本发明涉及皮肤领域，具体来说，是涉及由毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法及其应用。
背景技术：
毛囊是上皮组织中最复杂的器官,横跨表皮和真皮。不但其结构、生理方面有很多特殊之处,而且具有一套独特的免疫方式。正常脱落头发是处于退行期及休止期的毛发。有些出现异常脱发或过度性脱落，比如一些电脑工作者、压力过大者，因内分泌失调、精神创伤、血管机能紊乱及遗传等因素。如此脱发很难再生，给人们带来较大的苦恼。因此寻找一种促进毛发再生方法和制剂，是长期以来医学、美容界苦苦追寻的课题。毛囊的基底区、外毛根鞘、隆突部位的干细胞具有很强细胞活性，为其皮肤毛发生长、发育和分化提供了内环境及其所需的各种生长因子。为了使皮肤组织中激素水平处于一个相对平衡状态，使皮肤毛囊较好修复，毛囊干细胞再生肽相对分子质量为6216的活性多肽，由53个氨基酸组成，是人体重要的活性蛋白多肽物质之一，可促进受损表皮、毛发的修复与再生，对烧伤、烫伤、光疗等多种表皮、毛囊创伤的修复功效十分显著。医学研究认为，干细胞再生肽复合物还有抗感染、抗过敏及免疫调节等作用。番茄红素是目前自然界发现最强的抗氧化剂，可增强机体免疫功能，对机体激素分泌具有较强的调节作用；薰衣草精油、牛至精油除了本身具有其特殊的芳香以外对于细胞的修复、再生起着重要作用，还是一种天然抗菌、抗病毒非化学防腐剂。上述物质组合成为复合纳米微脂囊突出其优势，在于高物理稳定性和高载量中有良好的生物相容性、高生物利用度、缓释特性，易于规模化生产的优势，且能够更深层地增加皮肤对药物的吸收，具有良好的抗炎防腐效果。
医学研究认为，脱发的病因主要有内分泌性(含激素水平)、神经性、营养性和物理性脱发。传统治疗主要针对其病因，使用米诺地尔酊、非那雄胺和增强营养或头皮毛发种植等方法。干细胞和干细胞活性肽的出现给毛发的再生带来了希望。干细胞具有慢周期性,在某些生长因素刺激后增殖；其超微结构及生化特征方面均具有未分化细胞的特点，还具有自我更新能力和增殖潜能,可分裂产生短暂增殖细胞；存在部位隐蔽、安全,血管丰富,营养条件好，可增殖、促使毛发再生。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊，以解决上述技术问题中的至少一个方面。
本发明的第二个目的在于提供上述毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法，以解决上述技术问题中的至少一个方面。
本发明的第三个目的在于提供上述毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊应用，以解决上述技术问题中的至少一个方面。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊，主要利用逆相蒸发-冷冻干燥法制备毛囊干细胞再生肽复合柔性纳米微脂囊，微脂囊其平均粒径为(81.62±3.67)nm，zeta电位为(60.12±7.58)mv平均包封率为(37.86±4.77)％；平均载药量为(6.58±127)％。所述的毛囊干细胞再生肽复合物至少有以下两种成分组成：毛囊再生肽、番茄红素、薰衣草精油、牛至精油和乙醇复合而成：毛囊干细胞再生肽10μg/l10～30份、薰衣草精油5～15份、亚麻籽油番茄红素5～15份、牛至精油5～15份。
本发明的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊，具有以下的有益效果：
(1)毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊是一种用特殊的脂质体(黄豆卵磷脂)包裹着的多种活性成分的微粒，以纳米为计算单位比传统护肤品缩小1000倍，可轻易穿透毛孔和角质层细胞的间隙，进入皮肤深层，皮肤可以吸收到更多的水分和养分，最大限度地补充真皮营养传递的不足。
(2)通过微脂囊包覆技术将毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊活性成分包覆形成纳米级的微脂囊，一方面可以提高毛囊干细胞再生肽复合物的稳定性，使其具有长效持久的缓释功能，延长其毛发再生作用时间；另一方面，在确保不破坏毛囊干细胞再生肽复合物的前提下，将毛囊干细胞再生肽复合采用微脂囊包覆技术包覆形成微脂囊后，能提高毛囊干细胞再生肽复合物与皮肤制品霜、膏等成分的相容性，使其更加方便地应用于皮肤类产品添加剂中。
(3)纳米微脂囊由于粒径处于纳米级范围，具有突出的纳米效应，即小尺寸效应和表面效应。小尺寸效应意味着其穿透生理组织屏障能力很强，渗透力增强，可有效携带毛囊干细胞再生肽活性物质轻易穿透角质层，深入基底层发挥功效作用，由内而外层层修复肌肤，促使毛发再生、增殖。
(4)选择微脂囊混悬液、脂质体冻干粉和毛囊干细胞再生肽冻干粉。制备成脂质体或冻干粉末，都可提高其稳定性。
(5)在原料方面，所使用的亚麻籽油番茄红素、薰衣草精油、牛至精油等高抗氧化复合物活性成分均为纯天然植物提取物，保证了原料的高效、无毒安全；增加干细胞再生肽稳定性，减少和消除了化学防腐剂的致畸性、致癌性。
(6)在一些具体的实施方式中，微脂囊的包覆率可以为78.2～90.0％，载药量可以为20.0～25.0％。由此，可以使得微脂囊的毛发再生效果更佳。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了上述干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜人头皮毛囊外根鞘隆突部干细胞-培养-鉴定-提纯-获取10μg/l毛囊干细胞再生肽；亚麻籽油番茄红素树脂：22％番茄固体物按1:1用微波萃取法制成570mg/l番茄红素的亚麻籽番茄油；
(2)新鲜薰衣草花草若干，用蒸馏方法提取薰衣草精油；
(3)新鲜牛至花、草若干，用蒸馏方法提取牛至精油；
(4)采用逆相蒸发－冷冻干燥法制备毛囊再生肽复合物纳米微脂囊；
(5)进行毛囊干细胞再生肽含量检测[酶联免疫吸附法(elisa)]；
(6)采用由fry等提出的sephadexg－50微柱离心法分离柔性纳米脂囊和游离毛囊再生肽；
(7)精确观察其形态；
(8)精确测定变形性：
(9)严格稳定性鉴定：
本发明的制备毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的方法，采用特定的加入顺序，不仅可以保证毛囊干细胞再生肽复合物的复合结构，还可以使得绝大部分毛囊干细胞再生肽复合物被包裹，减少浪费高效利用。
根据本发明的又一方面，还提供了上述毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊在生物制品中的应用。将本发明的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊添加到生物制品中，一般按生物制品总质量的20％～30％来添加，可以制成霜剂、膏剂、乳液等类型的生物制品。
1.毛囊干细胞再生肽纳米微脂囊的备制及其应用，其特征在于，利用逆相蒸发-冷冻干燥法制备；毛囊干细胞再生肽复合柔性纳米微脂囊，采用酶联免疫吸附测定(elisa)的毛囊干细胞再生肽复合含量，电镜观察其形态，并考察其包封率或载药量、变形性及稳定性。毛囊干细胞再生肽复合纳米微脂囊为多室脂质体。所述的微脂囊其平均粒径为(81.62±3.67)nm，zeta电位为(60.12±7.58)mv平均包封率为(37.86±4.77)％；平均载药量为(6.58±1.27)％。毛囊干细胞再生肽复合纳米微脂囊柔性纳米脂质体具有较高的稳定性。含量测定方法简单、可靠，稳定性和变形性高，可能成为透皮转运的有效载体。所述的毛囊再生肽复合物至少有以下两种成分组成：毛囊干细胞再生肽、番茄红素、薰衣草精油和牛至精油复合而成：
毛囊干细胞再生肽10μg/l10～30份、薰衣草精油5～15份、亚麻籽油番茄红素5～15份、牛至精油5～15份。
2.根据权利要求1所述的毛囊干细胞再生肽复合纳米微脂囊，其特征在于，毛囊再生肽复合物由以下质量份的物质复合而成：
毛囊干细胞再生肽35份、薰衣草精油10份、番茄红素油10份和牛至精油10份。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊，其特征在于，所述的微脂囊的包覆率为80.0～90.0％，载药量为20.0～25.0％。
4.权利要求3所述的毛囊再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)取新鲜人头皮毛囊外根鞘隆突部干细胞-培养-鉴定-提纯-获取10μg/l毛囊干细胞再生肽；亚麻籽油番茄红素树脂：22％番茄固体物按1:1用微波萃取法制成570mg/l番茄红素的亚麻籽番茄油；
(2)新鲜薰衣草花草若干，用蒸馏方法提取薰衣草精油；
(3)新鲜牛至花、草若干，用蒸馏方法提取牛至精油；
(4)毛囊再生肽复合物纳米微脂囊(逆相蒸发－冷冻干燥法)制备：精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素e，置梨形瓶中，加入适量氯仿(含1％无水乙醇)，于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和毛囊干细胞活性肽溶解于4℃磷酸盐缓冲液(pbs)(ph＝7.4)溶液中。脂质溶解后，将pbs溶液倒入脂质溶液中，在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)，形成均匀乳液。室温下放置30min。将乳液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07mpa，转速500r/min)，形成水相脂质体混悬液后，继续蒸发15min，以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中，高压均质3次，再通过0.1μm微孔滤膜挤出10次后，－40℃预冻24h后，于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。
(5)毛囊干细胞再生肽含量检测[酶联免疫吸附法(elisa)]：分别配制质量浓度为15，30，50，100，200，300，400，500ng/ml的毛囊干细胞再生肽系列溶液，以0.2％聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)破坏脂质膜的空白柔性纳米微脂囊做空白对照，按照elisa检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品，以样品中毛囊干细胞再生肽的质量浓度(x)为横坐标、检测的od值(y)为纵坐标，采用四参数回归方法进行运算，得回归方程y＝(a-d)/[1+(x/c)^b]+d，以检测样品中毛囊干细胞再生肽的含量。
(6)毛囊再生肽复合物纳米微脂囊分离采用由fry等提出的sephadexg－50微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离毛囊再生肽。将sephadexg－50用适量pbs溶液浸泡24h后装柱，以3000r/min离心3min以去除其中多余的pbs，先用不含毛囊再生肽复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25ml过柱，然后向柱中加入0.25ml毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊混悬液，离心，收集离心液，微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。
(7)观察其形态；柔性纳米微脂囊径1.0％磷钨酸负染，将柔性纳米微脂囊用pbs缓冲液稀释10倍，在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位；包封率(ee)采用以下公式计算:ee(％)＝柔性纳米脂质体egf含量/柔性纳米脂质体混悬液中egf总含量×100％；载药量:取毛囊干细胞再生肽复合物冻干微脂囊1mg置5ml容量瓶中，加入0.2ml10％tritonx-100，加pbs至刻度，测定总毛囊再生肽复合物量；冻干微脂囊载药量＝毛囊干细胞再生肽复合物的量/1mg×100％。本方法所制备的毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径应为(81.62±3.67)nm，zeta电位为(60.12±7.58)mv，平均包封率为(37.86±4.77)％，平均载药量为(6.58±1.27)％。
(8)变形性测定：取1ml一次性注射器，分别加入1ml蒸馏水、毛囊再生肽复合物柔性纳米微脂囊及毛囊干细胞再生肽复合物普通脂质体，分别外加0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mpa压力，计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间，计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比，以测定柔性纳米微脂囊的变形性，相比，毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。
(9)稳定性鉴定：取3批毛囊干细胞再生肽微脂囊复合物混悬液、毛囊干细胞再生肽复合物冻干粉及毛囊干细胞再生肽复合物微脂囊冻干粉，分别置室温25℃、4℃条件下，于0，3m测定其包封率、载药量、ph、粒径和zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性。
5.根据权利要求4所述的毛囊干细胞再生肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)的本化合物中的毛囊干细胞再生肽：(1)取新鲜人头皮毛囊基底区干细胞培养；(2)新鲜人头皮毛囊外根鞘隆突部干细胞诱导能力鉴定(细胞活性检测、免疫组织化学检测、流式细胞检测分析)；(3)通过rt-pcr从毛囊干细胞rna中扩增出ngf的dna全场片段，构建拷贝逆转录病毒载体plxsn-ngf,脂质体转染导入pa317，感染nscs，获得高度表达的毛囊干细胞再生肽的基因工程干细胞；(4)通过对pc12-t-rkb细胞以及对体外培养的相应区域的毛囊干细胞的影响检测其生物活性，证明该基因工程干细胞可分泌相应的毛囊干细胞再生肽；(5)后再扩增、提取相应的再生因子，获取10μg/l毛囊干细胞再生肽与步骤(2)、(3)、(4)合成化合物。
6.根据权利要求5所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的一种公开方法，毛囊再生肽复合物纳米微脂囊(逆相蒸发-冷冻干燥法)制备：精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素e，置梨形瓶中，加入适量氯仿(含1％无水乙醇)，于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和毛囊干细胞再生肽溶解于4℃pbs(ph＝7.4)溶液中。脂质溶解后，将pbs溶液倒入脂质溶液中，在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)，形成均匀乳液。室温下放置30min。将乳液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07mpa，转速500r/min)，形成水相脂质体混悬液后，继续蒸发15min，以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s，停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中，高压均质3次，再通过0.1μm微孔滤膜挤1次后，-40℃预冻24h后，于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。
7.权利要求6所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的毛囊干细胞再生肽复合物含量检测[酶联免疫吸附法(elisa)]：使其分别配制质量浓度为15，30，50，100，200，300，400，500ng/ml的毛囊干细胞再生肽复合物系列溶液，以0.2％tritonx-100破坏脂质膜的空白柔性纳米脂质体做空白对照，按照elisa检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品，以样品中毛囊干细胞再生肽复合物的质量浓度(x)为横坐标、检测的od值(y)为纵坐标，采用四参数回归方法进行运算，得回归方程y＝(a-d)/[1+(x/c)^b]+d，以检测样品中毛囊干细胞再生肽复合物的含量。
8.权利要求7所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊分离采用交联葡聚糖-50(sephadexg–50)微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离毛囊干细胞再生肽。将sephadexg-50用适量pbs溶液浸24h后装柱，以3000r/min离心3min以去除其中多余的pbs，先用不含毛囊干细胞再生肽复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25ml过柱，然后向柱中加入0.25ml毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊混悬液，离心，收集离心液，微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。
9.权利要求8所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(7)所述的观察其形态；用柔性纳米微脂囊径1.0％磷钨酸负染，将柔性纳米微脂囊用pbs缓冲液稀释10倍，在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位；包封率(ee)采用以下公式计算:ee(％)＝柔性纳米脂质体egf含量/柔性纳米脂质体混悬液中毛囊干细胞活性肽复合物总含量×100％；载药量:取毛囊干细胞再生肽复合物冻干微脂囊1mg置5ml容量瓶中，加入0.2ml10％tritonx-100，加pbs至刻度，测定总毛囊干细胞再生肽复合物量；冻干微脂囊载药量＝毛囊再生肽复合物的量/1mg×100％。本方法所制备的毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径应为(81.62±3.67)nm，zeta电位为(60.12±7.58)mv，平均包封率为78.2～90.0％，载药量可以为20.0～25.0％。
10.权利要求9所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法，其特征在于，步骤(8)所述的变形性测定：取1ml一次性注射器，分别加入1ml蒸馏水、毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊及毛囊干细胞再生肽复合物普通脂质体，分别外加0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mpa压力，计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间，计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比，以测定柔性纳米微脂囊的变形性，相比，毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。
11.权利要求10所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法其特征在于，步骤(9)的稳定性鉴定：取3批毛囊干细胞再生肽微脂囊复合物混悬液、毛囊干细胞再生肽复合物冻干粉及毛囊干细胞再生肽复合物微脂囊冻干粉，分别置室温25℃、4℃条件下，于0，3m测定其包封率、载药量、ph、粒径和zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性。
12.权利要求1所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊制备毛囊干细胞再生肽在生物制品中的应用。