具有改善免疫应答作用的软骨提取物、其制备方法及其用途与流程

1.本发明涉及一种具有改善免疫应答作用的软骨提取物、其制备方法及其用途。更具体地，本发明涉及一种具有改善免疫应答作用的、含有对于改善免疫应答为有效量的非变性ii型胶原蛋白的软骨提取物，以及涉及所述软骨提取物的制备方法及其用途。


背景技术：

2.胶原蛋白(collagen)是一种生物高分子，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白。胶原蛋白一般占动物体内蛋白质总量的25～30质量％，在某些动物体内甚至高达80质量％以上。目前已发现的胶原蛋白有27种，常见类型为ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、
ⅴ
型和
ⅺ
型。由于胶原蛋白具有低毒性、低抗原性、低免疫性、引导细胞再生和与人体相容性较好等特点，因此已被广泛应用于食品、保健食品、生物医学材料和临床医疗等领域。目前市售的胶原蛋白多为经过水解后的胶原蛋白，其主要成分是多肽，分子量分布在200～20000道尔顿(da)的范围内。
3.软骨(cartilage)即软骨组织，是一种以支持作用为主的结缔组织，由软骨细胞和软骨基质组成，含有丰富的ⅱ型胶原蛋白和软骨多糖。ii型胶原蛋白是一种典型的纤维状蛋白质，由三条相同的α链组成的，主链以β-折叠和无规则卷曲结构为主，不包含α-螺旋；甘氨酸残基占氨基酸总数的30％左右，是羟脯氨酸含量的4～5倍；不含有色氨酸，且芳香族氨基酸含量较少；水解的α1肽链分子质量均在110～130千道尔顿(kda)之间；变性温度均在34℃以上。
4.现有技术中已有报道从软骨中提取出含非变性ii型胶原蛋白的软骨提取物。例如，cn106916870a中公开了一种含非变性ii型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，所述方法依次包括脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤和干燥步骤。在该cn106916870a的实施例中，所制备出的软骨提取物中含有3.9～12.6质量％的ii型胶原蛋白。但是，上述cn106916870a对于其制备的软骨提取物如何实现稳定贮存没有任何提及。
5.对于包括ii型胶原蛋白在内的蛋白质产品，如何实现在贮存期内蛋白质的防腐(防止腐败菌、致病菌的生长繁殖)是非常重要的。目前已有的用于实现贮存期内有效防腐的手段可包括高温处理(h)、低温冷藏或冻结(t)、酸化(ph)、降低氧化还原值、添加防腐剂等等。但是，上述高温处理(h)、低温冷藏或冻结(t)、酸化(ph)、降低氧化还原值这些方法在实现防腐的同时，几乎都会造成蛋白质变性的后果，而添加防腐剂不符合现代人们追求绿色、不加防腐剂的消费潮流。另外，蛋白质产品自身随着贮存时间的增长，蛋白质发生变性的风险也会逐渐增加。
6.为了在蛋白质贮存期内实现防腐的同时有效防止蛋白质变性，现有技术中也有提出了一些方法，其中的一种方法是教导将抗微生物介质(例如次氯酸盐)与离子化盐(例如氯化钠、氯化钾)组合用于提高蛋白质产品(例如ii型胶原蛋白)在贮存过程中的防腐及防止蛋白质变性。但是，所述抗微生物介质(例如次氯酸盐)具有氧化性能、本身对人体健康是有害的，若摄入人体会导致潜在的健康风险；而所述离子化盐(例如氯化钠、氯化钾)若过量
摄入人体可能导致体内高钠、高钾，存在引发高钠血症或高钾血症的风险。因此，这种教导的方法并非理想。
7.对于ii型胶原蛋白分子而言，根据免疫应答机制，能够引起免疫应答反应的必须是完整的未变性ii型胶原蛋白分子。ii型胶原蛋白在贮存过程中如果发生腐败菌和/或致病菌的生长繁殖，则会因制品安全性问题而带来巨大的使用风险。另一方面，ii型胶原蛋白在贮存过程中一旦发生变性，则不能发挥有效的免疫应答作用。因此，现有技术中对于含ii型胶原蛋白的制品如何在防腐的同时防止蛋白质变性的技术一直存在需求。


技术实现要素：

8.本发明正是为解决上述现有技术中的问题而作出的。本发明的目的在于提供一种具有改善免疫应答作用的软骨提取物，所述软骨提取物含有对于改善免疫应答为有效量的ii型胶原蛋白，并且在贮存期间能够在防腐的同时有效防止所述ii型胶原蛋白的变性，从而在贮存后仍维持改善免疫应答的作用。本发明还提供所述软骨提取物的制备方法和用途。
9.出人意料地，本发明人发现通过在所述含有非变性ii型胶原蛋白的软骨提取物的制备过程中加入特定质量比的透明质酸钠与香菇多糖，则所述透明质酸钠与香菇多糖能够在所制得的软骨提取物的贮存期间同时实现防腐的作用与防止所述ii型胶原蛋白变性的作用。本发明正是基于这一发现而作出的。
10.具体地，本发明的一个实施方式涉及一种具有改善免疫应答作用的软骨提取物，该软骨提取物含有对于改善免疫应答为有效量的非变性ii型胶原蛋白，其中该软骨提取物中加入了透明质酸钠与香菇多糖，其中所述透明质酸钠对香菇多糖的质量比为4:1-1:1。
11.在一个优选实施方式中，所述软骨提取物含有2～20质量％的非变性ii型胶原蛋白。
12.在一个优选实施方式中，所述透明质酸钠对香菇多糖的质量比为4:1-2:1。
13.在一个优选实施方式中，所述软骨提取物是以软骨作为原料制得的，并且基于作为原料的软骨的总质量，所述透明质酸钠与香菇多糖的总加入量为10～60质量％，优选为20～30质量％。
14.本发明的另一个实施方式涉及一种制备具有改善免疫应答作用的软骨提取物的方法，其中在以软骨为原料制备软骨提取物的过程中，加入了透明质酸钠与香菇多糖，其中所述透明质酸钠对香菇多糖的质量比为4:1-1:1。
15.在一个优选实施方式中，所述方法包括以下步骤：
16.1)以软骨为原料，去除软骨中的脂质成分；
17.2)将步骤1)中所得去除脂质成分后的软骨破碎而实现匀浆化；
18.3)向步骤2)所得的匀浆中加入选自弹性蛋白酶、无花果蛋白酶和生姜蛋白酶中的至少一者进行酶解；
19.4)向步骤3)所得的酶解物中加入透明质酸钠与香菇多糖；
20.5)将步骤4)的所得物进行冷冻干燥获得软骨提取物。
21.在一个优选实施方式中，在所述步骤3)中，加入弹性蛋白酶、无花果蛋白酶和生姜蛋白酶这三者。
22.在一个优选实施方式中，所述透明质酸钠对香菇多糖的质量比为4:1-2:1。
23.在一个优选实施方式中，基于作为原料的软骨的总质量，所述透明质酸钠与香菇多糖的总加入量为10～60质量％，优选为20～30质量％。
24.在一个优选实施方式中，将所述步骤5)冷冻干燥之后的软骨提取物进一步粉碎获得粉碎物，然后在常温下保存。
25.在一个优选实施方式中，在所述步骤1)与步骤2)之间还包括以乙醇进行的消毒步骤。
26.在一个优选实施方式中，在所述步骤3)与步骤4)之间还包括过滤并收集滤液的步骤。
27.本发明的另一个实施方式涉及上述具有改善免疫应答的软骨提取物在制备改善免疫应答的制剂中的用途。
28.在一个优选实施方式中，所述制剂在常温下的有效贮存期不少于36个月。
29.技术效果：本发明的软骨提取物避免加入传统的防腐物质如次氯酸盐和传统的防止蛋白变性的物质如氯化钠、氯化钾，从而避免了这些传统的防腐物质和/或防止蛋白变性的物质的摄入带来的对人体健康的风险。作为替代，本发明的软骨提取物中加入的透明质酸钠与香菇多糖属低热量的有益物质、且有利于提高人体免疫力，因此其加入对人体健康不仅无害、而且是有益的。并且，在本发明的软骨提取物中通过加入透明质酸钠与香菇多糖，能够在实现防腐作用的同时有效避免ii型胶原蛋白的变性。
30.其结果，本发明的软骨提取物在制备成改善免疫应答的制剂后，在常温下即使贮存不少于36个月，仍能够维持有效的改善免疫应答的效果，从而保护人体避免因免疫应答过激对组织造成的伤害。
附图说明
31.图1为根据实施例1获得的非变性ii型胶原蛋白的透射电镜图片。
32.图2为根据实施例1获得的非变性ii型胶原蛋白的western印迹的结果，其中右侧泳道是实施例1获得的ii型胶原蛋白。
33.图3示出了实验例1中验证的软骨提取物对碘乙酸钠(mia)诱导的免疫应答过激的改善作用。
34.图4示出了实验例2中验证的软骨提取物对碘乙酸钠(mia)诱导的免疫应答过激的改善作用。
具体实施方式
35.以下结合具体实施方式对本发明进行详细的描述。但对本领域技术人员而言显见的是，以下具体实施方式仅为例示目的，不应解释为是对本发明范围的限制。
36.在本技术说明书中，术语“非变性”是指ii型胶原蛋白没有发生变性，而具有完整的三螺旋结构。
37.在本技术说明书中，术语“约”在用于限定数值时，表示所指定数值的
±
5％。
38.在本技术说明书中，术语“％”如无特别指明，则表示质量％。
39.在本技术说明书中，术语“常温”表示周围环境温度，即未经过特别的升温或降温
处理。
40.在本技术说明书中，术语“对于改善免疫应答为有效量”是指软骨提取物中的非变性ii型胶原蛋白的含量能够有效起到改善免疫应答的作用，其具体含量可以根据实际需要合理地确定和配置。
41.本发明的第一实施方式涉及一种具有改善免疫应答作用的软骨提取物，该软骨提取物含有对于改善免疫应答为有效量的非变性ii型胶原蛋白，并且该软骨提取物中加入了透明质酸钠与香菇多糖，其中所述透明质酸钠对香菇多糖的质量比为4：1至1：1。
42.在上述第一实施方式中，所述软骨提取物优选地可以含有2～20质量％的非变性ii型胶原蛋白。
43.在上述第一实施方式中，关于所述透明质酸钠与香菇多糖的加入量，可以根据实际需要合理地确定。优选地，基于作为原料的软骨的总质量，所述透明质酸钠与香菇多糖的总加入量为10～60质量％，更优选为20～30质量％。
44.本发明的第二实施方式涉及一种制备上述具有改善免疫应答作用的软骨提取物的方法，所述方法包括在以软骨为原料制备软骨提取物的过程中，加入了透明质酸钠与香菇多糖，其中所述透明质酸钠对香菇多糖的质量比为4：1至1：1。
45.在上述第二实施方式中，所述方法优选包括以下步骤：
46.1)以软骨为原料，去除软骨中的脂质成分；
47.2)将步骤1)中所得去除脂质成分后的软骨破碎而实现匀浆化；
48.3)向步骤2)所得的匀浆中加入选自弹性蛋白酶、无花果蛋白酶和生姜蛋白酶中的至少一者进行酶解；
49.4)向步骤3)所得的酶解物中加入透明质酸钠与香菇多糖；
50.5)将步骤4)的所得物进行冷冻干燥获得软骨提取物。
51.在上述第二实施方式中，对作为原料的软骨的来源没有特别限制，例如可以来源于鱼、牛、猪、羊、鸡、鸭等的软骨。因此，本发明中使用的原料具有来源广泛、简单易得的优点。相应地，本发明制得的软骨提取物因其以常见家畜、家禽等动物的软骨作为原料，来源安全，因而可作为食品原料添加到普通食品、保健食品和医药制品中。
52.在上述第二实施方式中，在脱脂之前，可以对所述软骨进行预处理。例如，可以将所述软骨在剔除肉、筋膜、红骨等非软骨成分之后，利用切丁机切成丁状，所述丁状的大小没有特别限制，例如可以为4
×
4mm大小。
53.在上述第二实施方式中，对软骨的脱脂可通过本领域中熟知的方式、选用本领域常用的脱脂剂来进行，对此没有特别限制。所述脱脂剂例如可以为na2co3、nahco3、na2sio3、na3po4溶液等，优选为na2co3、nahco3溶液。所述脱脂剂的浓度可以为0.005～0.1质量％的范围，优选为约0.01～0.04质量％的范围，最优选为约0.02质量％。脱脂的时间没有特别限制，例如可以为3～10小时，优选为5～7小时，最优选为约6小时。在脱脂排水后，可以用纯化水进行清洗至ph 6～7、优选清洗至ph约6.5。
54.在上述第二实施方式中，在对软骨脱脂之后和匀浆化之前，还可以进行消毒处理。所述消毒处理可以利用例如浓度约75％的乙醇来进行。对消毒的次数、时间没有特别限制，例如可以进行2～5次、优选3～4次消毒，每次消毒可以进行例如大约1～3小时、优选约2小时。在消毒结束之后，可以用纯化水进行清洗以除去乙醇。该消毒和纯化水清洗可以在
ph6.0～7.5、优选在ph 6.5～7.0下进行。
55.在上述第二实施方式中，在所述步骤2)中，所述匀浆化可通过使用匀浆机来进行。所述匀浆机没有特别限制，例如可以为胶体磨。作为一个实例，所述匀浆化处理可以将所述脱脂后的软骨磨成100～200目的大小。
56.在上述第二实施方式中，在所述步骤3)中，加入选自弹性蛋白酶、无花果蛋白酶与生姜蛋白酶中的至少一者进行酶解。关于这几种蛋白酶的种类、用量和酶活力的具体选择，可根据实际需要进行合适的选择，只要能够尽可能地降低ii型胶原蛋白的变性、而提高其它蛋白质的降解即可。优选地，基于作为原料的所述软骨的总质量，所述选自弹性蛋白酶、无花果蛋白酶与生姜蛋白酶中的至少一者的加入量可以为0.5～1.5质量％，更优选为约0.75～1.0质量％。优选地，加入弹性蛋白酶、无花果蛋白酶与生姜蛋白酶这三者进行酶解，此时基于作为原料的所述软骨的总质量，所述选自弹性蛋白酶、无花果蛋白酶与生姜蛋白酶的加入量可以分别为0.1～1质量％、0.1～0.5质量％和0.1～0.5质量％。所述酶解时的ph条件可以根据实际情形合适地确定，例如可以在ph 6～8、优选约ph 7.5的条件下进行。酶解时的温度和酶解时间也可以根据实际情形合适地确定，例如可以在常温下进行5～50小时，优选进行10～30小时，更优选进行20～27小时。
57.在上述第二实施方式中，在所述步骤3)与步骤4)之间，还可以包括一个过滤步骤，用于去除酶解液中的大颗粒物质、收集过滤液。所述过滤可以通过利用筛网，例如1～10目、优选5目筛网在常温下进行。
58.在上述第二实施方式中，在所述步骤4)中，向酶解液中加入透明质酸钠与香菇多糖。
59.关于所述透明质酸钠与香菇多糖的加入量，可以根据实际需要进行合理地确定。但从获得最佳的防腐与防止ii型胶原蛋白变性的角度来看，基于作为原料的所述软骨的总质量，所述透明质酸钠与香菇多糖的总加入量可优选为10～60质量％，优选为20～30质量％，通过加入该含量范围的所述透明质酸钠与香菇多糖，可以使防腐与防止ii型胶原蛋白变性的效果达到最优。
60.在上述第二实施方式中，所述步骤5)中的冷冻干燥可以优选在真空下进行。所述冷冻干燥过程优选包括预冷处理和其后的干燥过程。所述预冷处理可以在例如不高于-40℃的温度下进行，所述干燥过程的终温度可以控制在例如10～50℃，例如控制在约30℃。通过该冷冻干燥处理，即可获得软骨提取物。
61.在上述第二实施方式中，在所述步骤5)之后，优选还可以将所述软骨提取物进行粉碎获得粉碎物。所述粉碎优选在低温下进行，所述低温例如可以为10℃以下，优选为6℃以下。所述粉碎例如可通过超微粉碎来进行，粉碎物的大小可根据实际需要合适确定，例如控制在100～300目，优选控制在150～250目。该粉碎处理后的粉碎物可在常温下有效贮存不少于36个月。
62.本发明的第三实施方式涉及上述具有改善免疫应答的软骨提取物在制备改善免疫应答的制剂中的用途。
63.在上述第三实施方式中，所述制剂在常温下的有效贮存期不少于36个月。
64.此处，对所述第三实施方式中的制剂的形式没有特别限制，例如所述制剂可以是经胃肠道给药的剂型如常用的散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂等，或者所述制剂
mia/只，空白对照组(正常组)注射相同体积的生理盐水。造模当天开始给予饲料中添加4、6或8mg/千克体重(kgbw)/天的由实施例1制备的软骨提取物(分别为低、中和高剂量组)。正常组给予标准饲料，连续5周后，腹主动脉采血，3000转/分钟离心10分钟取血清备用，采用elisa法测定大鼠血清中tnf-α(上海酶联生物科技有限公司生产)含量。实验结果如图3所示，软骨提取物低、中、高剂量组能明显降低血清中tnf-α含量，与模型组比较有显著和明显差异(p《0.01，p《0.05)。
82.上述结果证明，实施例1中制备的软骨提取物以剂量依赖性方式对血清中tnf-α的含量具有降低的作用(即，可抑制tnf-α的产生，其系与发炎或自体免疫疾病有关)。这直接表明，实施例1中制备的软骨提取物对免疫应答过激具有一定的抑制作用，从而帮助免疫应答回到正常水平。
83.实验例2：软骨提取物在mia诱导的sd大鼠中对tgf-β含量的效果
84.sd雄性大鼠，体重200g～230g，spf级，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。除空白对照组(正常组)外，所有大鼠在膝关节腔内注射以生理盐水配制的碘乙酸钠(mia)溶液25ul(40mg/ml)，即1mg mia/只，空白对照组(正常组)注射相同体积的生理盐水。造模当天开始给予饲料中添加4、6或8mg/kgbw/天的由实施例1制备的软骨提取物(分别为低、中和高剂量组)。正常组给予标准饲料，连续5周后，腹主动脉采血，3000转/分钟离心10分钟取血清备用，采用elisa法测定大鼠血清中tgf-β(上海酶联生物科技有限公司生产)含量。实验结果如图4所示，软骨提取物低、中、高剂量组能明显增加大鼠血清中tgf-β含量，与模型组比较有明显或显著差异(p《0.05，p《0.01)。
85.上述结果证明，实施例1中制备的软骨提取物以剂量依赖性方式对血清中tgf-β的含量具有增加的作用(即，可诱导tgf-β的产生，其系与减缓发炎反应有关)。这直接表明，实施例1中制备的软骨提取物对免疫应答过激具有一定的抑制作用，从而帮助免疫应答回到正常水平。
86.实验例3：不同的多糖物质在软骨提取物中防腐及防止ii型胶原蛋白变性中的效果
87.按如下表中实验1-9的用量分别选用赤藓糖醇、壳寡糖、透明质酸钠、香菇多糖，与通过将4千克软骨按实施例1中(1)～(6)步骤得到的软骨提取物混合，检测aw、以及在加速实验6个月后检测菌落总数、霉菌和酵母。在下表1的实验10-11中，则是分别采用同等重量的氯化钠与氯化钾替代多糖物质。
[0088][0089]
上述表1清楚地表明，实验1～5在加速实验中aw变高，导致微生物生长，非变性ii型胶原蛋白含量降低。另一方面，在实验10～11中则是分别采用现有技术中的氯化钠和氯
化钾，其虽然能起到保持aw基本不变、抑制微生物生长、维持非变性ii型胶原蛋白含量的目的，但高钠和高钾的使用对人体健康带来不利。而在实验6-9中，一方面能起到保持aw基本不变、抑制微生物生长、维持非变性ii型胶原蛋白含量的目的，另一方面由于采用的是透明质酸钠与香菇多糖，因此对人体健康不会带来不利的后果。
[0090]
上文结合实施例具体描述了本发明，但对本领域技术人员而言显见的是，可在不偏离本发明主旨与范畴的前提下对其进行各种修正。这样的修正都处于本技术发明的范围之内。