即通过一次使用分配器中包含的整个产品，或者多次使用，例如当有多个出血区域同时治疗时或者手术过程中有多次连续出血时。

如上所述的止血可流动物具有增强与伤口的接触表面的优点，特别是与出血区域的接触更深。当出血区域对应于软组织和实质器官时，这特别有意义。

另外，止血可流动物可以容易地施用在伤口上或出血区域中，例如直接通过外科医生手动地采用特定施用器。它能够例如覆盖整个出血区域而不会留下任何未被止血可流动物覆盖的区域。

所提出的止血可流动物的另一个优点是它符合外科医生的习惯，外科医生习惯于用糊状物形式的止血产品治疗出血。

这也使外科医生可以选择他想使用的止血产品的形式，取决于他的习惯、手术的具体条件等。因此，他可以使用如wo2012/146655中描述的止血粉末，或如本文所公开的止血可流动物。

如上所述的止血粉末可以例如根据包括至少以下步骤的方法制备：

a)形成含水悬浮液，其包含优选地包括原纤维型胶原(主要包含纤维和/或原纤维胶原)和单糖，比如葡萄糖，

b)回收沉淀物、糊状物或凝胶形式的产品，特别是通过离心或倾析，

c)干燥产品，例如通过蒸发，

d)将产品研磨成所需的颗粒尺寸，特别是通过锤磨机研磨，以及

e)任选地，加入凝血酶和/或硫酸软骨素，特别是固体形式，特别是粉末形式。

步骤a)中的形成包含纤维/原纤维胶原和单糖的含水悬浮液导致单糖在胶原分子周围的均匀再分配。此外，胶原的分子种类和单糖之间的紧密接触在脱水后导致适于通过研磨获得具有所需高密度的粉末的硬饼。相反，混合胶原粉末和葡萄糖粉末不会产生均匀且可喷雾的粉末，特别是由于密度和电荷。

在步骤a)中，胶原可以以30g/l至150g/l的浓度存在。

单糖可以以如说明书中所定义的量加入悬浮液或均匀胶原糊状物中，更特别地相对于胶原的重量为约2至5重量％。

在步骤a)中，单糖可以以0.3g/l至10g/l的浓度存在。

步骤a)的胶原含水悬浮液可以是酸，特别是包括酸，比如盐酸。所述酸可以以0.01m至0.5m的浓度范围存在，特别是0.02m至0.1m，实际上为约0.05m。所述悬浮液可以是均匀糊状物的形式。

步骤b)可包括将悬浮液倒入模具中。

进行步骤c)以获得尽可能厚的饼(高于所需的最终颗粒尺寸)，具有非常高的密度且饼内尽可能少的气泡(小于5％)。

步骤d)之后可以进行筛选粉末的步骤，特别是为了获得所需的颗粒尺寸。

根据优选实施例，步骤a)在于形成包含95重量％原纤维型胶原和5重量％葡萄糖的混合物。在干燥(步骤b))和研磨(步骤c))该混合物之后，加入硫酸软骨素，其含量为混合物总重量的10重量％，使得最终组合物包含：

-胶原：相对于组合物的总重量为86.36重量％；

-葡萄糖：相对于组合物的总重量为4.54重量％；

-硫酸软骨素：相对于组合物的总重量为9.09重量％；

当还加入凝血酶时，它表示相对于组合物的总重量低于0.01重量％的最终含量。在上述混合物中，凝血酶的量可以为0.083iu/mg组合物。

对于所有上述粉末产品，显然可以根据研磨类型及其持续时间进行或多或少的彻底研磨以获得可变颗粒尺寸的粉末。

由与特定量的盐水溶液混合的止血粉末制成的止血可流动物可用作止血剂。

该止血剂可流动物也可用作药物组合物，特别是止血药。

如上所述，我们还提出了一种止血方法，包括将如上所述的止血可流动物沉积在动物身体(包括人)的出血部分上。特别地，止血可流动物可用于外科手术，特别是剖腹手术、腹腔镜检查、体腔镜检查和机器人手术。

上述止血可流动物也可用作内部和外部伤口的愈合剂。表述“愈合剂”是指能够获得与其接触的组织的临床上令人满意的愈合的产品。

示例：

示例1：用于体外测量止血能力的方案

在整个测量过程中，将柠檬酸化(约0.1m)的人血液保持在37℃的水浴中。将待测产品(10mg)沉积在具有搭扣盖的5ml聚丙烯管中，然后加入柠檬酸盐化的新鲜血液(2ml)。然后加入cacl2，使血液中的最终cacl2浓度为15mm，然后闭合试管。然后通过剧烈倒置(10次)将内容物混合，然后将试管插入水浴中；试管每10秒钟返回到垂直位置。记录形成凝块所需的时间并且对应于止血能力。

示例2：测量颗粒尺寸的方案

将已知量的产品特别是粉末通过50μm、100μm、200μm、300μm和400μm筛网筛分2分钟(每个筛网)。将来自每个筛网的分级(fraction)称重。确定每个颗粒尺寸范围的比例。

示例3：用于测量组合物溶胀的方案

称量15ml烧瓶(以mg计的m0)，然后加入xmg干燥组合物的粉末(以mg计的m0+x)。加入0.15m含水nacl溶液(2ml)，使组合物溶胀20分钟；然后将烧瓶以1000rpm离心。

用巴斯德吸管除去过量的nacl，并且通过在滤纸上翻转烧瓶除去液滴；然后用湿粉末称量烧瓶(以mg计的m1)。

溶胀比计算如下：((m1-m0)/(m0+x-m0))。

示例4：通过碱性提取制备原纤维型胶原

将用丙酮脱脂的猪真皮片(30kg)在100kg的0.05mnaoh溶液中溶胀3小时。通过切割机精细切割真皮，并用50升的0.05mnaoh稀释所得的糊状物。然后将混合物在压力下通过1mm筛网过筛。然后用hcl将得到的糊状物调至ph6-7.5，并且通过离心或通过1mm筛网过滤收集得到的沉淀物。

根据本领域技术人员已知的方法将保留物用丙酮脱水。因此，该脱水的保留物包括原纤维胶原，相对于非原纤维胶原具有大含量的原纤维/纤维胶原。通常，这种提取的胶原包含的原纤维/纤维胶原相对于胶原的总重量为85至95重量％和包含的非原纤维胶原相对于胶原的总重量为5至15％重量。

示例5：制备止血粉末#1

将30g如示例4中制备的原纤维型胶原加入1l的0.02m含水hcl溶液中，然后将混合物搅拌5小时。接着，向所得的均匀糊状物中加入粉末状果糖，其的量相对于胶原的重量为2重量％(0.6g)。

将混合物均化1小时，然后倒出并脱水。干燥后，使用fitzpatrick锤磨机以7000rpm在受控加热下以25g/min的速率研磨干燥产品。然后通过机械筛分筛选产品以除去尺寸大于400μm的颗粒。

然后，将硫酸皮肤素加入到粉末中，其的量相对于粉末的干物质(0.612g)为2重量％。

然后使用球磨机将混合物均化，将冻干的凝血酶以15iu/mg粉末的量加入混合物中，最后使用球磨机将混合物均化。

示例6：制备止血粉末#2

将7.5kg如示例4中制备的原纤维型胶原加入50l的0.05m含水hcl溶液中，然后将混合物搅拌16小时。接着，向所得的均匀糊状物中加入粉末状果糖，其的量相对于胶原的重量为5重量％(375g)。

将混合物均化3小时，然后分配到板上并脱水。干燥后，使用锤磨机以12000rpm在受控加热下以5g/min的速率通过分级研磨干燥产品。然后通过机械筛分筛选产品以除去尺寸大于400μm的颗粒和小于50μm的颗粒。

测量粒度以验证分布使得60重量％的样品具有大于200μm的粒度。

然后将纯化的硫酸软骨素加入粉末中，其的量相对于粉末的干物质(1.575kg)为20重量％。使用球磨机将混合物均化。

最后，将冻干的凝血酶以10iu/mg粉末的量加入混合物中。如前所述，使用球磨机将混合物均化。

示例7：制备止血粉末#3

将1000g如示例4中制备的原纤维型胶原加入60ml的0.02m含水hcl溶液中，然后将混合物搅拌5小时。接着，向所得的均匀糊状物中加入粉末状葡萄糖，其的量相对于胶原的重量为5重量％(50g)。

将混合物均化1小时，然后倒出并脱水。干燥后，使用fitzpatrick锤磨机以7000rpm在受控加热下以25g/min的速率研磨干燥产品。然后通过机械筛分筛选产品以除去尺寸大于400μm且小于50μm的颗粒。

然后将硫酸软骨素加入到粉末中，其的量相对于粉末的干物质(105g)为10重量％。然后使用球磨机将混合物均化。

这种粉末组合物的振实密度为约0.408g/ml。

实施例8：制备止血粉末#4

将500g如示例4中制备的原纤维型胶原加入30ml的0.02m含水hcl溶液中，然后将混合物搅拌5小时。接着，向所得的均匀糊状物中加入粉末状葡萄糖，其的量相对于胶原的重量为5重量％(25g)。

将混合物均化1小时，然后倒出并脱水。干燥后，使用fitzpatrick锤磨机以7000rpm在受控加热下以25g/min的速率研磨干燥产品。然后通过机械筛分筛选产品以除去尺寸大于400μm且小于50μm的颗粒。

然后将与凝血酶粉末混合的硫酸软骨素加入到粉末中，其的量相对于粉末的干物质(52.5g)为10重量％。将凝血酶以0.85u/mg的最终量加入混合物中。然后使用球磨机将混合物均化。

这种粉末组合物的振实密度为约0.425g/ml。

示例9：制备止血粉末#5

将750g如示例4中制备的原纤维胶原与6675ml高纯水混合。将混合物在20rpm的第一搅拌速率下搅拌10分钟，然后在40rpm的第二搅拌速率下搅拌15分钟。

然后在20rpm的第一搅拌速率下再次搅拌上述混合物，同时加入葡萄糖溶液(37.5g葡萄糖和300ml水)。加入的葡萄糖量相当于相对于混合物中使用的胶原的重量为5重量％。将该新混合物在40rpm的第二搅拌速率下搅拌10分钟。然后将该制剂储存16小时。

然后将量为87.5ml的1m含水hcl溶液加入到制剂中，同时以30rpm的搅拌速率搅拌。然后将该新混合物在35rpm的第一搅拌速率下搅拌1分钟，然后在40rpm的第二搅拌速率下搅拌1分钟，然后在40rpm的相同搅拌速率下进行5分钟的若干搅拌期。在两个搅拌期之间进行搅拌的迅速暂停。

然后将在前一阶段中获得的稠糊状物分成具有相似形状和质量的若干块。然后将这些块糊状物放入具有饱和氨的大气的气密密封外壳中24小时。在该中和步骤之后，将糊状物块在20℃下干燥96小时，然后使用forplex的低温研磨机以8500rpm在1kg/h的速率下研磨干燥产品。然后通过机械筛分筛选粉末产品以除去尺寸大于200μm且小于50μm的颗粒，从而得到胶原-葡萄糖粉末。

然后，将由尺寸在50μm和200μm之间的颗粒制成的硫酸软骨素(cs)粉末加入到胶原-葡萄糖粉末中，其的量相对于胶原-葡萄糖粉末的干物质为10重量％。例如，将30g硫酸软骨素粉末与300g胶原-葡萄糖粉末混合。对于这种止血粉末#5，还加入冷冻干燥的凝血酶，其的量为1000ui/g。然后使用v型混合器将混合物均化。最终的止血粉末的振实密度为约0.4g/ml。

示例10：胶原表征→胶原中可溶性胶原的存在，确定纤维/原纤维胶原与非原纤维胶原之间的比率。

实验的目标是确定胶原(提取的胶原或研磨成粉末的胶原)中的原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原的比例。这种比例可以通过研究胶原中不可溶(对应于原纤维/纤维胶原)和可溶胶原(对应于非原纤维胶原)的比例来确定。

该实验包括在16小时内在ph13的166ml水中溶解约2.5g待测胶原。然后将溶液离心(10000rpm，10分钟)。然后分离上清液(对应于非原纤维胶原)和残余物(对应于纤维/原纤维胶原)。用连续的丙酮浴和在受控的空气流下直接干燥残余物。用以6m的乙酸和盐酸将上清液的ph调节至ph3。通过添加nacl0.6m并通过进行离心获得来自上清液的固体胶原。然后用连续的丙酮浴和在受控的空气流下对其进行干燥。

计算来自残余物(m残余物)和来自上清液(m上清液)的胶原重量，并且公式m残余物/(m残余物+m上清液)×100给出纤维胶原占胶原总量的百分比。

在本发明中，对于用于制备粉末的胶原和最终胶原粉末，比率m残余物/(m残余物+m上清液)必须高于80％。优选地，该比率高于85％。

例如，由示例4中制备的三批胶原制成的上述实验给出非常相似的比率，分别为92.67％、94.60％和91.51％。在对这三批胶原进行研磨后，该比率依然保持非常相似，分别为91.63％、88.02％和88.69％。

显示纤维/原纤维胶原和可溶性胶原的存在的另一种方法是进行sds-page电泳。

图6说明了这种电泳，样品s1对应于第一批的上清液(由示例4中提取的胶原制成)，样品s2对应于该第一批的残余物，样品s3对应于第二批的上清液(也由如示例4中提取的胶原制成)，样品s4对应于该第二批的残余物。

结果表明，对于来自残余物的胶原，较大量的纤维不能通过丙烯酰胺凝胶迁移并在凝胶停止时染色。样品的制备不允许每条链与胶原分开。因此，α链以非常低的量存在。来自上清液的胶原能够在凝胶中完全迁移，顶部没有纤维被阻挡，来自胶原的链在电泳过程中被适当地分开。

参考文献资料

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-作者为markusbuehler的“naturedesignstoughcollagen:explainingthenanostructureofcollagenfibrils,”(pnas,august15,2006,vol.103,no.33,pp.12285-12290)

-作者为gross,johnh.highbergerandfranciso.schmitt的“extractionofcollagenfromconnectivetissuebyneutralsaltsolutions”(proceedingsofthenationalacademyofsciencesvolume41numberijanuary15,1955)

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