截短侧耳素类化合物的新治疗用途的制作方法

截短侧耳素类化合物的新治疗用途
1.本发明涉及截短侧耳素类化合物(pleuromutilins)的新治疗用途。
2.截短侧耳素(pleuromutilin)是下式的化合物，
[0003][0004]
它是一种天然存在的抗生素，例如由担子菌侧耳菌(pleurotus mutilus)和p.passeckerianus产生，参见例如merck index，第12版，项目7694。
[0005]
已经开发了许多具有截短侧耳素的主要环结构并在伯羟基基团处被取代的其它截短侧耳素类化合物，例如作为抗菌剂。由于其显著的抗菌活性，已发现如wo 2008/113089中所公开的一组截短侧耳素衍生物氨基-羟基取代的环己基硫烷基乙酰基莫林(cyclohexylsulfanylacetylmutilin)是特别令人感兴趣的。如wo 2008/113089中所述，14-o-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)-硫烷基]-乙酰基}-莫林是特别有用的化合物，因为它们具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的活性。
[0006]
衍生自截短侧耳素的药物活性化合物(半合成化合物)是细菌中核糖体蛋白合成的抑制剂。用于人类使用的半合成截短侧耳素类化合物的代表是瑞他莫林(retapamulin)(批准为)，一种批准用于短期治疗脓疱病和感染的小裂伤、擦伤或缝合伤口的局部药物，以及用于治疗患有社区获得性细菌性肺炎(cabp)的成人的来法莫林(lefamulin)(批准为)。泰妙菌素(tiamulin)和伐奈莫林(valnemulin)是另外两种半合成的截短侧耳素衍生物，多年来一直在兽医学中作为抗生素全身使用。
144108621.html获得，于2020年6月10日下载)以及2020年5月11日的新闻稿(https://investors.nabriva.com/news-releases/news-release-details/nabriva-therapeutics-reports-first-quarter-2020-financial，于2020年5月28日下载)中，做出了关于来法莫林的潜在抗病毒和抗炎作用的某些陈述。


技术实现要素：

[0016]
出人意料的是，现在发现wo 2008/113089 a1中公开的截短侧耳素衍生物对病毒有效，并且因此对病毒介导的疾病有效。
[0017]
因此，在第一方面，本发明涉及如权利要求1至6所定义的化合物，特别是来法莫林，或其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药或代谢物，用于在治疗或预防由病毒介导的疾病中特定使用。
[0018]
在另一方面，本发明涉及治疗或预防由病毒介导的疾病的方法，包括向需要这样的治疗的受试者施用如权利要求1至6中任一项所定义的化合物，特别是来法莫林，或其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药或代谢物。
附图说明
[0019]
图1展示了来法莫林在病毒感染后6天对mrc-5细胞中的α冠状病毒229e(hcov-229e)的影响。
[0020]
图2展示了泰妙菌素在同一试验中的影响。
[0021]
图3展示了瑞德西韦(remdesivir)在同一试验中的影响。
[0022]
图4展示了来法莫林在病毒感染后6天对hep2细胞中a型呼吸道合胞病毒的影响。
[0023]
图5展示了泰妙菌素在同一试验中的影响。
[0024]
图6展示了tmc353121在同一试验中的影响。
[0025]
图7a至7d展示了来法莫林和奥司他韦(oseltamivir)对流感感染小鼠模型中临床体征的影响，特别是对体重(a)、临床评分(b)、存活百分比(c)和肺样品组织病理学评分(d)的影响。
[0026]
图8展示了来法莫林和奥司他韦对流感感染小鼠模型中肺病毒滴度的影响，确定为mdck细胞中的50％组织培养感染剂量(tcid
50
)。
具体实施方式
[0027]
来法莫林是用于通式(i)的化合物的inn，更特别地，来法莫林是式(vii)的化合物
[0028]
[0029]
即14-o-{[(1r,2r,4r)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]-乙酰基}-莫林(也称为“bc 3781”)。
[0030]
在下文中，当一般使用而没有额外解释时，术语“来法莫林”旨在包括游离碱形式的来法莫林，以及它的盐和溶剂合物。
[0031]
来法莫林已被开发用于在人类中全身使用以治疗严重细菌感染，并于2019年在美国被批准用于医疗用途，以治疗患有社区获得性细菌性肺炎(cabp)的成人。
[0032]
本发明涉及由病毒介导的疾病(例如病毒性疾病或病毒感染)的治疗和预防。
[0033]
实验结果表明，除了其抗菌活性外，来法莫林还积极降低不同病毒介导的致细胞病变效应。对以为正义或负义单链rna病毒为特征的此类病毒特别显示出了这种抗病毒作用。对有包膜病毒和无包膜病毒二者显示出抗病毒活性，特别是几种有包膜的正义或负义单链rna病毒(例如冠状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科和黄病毒科)。此外，已知所研究的病毒中的一些(包括麻疹病毒)会通过呼吸途径传播，特别是空气传播。冠状病毒和呼吸道合胞病毒也会引起人类呼吸道感染。
[0034]
在本发明的一个优选实施方案中，病毒是正义或负义单链rna病毒，
[0035]
优选地，病毒选自由以下各项组成的组：
[0036]-冠状病毒科，特别包括人类冠状病毒，
[0037]-副粘病毒科，特别包括副粘病毒亚科，例如麻疹病毒，和肺病毒亚科，例如呼吸道合胞病毒，
[0038]-正粘病毒科，特别包括流感病毒，
[0039]-黄病毒科，特别包括登革病毒和寨卡病毒，和
[0040]-小核糖核酸病毒科，特别包括鼻病毒。
[0041]
在另一个实施方案中，疾病是空气传播疾病。空气传播疾病由空气传播病毒介导。
[0042]
病毒感染会影响各种器官。在本发明的一个优选实施方案中，疾病是呼吸疾病，包括上呼吸道感染和下呼吸道感染，特别是下呼吸道感染。
[0043]
特别地，疾病是急性呼吸综合征，例如流感、严重急性呼吸综合征(sars)、中东呼吸综合征(mers)或covid-19。
[0044]
在本发明的另一个实施方案中，疾病由选自由以下病毒科病毒组成的组的病毒介导：冠状病毒科，特别是冠状病毒，例如sars-cov、sars-cov2、mers-cov或hcov-229e，正粘病毒科，特别是流感病毒，例如甲型流感病毒和乙型流感病毒，副粘病毒科，特别是呼吸道合胞病毒，以及腺病毒科，特别是腺病毒。
[0045]
在一个实施方案中，病毒是冠状病毒，特别是选自由以下各项组成的组：sars-cov、sars-cov2、mers-cov和hcov-229e以及其突变体。已知此类冠状病毒会引起(严重)急性呼吸综合征，例如sars、mers或covid-19。
[0046]
如本文所理解的，治疗(treating、treatment或to treat)一方面包括完全治愈(curing、curation或to cure)病症(由病毒介导的疾病)以使其结束，并且另一方面还包括改善(ameliorating、amelioration或to ameliorate)病症，使得其症状至少部分或个别减轻。
[0047]
治疗通常包括将根据本发明使用的化合物施用于有此需要的受试者，即被诊断为患有由病毒介导的疾病的受试者。
[0048]
预防(preventing、prevention或to prevent)包括在诊断出病症之前或在病症的(所有)疾病症状发作之前施用化合物。
[0049]
预防由病毒介导的疾病包括在疾病症状发作之前施用化合物。在受试者已感染病毒但尚未表现出任何症状，或在其中受试者已暴露于病毒和/或易于暴露于病毒的情况下，可考虑预防。
[0050]
根据本发明施用的化合物、特别是来法莫林的适当剂量当然会根据例如个体宿主、施用方式以及所治疗病症的性质和严重程度而变化。然而，一般而言，为了在较大的哺乳动物例如人类中获得令人满意的结果，指示的日剂量在约0.5mg至3g的根据本发明使用的化合物的范围内，其以例如每天最多达四次的分剂量方便地施用。
[0051]
根据本发明使用的化合物可以通过任何常规途径施用，例如肠内，例如包括鼻、颊、直肠、口服施用；肠胃外，例如包括静脉内、肌肉内、皮下施用；或局部，例如包括肺部、表皮、鼻内、气管内施用，例如以包衣或未包衣的片剂、胶囊剂、可注射溶液剂或混悬剂的形式，例如以安瓿、小瓶的形式，以软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、吸入粉剂、泡沫剂、酊剂、唇膏剂、滴剂、喷雾剂的形式，或以栓剂的形式，例如以类似于抗生素制剂妥布霉素或大环内酯类，例如红霉素，例如克拉霉素或阿奇霉素的方式。
[0052]
优选地，根据本发明使用的化合物通过吸入、通过静脉内或皮下注射或口服施用。
[0053]
注射用来法莫林的优选药物组合物公开于wo 2016/202788 a1中，其内容通过引用并入本文。
[0054]
根据本发明使用的化合物，特别是来法莫林，可以以药学上可接受的盐的形式(例如酸加成盐)或游离形式，任选地以溶剂合物形式施用。
[0055]
在一个实施方案中，化合物为盐和/或溶剂合物的形式。
[0056]
根据本发明使用的化合物的盐包括酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐包括根据本发明使用的化合物与酸的盐，例如富马氢酸、富马酸、酒石酸、乙烷-1,2-二磺酸、马来酸、萘-1,5-磺酸、乙酸、苹果酸、乳酸(即l-乳酸)、琥珀酸、水杨酸、壬二酸、2-[(2,6-二氯苯基)氨基]苯乙酸、氢氯酸、氘氯酸，优选氢氯酸、乙酸、l-乳酸和马来酸。
[0057]
其中，在来法莫林的情况下，尤其优选来法莫林的乙酸盐。
[0058]
优选的来法莫林结晶形式以及来法莫林结晶盐形式公开在wo 2011/146954 a1中，其内容通过引用并入本文。其中，尤其优选如wo 2011/146954 a1中公开的晶型b的来法莫林乙酸盐。
[0059]
本发明还提供了作为与衣康酸的酸加成盐形式的来法莫林，特别是来法莫林衣康酸盐。来法莫林衣康酸盐在本文中公开为一种新化合物(实施例12)。衣康酸可以去质子化为阴离子衣康酸氢盐和衣康酸盐。包含来法莫林作为阳离子和来源于衣康酸的阴离子的酸加成盐预期可用作抗病毒剂。
[0060]
根据本发明使用的化合物，特别是来法莫林，可以单独使用或与一种或多种其它药物活性剂组合使用用于本文所设想的药物治疗。这样的其它药物活性剂包括例如其它抗病毒剂。这样的其它抗病毒剂可以优选地选自由以下各项组成的组：核苷和核苷酸类似物以及rna聚合酶抑制剂，例如瑞德西韦(remdesivir)或利巴韦林(ribavirin)，病毒蛋白酶抑制剂，例如洛匹那韦(lopinavir)或利托那韦(ritonavir)，病毒神经氨酸酶抑制剂，例如奥司他韦(oseltamivir)，以及用于抗病毒治疗的其它药物，例如羟氯喹、干扰素(干扰素α
和/或β)或其它广谱抗病毒剂。
[0061]
组合包括固定组合，其中两种或更多种药物活性剂在同一制剂中；试剂盒，其中分开的制剂中的两种或更多种药物活性剂在同一个包装中销售，例如具有用于共施用的说明书；以及自由组合，其中各药物活性剂分开包装，但提供用于同时或顺序施用的说明书。
[0062]
包含根据本发明使用的化合物，特别是来法莫林的药物组合物可以另外包含至少一种药学上可接受的辅料，例如载体或稀释剂，例如包括填充剂、粘合剂、崩解剂、流动调节剂、润滑剂、糖和甜味剂、香料、防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。
[0063]
此类药物组合物可以根据(例如类似地)常规方法制造，例如通过混合、制粒、包衣、溶解、喷雾干燥或冻干工艺。单位剂型可以包含例如约0.5mg至约3000mg，例如10mg至约600mg。
[0064]
本发明所考虑的需要治疗的受试者可以是患有由病毒介导的疾病的任何活受试者。特别地，受试者可以是人或动物。
[0065]
实施例
[0066]
在包括实施例在内的本文中，使用了以下缩写：
[0067]1h-nmr
ꢀꢀꢀꢀ
质子核磁共振波谱
[0068]
℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摄氏度
[0069]
μm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微摩尔浓度
[0070]
balb/c
ꢀꢀꢀꢀ
实验室培育的小鼠品系
[0071]
bc-3781
ꢀꢀꢀ
来法莫林
[0072]
cc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
细胞对照
[0073]
cov
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
冠状病毒
[0074]
cpe
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
致细胞病变效应，特别是病毒诱导的
[0075]
dmem
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
dulbecco改良eagle培养基
[0076]
dmf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n,n-二甲基甲酰胺
[0077]
dmso
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲亚砜
[0078]
ec
50
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
半数最大(百分之五十)有效浓度
[0079]
eq
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
当量
[0080]
fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
胎牛血清
[0081]
hela
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
永生人上皮细胞系
[0082]
hep2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
人上皮细胞系
[0083]
huh7
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
人肝细胞系
[0084]
mdck
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
madin-darby犬肾细胞
[0085]
moi
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
感染复数
[0086]
mrc-5
ꢀꢀꢀꢀꢀ
医学研究委员会细胞株5
[0087]mꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摩尔浓度
[0088]
ms
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
质谱法
[0089]
m/z
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
质荷比
[0090]
mtbe
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
甲基叔丁基醚
[0091]
nm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
纳米
[0092]
tc
50
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
半数最大(百分之五十)毒性浓度
[0093]
tcid
50
ꢀꢀꢀꢀꢀ
百分之五十(半数最大)组织培养感染剂量
[0094]
vc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
病毒cpe降低
[0095]
xtt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2h-四唑鎓-5-羧酰苯胺
[0096]
实施例1
[0097]
目的：该测定法测量了多种浓度的来法莫林(bc-3781)对病毒感染后6天mrc-5细胞中α冠状病毒229e(hcov-229e或cov
229e
)后病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0098]
方法：将mrc-5细胞接种在96孔平底组织培养板中(密度为每孔3
×
103个细胞)并使其贴壁过夜。此后，将溶解在dmso中的稀释的测试化合物(作为乙酸盐的来法莫林，作为富马酸盐的泰妙菌素)添加到板中并在添加病毒之前孵育4小时。添加病毒稀释至预定滴度，以在感染后6天产生85-95％的细胞杀伤(moi为0.001)。
[0099]
在37℃和5％ co2下孵育6天后，通过xtt四唑鎓染料染色测量细胞活力。在450和650nm处通过分光光度法测量细胞培养板的光密度。计算病毒感染细胞的减少百分比和未感染药物对照孔的细胞活力百分比，以使用四参数曲线拟合分析确定抑制50％致细胞病变效应的有效浓度(ec
50
)和细胞毒性浓度(tc
50
)。抗病毒化合物瑞德西韦作为阳性对照。
[0100]
结果：
[0101]
出人意料地，来法莫林在10μm的浓度下将病毒cpe降低了91.82％，该浓度是对细胞对照的活力没有细胞毒性作用的浓度。计算出的ec
50
为3.87μm，此时50％的病毒致细胞病变效应被抑制。在50μm的来法莫林浓度下，来法莫林表现出细胞毒性作用；计算出的tc
50
为55.3μm。ec
50
和tc
50
的比值(也称为治疗指数)为14.3。
[0102]
相比之下，10μm浓度的泰妙菌素仅将病毒cpe降低了10.53％，并且未观察到细胞毒性作用。在下一个更高的50μm的测试浓度下，cpe降低了81.68％，并且观察到了细胞毒性作用。计算出的ec
50
为24.4μm，并且计算出的tc
50
为62.9μm。泰妙菌素的治疗指数为2.58，并且出人意料地远低于来法莫林。
[0103]
抗病毒化合物瑞德西韦被开发用于治疗埃博拉病毒，并且还已知对冠状病毒具有抗病毒活性(临床研究正在进行中)。因此，瑞德西韦在本文中用作阳性对照。瑞德西韦显示出ec
50
为0.11μm，tc
50
》5，并且治疗指数》45.5。
[0104][0105][0106]
结果以图形方式显示在图1(来法莫林)、2(泰妙菌素)和3(瑞德西韦)中(vc
…
病毒cpe降低，cc
…
细胞对照)。
[0107]
实施例2：
[0108]
目的：该测定法测量了多种处理条件下来法莫林对mrc-5细胞中α冠状病毒229e(hcov-229e或cov
229e
)后病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0109]
方法：该测定法类似于上面的实施例1进行，但关于测试候选物具有以下不同。使用在病毒添加前孵育4小时、1小时或0小时以及感染后1小时添加的不同处理条件评估来法莫林(作为乙酸盐)。对于该特定实验组，将冠状病毒在测定培养基中1:200稀释，并以100μl/孔添加，以在未处理的病毒对照孔中实现约90％的细胞杀伤(moi为0.001)。
[0110]
结果：
[0111]
下表总结了抗病毒功效和细胞毒性数据。来法莫林对病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制显示出时间依赖性作用。在病毒暴露后的处理环境中(感染后1小时)，观察到剂量依赖性效应。在50μm浓度下，病毒cpe降低了86.83％(数据未详细显示)。
[0112][0113]
实施例3
[0114]
目的：该测定法测量了多种浓度的来法莫林(bc-3781)对病毒感染后6天hep2细胞中人呼吸道合胞病毒(rsv
a2
株)复制后病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0115]
方法：将hep2细胞接种在96孔平底组织培养板中(密度为每孔5
×
103个细胞)并使其贴壁过夜。此后，将dmso中稀释的测试化合物(作为乙酸盐的来法莫林，作为富马酸盐的泰妙菌素)添加到板中并在添加病毒之前孵育4小时。添加病毒稀释至预定滴度，以在感染后6天产生85-95％的细胞杀伤(moi为0.001)。
[0116]
在37℃和5％ co2下孵育6天后，通过xtt四唑鎓染料染色测量细胞活力。在450和650nm处通过分光光度法测量细胞培养板的光密度。计算病毒感染细胞的减少百分比和未感染药物对照孔的细胞活力百分比，以使用四参数曲线拟合分析确定抑制50％致细胞病变效应的有效浓度(ec
50
)和细胞毒性浓度(tc
50
)。抗病毒化合物tmc353121(rsv融合抑制剂)用作阳性对照。
[0117]
结果：
[0118]
出人意料地，来法莫林在10μm和50μm的浓度下分别将病毒致细胞病变效应(cpe)降低了92.17％和100％，这些是对细胞对照的活力没有细胞毒性作用的浓度。计算出的ec
50
为5.34μm，此时50％的病毒cpe被抑制。在100μm的来法莫林浓度下，来法莫林表现出细胞毒性作用；计算出的tc
50
为70.7μm。ec
50
和tc
50
的比值(也称为治疗指数)为13.2。
[0119]
相比之下，10μm浓度的泰妙菌素仅将病毒cpe降低了16.76％，并且在该浓度下观察到了细胞毒性作用(84％的存活率)。在下一个更高的50μm的测试浓度下，病毒cpe降低了43.28％，并且细胞毒性作用更明显(70.0％存活率)。计算出的ec
50
》67.9μm，高于计算出的
67.9μm的tc
50
。因此无法计算泰妙菌素的治疗指数。出人意料地，来法莫林的抗病毒活性和治疗指数远高于泰妙菌素。
[0120]
抗病毒化合物tmc353121被开发为特异性呼吸道合胞病毒融合抑制剂(临床研究正在进行中)。因此，tmc353121在本文中用作阳性对照。tmc353121显示出ec
50
为0.006μm，tc
50
》0.1μm，并且治疗指数》167。
[0121][0122]
结果以图形方式显示在图4(来法莫林)、5(泰妙菌素)和6(tmc353121)中(vc
…
病毒cpe降低，cc
…
细胞对照)。
[0123]
实施例4
[0124]
目的：该测定法测量了改变感染复数(moi)对hep2细胞中人呼吸道合胞病毒(rsv
a2
株)复制后病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0125]
方法：该测定法类似于上面的实施例3进行，但关于测试具有以下不同。添加病毒稀释至预定滴度，以在感染后6天产生85-95％的细胞杀伤，并且采用分别获得0.003、0.001、0.0008和0.0004moi的添加量。在本研究中研究了来法莫林(作为乙酸盐)以及作为阳性对照的tmc353121。
[0126]
结果：
[0127]
下表总结了抗病毒功效和细胞毒性数据。来法莫林在低μm范围内的ec
50
值在0.0004的moi下重现。相比之下，较高的moi，因此相对于所研究细胞较高的病毒载量，降低了来法莫林的抗病毒作用。这种影响在高效对照物质tmc353121中不太明显。
[0128]
[0129][0130]
实施例5
[0131]
目的：该测定法测量了两种不同呼吸道合胞病毒株rsv a
long
和rsv b
18537
在hep2细胞中复制后病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0132]
方法：该测定法类似于上面的实施例3进行，不同之处在于，在用不同浓度的测试化合物进行4小时细胞预处理后，将以每孔5
×
103个细胞的密度接种的细胞分别与病毒株rsv a
long
或rsv b
18537
一起孵育。将病毒稀释并以对于rsv a
long
和rsv b
18537
分别产生0.01和0.001的moi的量添加。
[0133]
结果：
[0134]
下表总结了抗病毒功效和细胞毒性数据。对照化合物tmc353121与来法莫林平行进行评估，并且对所研究的rsv a和rsv b株产生了0.01nm的ec
50
值。来法莫林对rsv b
18537
产生了17.7μm的ec
50
值。由于对hep2细胞的细胞毒性，可能无法确定对rsv a
long
的活性，测定中的tc
50
值为71.1μm。
[0135][0136][0137][0138]
实施例6
[0139]
目的：该测定法测量了麻疹病毒株edmonston在hela细胞中复制期间病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0140]
方法：将hela细胞接种在96孔平底组织培养板中(密度为每孔5
×
103个细胞)并使其贴壁过夜。此后，将稀释的测试化合物(作为乙酸盐的来法莫林，作为对照的利巴韦林)添加到板中并在添加病毒之前孵育4小时。添加病毒稀释至预定滴度，以在感染后6天产生85-95％的细胞杀伤(1:50稀释，moi为0.008)。
[0141]
如实施例1和3中所述进行细胞活力测定以及ec
50
和tc
50
计算。
[0142]
结果：
[0143]
下表总结了抗病毒功效和细胞毒性数据。利巴韦林作为对照化合物与来法莫林平行进行评估，并且产生了1.88μg/ml的ec
50
值。出人意料地，来法莫林产生了甚至更低的ec
50
值，为0.89μm，并且计算出的ti高达81.7。
[0144][0145]
实施例7
[0146]
目的：该测定法测量了登革病毒株denv2
new guinea
在huh7细胞中复制期间病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0147]
方法：将huh7细胞接种在96孔平底组织培养板中(密度为每孔5
×
103个细胞)并使其贴壁过夜。此后，将稀释的测试化合物(作为乙酸盐的来法莫林，作为对照的利巴韦林)添加到板中并在添加病毒之前孵育4小时。登革病毒株denv2
new guinea
获自atcc(vr-1584)，并在恒河猴肾细胞中生长用于生产原种病毒库。添加病毒稀释至预定滴度，以在感染后6天产生85-95％的细胞杀伤(moi为0.001)。
[0148]
如实施例1和3中所述进行细胞活力测定以及ec
50
和tc
50
计算。
[0149]
结果：
[0150]
下表总结了抗病毒功效和细胞毒性数据。利巴韦林作为对照化合物与来法莫林平行进行评估，并且产生了4.73μg/ml的ec
50
值。来法莫林产生了6.79μm的ec
50
值。利巴韦林和来法莫林二者分别在48.5μg/ml和23.3μm的浓度下对该特定细胞系表现出一定的细胞毒性。
[0151][0152]
实施例8
[0153]
目的：该测定法测量了在4小时细胞预处理后，寨卡病毒株zikv
prvabc59
在huh7细胞中复制期间病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0154]
方法：将huh7细胞接种在96孔平底组织培养板中(密度为每孔5
×
103个细胞)并使其贴壁过夜。此后，将稀释的测试化合物(作为乙酸盐的来法莫林，作为对照的索非布韦(sofosbuvir))添加到板中并在添加病毒之前孵育4小时。获自atcc(目录vr-1843)的寨卡病毒株prvabc59从atcc(vr-1584)获得，并在恒河猴肾细胞中生长用于生产原种病毒库。添加病毒稀释至预定滴度，以在感染后6天产生85-95％的细胞杀伤(moi为0.001)。
[0155]
如实施例1和3中所述进行细胞活力测定以及ec
50
和tc
50
计算。
[0156]
结果：
[0157]
下表总结了抗病毒功效和细胞毒性数据。对照化合物索非布韦与来法莫林平行进行评估，并且产生了0.65μg/ml的ec
50
值。来法莫林产生了2.78μm的ec
50
值，计算出的治疗指数为8.42。
[0158][0159]
实施例9
[0160]
目的：该测定法测量了在4小时细胞预处理后，人鼻病毒株hrv16株11757在h1-hela细胞中复制期间病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0161]
方法：将h1-hela细胞接种在96孔平底组织培养板中(密度为每孔5
×
103个细胞)并使其贴壁过夜。此后，将稀释的测试化合物(作为乙酸盐的来法莫林，作为对照的芦平曲韦(rupintrivir))添加到板中并在添加病毒之前孵育4小时。添加病毒hrv16
11757
稀释至预定滴度以在未处理的病毒对照孔中产生85-95％的细胞杀伤(moi为0.0005)。
[0162]
如实施例1和3中所述进行细胞活力测定以及ec
50
和tc
50
计算。
[0163]
结果：
[0164]
芦平曲韦是一种为治疗鼻病毒而开发的蛋白酶抑制剂，对其平行进行评估并产生了4.90nm的ec
50
值。来法莫林产生了9.34μm的ec
50
值，计算出的治疗指数为2.58。
[0165][0166]
实施例10
[0167]
目的：该测定法测量了在4小时细胞预处理后，流感病毒株a/pr/8/34在mdck细胞中复制期间病毒诱导的致细胞病变效应(cpe)的抑制和细胞活力。
[0168]
方法：将mdck细胞接种在96孔平底组织培养板中(密度为每孔5
×
103个细胞)并使其贴壁过夜。此后，将稀释的测试化合物(作为乙酸盐的来法莫林，作为对照的奥司他韦)添加到板中并在添加病毒之前孵育4小时。添加流感病毒株a/pr/8/34稀释至预定滴度以在未处理的病毒对照孔中产生90％的细胞杀伤(moi为0.0004)。
[0169]
如实施例1和3中所述进行细胞活力测定以及ec
50
和tc
50
计算。
[0170]
结果：
[0171]
对作为已建立的流感药物的奥司他韦进行了平行评估，并产生了0.06μm的ec
50
值。来法莫林在大于23μm的浓度下对mdck细胞具有细胞毒性。在5μm来法莫林下测量到对流感介导的cpe的最大抑制18.4％。因此，并且由于在50μm下观察到细胞毒性，无法确定来法莫林的ec
50
。然而，在使用相关的小鼠适应甲型流感株(甲型流感/puerto rico/8/34(h1n1))
的流感感染小鼠模型中观察到体内活性(参见下文实施例11)。
[0172][0173][0174]
实施例11
[0175]
目的：在体内流感病毒感染模型中研究来法莫林的作用。在流感病毒模型中，用适应于小鼠的甲型流感(h1n1)株攻击小鼠。
[0176]
方法：将成年雌性balb/c小鼠随机分配到三个实验组，每组15只动物，并让其适应1周。从第-1天开始通过皮下施用进行治疗。阴性对照组接受每天施用两次的溶媒。在不同的剂量下研究了来法莫林。在低剂量方案中，从第-1天到第6天，每天两次施用35mg/kg来法莫林(相当于70mg/kg/天的剂量)。在高剂量方案中，在三次注射中以105/mg/kg/天的剂量施用来法莫林直到第3天，并且由于注射部位的施用问题，从第3天开始改变。接下来的剂量为每天两次施用70mg/kg(相当于140mg/kg/天)。在第0天，所有组用甲型流感/puerto rico/8/34(h1n1)进行攻击。
[0177]
在研究期间，每天对动物的流感病毒感染的临床体征进行评分，包括异常毛发状况(竖毛)、异常姿势(驼背)、异常呼吸(快速和/或不规则的呼吸频率)、活动性降低、眼黏分泌物(ocular discharged)、眼睛闭合和/或存活。将疾病严重程度的体征添加到评分系统中，产生最高可能的5分。当临床体征被判断为严重时，在预定的研究结束之前将个体动物从研究中取出。
[0178]
在第6天，解剖肺组织，评估总病理学，保存在固定液中并储存用于组织病理学。
[0179]
在宏观评估后肺实变评分如下：》50％(所有肺叶中)视野被肺泡内水肿/出血占据；广泛的血管变性。将在第6天取出并固定的肺在组织病理学中进行显微镜评估。评估了四个主要读数(支气管/细支气管变性/增生、支气管-间质炎症、肺泡炎症/变性、肺泡水肿/出血)并进行评分，得出的最大总组织病理学评分为16，其中较小的数字表示较少的组织病理学异常迹象。
[0180]
还对肺样品进行处理并储存用于第3天和第6天的病毒滴度。在第3天和第6天，收集肺，均质化并澄清以通过对madin-darby犬肾(mdck)细胞进行tcid
50
测定来确定病毒载量。
[0181]
结果：
[0182]
临床监测的结果如图7a至7d所示。使用奥司他韦的阳性对照治疗如预期的起作用。对奥司他韦观察到临床评分和体重减轻有所降低。来法莫林在所研究的剂量下对体重没有显著影响(图7a)。在高剂量，与溶媒相比，来法莫林导致临床评分增加和存活率降低，这可能与所研究剂量、浓度和制剂的局部耐受性(sc)问题有关(图7b和c)。使用较低剂量的来法莫林，实现了90％的存活率，而仅20％的溶媒组存活直到第6天(图7c)。
[0183]
此外，对于低剂量来法莫林，观察到宏观评估的肺实变的显著改善。在组织病理学中，个体动物的总体评分范围(4-13范围)在检查的标本中是明显的(图7d)。病变与文献中
描述的相似。肺泡病变的严重程度/分布区域增加与细支气管变性/增殖、支气管间质炎症和肺泡水肿/出血的增加相关。使用高剂量来法莫林治疗导致支气管变性和肺泡炎症显著降低，导致该组的组织病理学评分与溶媒处理的对照组相比总体显著降低，并且与奥司他韦相当。
[0184]
在第3天和第6天之间，所有组的肺病毒滴度均下降(图8)。与溶媒处理的对照相比，两种剂量的来法莫林和奥司他韦均导致肺病毒滴度降低。
[0185]
临床读数和对肺病毒滴度的降低作用进一步支持了来法莫林在治疗病毒性疾病中的潜力。
[0186]
实施例12
[0187]
目的：本实施例旨在合成来法莫林衣康酸盐作为一种潜在的新活性药物成分，其包含质子化形式的来法莫林作为阳离子，以及衣康酸根作为衍生自二羧酸衣康酸的阴离子。
[0188]
方法和结果：
[0189]
向作为游离碱的来法莫林(1g，1eq)在dmf(2ml)中的溶液中加入衣康酸(0.5eq)并在室温下搅拌过夜。将所得反应混合物逐滴加入到mtbe中。将获得的沉淀过滤，用mtbe洗涤并在减压干燥，得到无色固体形式的来法莫林衣康酸盐(1.20g)。
[0190]1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δ,ppm,特征信号,莫林编号系统描述在berner,h.；schulz,g.；schneider h.tetrahedron 1980,36,1807-1811)中:6.15(dd,1h,h-19,j＝17.6,11.2hz),5.63(s,0.5h,衣康酸盐),5.55(d,1h,h-14,j＝8.0hz),5.25-5.00(m,2.5h,h-20,衣康酸盐),3.55和3.29(ab,2h,h-22,j＝15.2hz),3.43(d,1h,h-11,j＝5.6hz),3.05(s,1h,衣康酸盐),1.37(s,3h,ch
3-15),1.06(s,3h,ch
3-18),0.82(d,3h,ch
3-17,j＝7.2hz),0.63(d,3h,ch
3-16,j＝6.8hz)。
[0191]
ms m/z:508[m+h
+
],552[m+hcoo-]。