人类巨细胞病毒疫苗的制作方法

背景技术：

1、巨细胞病毒(cmv)是疱疹病毒科病毒的成员。cmv主要通过接触感染性粘膜分泌物或在子宫内获得，并且在初次感染后建立潜伏期。总体而言，美国cmv血清盛行率为50.4％，但在资源贫乏地区据报告比率为60％至100％。

2、cmv是最常见的先天性病毒感染，因为其每年影响美国30,000至40,000名婴儿(活产婴儿的0.6％至2％)。尽管妊娠早期的先天性cmv感染与最不利的妊娠结果相关，但症状性先天性cmv可能由妊娠期间任何时间的感染引起。妊娠期间患有原发性cmv感染的母亲中的约30％至35％将所述病毒传递至胎儿；这些新生儿中的12％将患有症状性疾病，并且约4％将在生命第一年死亡。另外，出生时有症状的cmv感染婴儿中约一半将产生晚期并发症，例如智力障碍、感觉神经性听力损失和发育迟缓。由于先天性cmv感染对儿童健康的显著影响，2017年美国国家医学研究院报告(institute of medicine report)将开发用于预防先天性cmv感染的cmv疫苗列为其最高优先类别。

3、在实体器官或造血干细胞移植后长期服用免疫抑制药物的个体中，引起移植排斥或终末器官疾病的cmv感染与高死亡率相关。在美国，每年约有30,000名成人接受实体器官移植并且有22,000名接受造血细胞移植。总体而言，接受抗病毒防治的实体器官移植患者中的8％至40％和接受抗病毒防治的造血细胞移植患者中的3％至6％将因cmv而产生移植后并发症。移植接受者中cmv感染的主要并发症包括移植组织的急性或慢性排斥和侵袭性疾病，例如结肠炎、肝炎和脑炎。

技术实现思路

1、一个重要的未满足的医疗需求是用于预防先天性cmv感染的安全且有效的方法。另一个未满足的医疗需求是预防在实体器官或造血干细胞移植后长期服用免疫抑制药物的个体的cmv感染。

2、基于信使核糖核酸(mrna)的疫苗平台已根据以下原理和观察结果开发：靶标病毒蛋白或抗原可通过递送和细胞摄取相应合成病毒mrna而在体内产生，所述相应合成病毒mrna来自配制于脂质纳米粒子中的免疫原性组合物的递送。所述mrna然后进行细胞内核糖体翻译以内源性表达由包含合成病毒mrna的疫苗免疫原性组合物编码的病毒蛋白抗原。这些基于mrna的疫苗不进入细胞核或与人类基因组相互作用，是非复制性的，并且短暂表达。因此，mrna疫苗和免疫原性组合物提供如下机制，其以精确模拟野生型病毒感染并且能够诱导针对感染性病原体如cmv的高度靶向免疫反应的方式刺激结构完整、正确折叠并且经人类糖基化的病毒糖蛋白和蛋白抗原的内源性产生。

3、本公开的方面涉及hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物包含(a)包含编码hcmv gh多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)多核苷酸；(b)包含编码hcmv gl多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(c)包含编码hcmv ul128多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(d)包含编码hcmv ul130多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(e)包含编码hcmvul131a多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；和(f)包含编码hcmv gb多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸，其中：

4、所述免疫原性组合物中(a):(f)的摩尔比为约1:1；所述免疫原性组合物中(b):(c):(d):(e)的摩尔比为约1:1:1:1；并且所述免疫原性组合物中(a)和(f)中每一者与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1。

5、在一些实施方案中，(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2。

6、在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物维持液体制剂形式直至用于向患者施用。在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物维持冻干制剂形式直至用于向患者施用。

7、在一些实施方案中，当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hcmv免疫原性组合物稳定至少三个月。在一些实施方案中，当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hcmv免疫原性组合物稳定至少十二至十八个月。在一些实施方案中，当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hcmv免疫原性组合物稳定至少二十四个月。在一些实施方案中，当储存在约5℃的温度下时，所述hcmv免疫原性组合物稳定至少三个月。在一些实施方案中，当储存在约5℃的温度下时，所述hcmv免疫原性组合物稳定至少十二至十八个月。在一些实施方案中，当储存在约5℃的温度下时，所述hcmv免疫原性组合物稳定至少二十四个月。

8、在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物具有增加的稳定性。在一些实施方案中，当在大于0℃且小于或等于10℃的温度下储存至少三个月时，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物具有增加的稳定性。在一些实施方案中，当在大于0℃且小于或等于10℃的温度下储存至少二十四个月时，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物具有增加的稳定性。

9、在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物具有增加的五聚体表达。在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物诱导增加的五聚体抗体水平。在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物具有增加的gb表达。在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致等质量存在的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物诱导增加的gb抗体水平。

10、在一些实施方案中，将(a)-(f)的mrna多核苷酸以足以在受试者中诱导针对hcmv或hcmv抗原的抗原特异性免疫反应的量配制于至少一种脂质纳米粒子中。在一些实施方案中，将(a)-(f)的mrna多核苷酸以足以在受试者中诱导针对hcmv或hcmv抗原的抗原特异性免疫反应的量配制于至少一种脂质纳米粒子中并冻干。

11、在一些实施方案中，(a)-(f)的mrna多核苷酸中的至少一者包含化学修饰。在一些实施方案中，mrna多核苷酸(a)-(f)的开放阅读框中尿嘧啶的至少80％具有选自n1-甲基-假尿苷或n1-乙基-假尿苷的化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰在尿嘧啶的碳5位置处。在一些实施方案中，(a)-(f)的mrna多核苷酸中的至少一者还包含至少一个5'末端帽，即7mg(5')ppp(5')n1mpnp。

12、在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含：可离子化氨基脂质；胆固醇；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)；和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(dmg-peg)。在一些实施方案中，所述可离子化氨基脂质包含化合物i：

13、

14、在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含20-60mol％可离子化氨基脂质、25-55mol％胆固醇、5-25mol％dspc和0.5-15mol％dmg-peg。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含45-55mol％可离子化氨基脂质、35-40mol％胆固醇、5-15mol％dspc和1-2mol％dmg-peg。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含50mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、10mol％dspc和1.5mol％dmg-peg。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含49mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、10mol％dspc和2.5mol％dmg-peg。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含48mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、11mol％dspc和2.5mol％dmg-peg。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含47mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、11.5mol％dspc和3mol％dmg-peg。

15、在一些实施方案中，mrna(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mrna(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，mrna(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mrna(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少30％。在一些实施方案中，mrna(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mrna(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少40％。在一些实施方案中，mrna(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mrna(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少50％。

16、在一些实施方案中，编码hcmv gh蛋白的mrna包含与seq id no:5序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hcmv gl蛋白的mrna包含与seq id no:6序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hcmv ul128蛋白的mrna包含与seq idno:2序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hcmv ul130蛋白的mrna包含与seq id no:3序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hcmv ul131a蛋白的mrna包含与seq id no:4序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，和/或编码hcmv gb蛋白的mrna包含与seq id no:1序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

17、在一些实施方案中，编码hcmv gh蛋白的mrna包含seq id no:5序列的核苷酸序列，编码hcmv gl蛋白的mrna包含seq id no:6序列的核苷酸序列，编码hcmv ul128蛋白的mrna包含seq id no:2序列的核苷酸序列，编码hcmv ul130蛋白的mrna包含seq id no:3序列的核苷酸序列，编码hcmv ul131a蛋白的mrna包含seq id no:4序列的核苷酸序列，和/或编码hcmv gb蛋白的mrna包含seq id no:1序列的核苷酸序列。

18、在一些实施方案中，编码hcmv gh多肽的开放阅读框包含与seq id no:11的序列具有至少90％同一性的序列，编码hcmv gl多肽的开放阅读框包含与seq id no:12的序列具有至少90％同一性的序列，编码hcmv ul128多肽的开放阅读框包含与seq id no:8的序列具有至少90％同一性的序列，编码hcmv ul130多肽的开放阅读框包含与seq id no:9的序列具有至少90％同一性的序列，编码hcmv ul131a多肽的开放阅读框包含与seq id no:10的序列具有至少90％同一性的序列，和/或编码hcmv gb多肽的开放阅读框包含与seq idno:7的序列具有至少90％同一性的序列。

19、在一些实施方案中，编码hcmv gh多肽的开放阅读框包含seq id no:11，编码hcmvgl多肽的开放阅读框包含seq id no:12，编码hcmv ul128多肽的开放阅读框包含seq idno:8，编码hcmv ul130多肽的开放阅读框包含seq id no:9，编码hcmv ul131a多肽的开放阅读框包含seq id no:10，和/或编码hcmv gb多肽的开放阅读框包含seq id no:7的序列。

20、在一些实施方案中，(a)-(f)的mrna多核苷酸中的每一者还包含polya尾。在一些实施方案中，所述polya尾的长度为100个核苷酸。

21、在一些实施方案中，所述hcmv gh多肽包含与seq id no:19的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hcmv gl多肽包含与seq id no:20的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hcmv ul128多肽包含与seq id no:16的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hcmv ul130多肽包含与seq id no:17的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hcmv ul131a多肽包含与seq id no:18的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，和/或所述hcmv gb多肽包含与seq id no:15的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

22、在一些实施方案中，所述hcmv gh多肽包含seq id no:19的氨基酸序列，所述hcmvgl多肽包含seq id no:20的氨基酸序列，所述hcmv ul128多肽包含seq id no:16的氨基酸序列，所述hcmv ul130多肽包含seq id no:17的氨基酸序列，所述hcmv ul131a多肽包含seq id no:18的氨基酸序列，和/或所述hcmv gb多肽包含seq id no:15的氨基酸序列。

23、本公开的方面涉及用于在受试者中产生针对hcmv的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的本文所述的hcmv免疫原性组合物，从而在所述人类受试者中诱导针对hcmv或hcmv抗原的抗原特异性免疫反应。

24、在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物经由肌肉内注射施用。在一些实施方案中，所述人类受试者在施用hcmv mrna疫苗之前呈cmv血清阳性。在一些实施方案中，所述人类受试者在施用hcmv mrna疫苗之前呈cmv血清阴性。在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物以25μg-300μg mrna的剂量施用。在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物以50μg-150μgmrna的剂量施用。在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物以50μg的剂量施用。在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物以100μg的剂量施用。在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物以150μg的剂量施用。

25、在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物被施用至少一次、至少两次或至少三次。在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物通过初次免疫并接着一次加强免疫施用。在一些实施方案中，所述hcmv免疫原性组合物通过初次免疫并接着两次加强剂免疫施用。

26、在一些实施方案中，所述有效量足以在施用hcmv免疫原性组合物后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对上皮细胞感染的血清中和性抗cmv抗体滴度。在一些实施方案中，所述有效量足以在施用hcmv免疫原性组合物后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对成纤维细胞感染的血清中和性抗cmv抗体滴度。在一些实施方案中，所述有效量足以在免疫后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对上皮细胞感染的血清中和性抗cmv抗体滴度，并且在施用hcmv免疫原性组合物后的一个或多个时间点产生基线后/基线滴度的相关几何平均比(gmr)。在一些实施方案中，所述有效量足以在免疫后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对成纤维细胞感染的血清中和性抗cmv抗体滴度，并且在施用hcmv免疫原性组合物后的一个或多个时间点产生基线后/基线滴度的相关几何平均比(gmr)。在一些实施方案中，在施用hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，针对上皮细胞感染的中和抗体(nab)相对于基线增加≥2倍、≥3倍或≥4倍的参与者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，在施用hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，针对成纤维细胞感染的中和抗体(nab)相对于基线增加≥2倍、≥3倍或≥4倍的参与者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

27、本公开的方面涉及用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hcmv)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物包含(a)包含编码hcmv gh多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)多核苷酸；(b)包含编码hcmv gl多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(c)包含编码hcmvul128多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(d)包含编码hcmv ul130多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(e)包含编码hcmv ul131a多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；和(f)包含编码hcmv gb多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hcmv或hcmv抗原的抗原特异性免疫反应，其中所述hcmv免疫原性组合物以25μg-300μgmrna的剂量施用，并且其中在施用所述hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，针对上皮细胞感染的中和抗体(nab)相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥11倍、≥12倍或≥13倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

28、本公开的其他方面涉及用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hcmv)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物包含(a)包含编码hcmv gh多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)多核苷酸；(b)包含编码hcmv gl多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(c)包含编码hcmv ul128多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(d)包含编码hcmv ul130多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(e)包含编码hcmv ul131a多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；和(f)包含编码hcmv gb多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hcmv或hcmv抗原的抗原特异性免疫反应，其中所述hcmv免疫原性组合物以25μg-300μgmrna的剂量施用，并且其中在施用所述hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，针对成纤维细胞感染的中和抗体(nab)相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

29、本公开的方面涉及用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hcmv)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物包含(a)包含编码hcmv gh多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)多核苷酸；(b)包含编码hcmv gl多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(c)包含编码hcmvul128多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(d)包含编码hcmv ul130多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(e)包含编码hcmv ul131a多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；和(f)包含编码hcmv gb多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hcmv或hcmv抗原的抗原特异性免疫反应，其中所述hcmv免疫原性组合物以25μg-300μgmrna的剂量施用，并且其中在施用所述hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，抗五聚体结合抗体(bab)相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

30、本公开的其他方面涉及用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hcmv)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的hcmv免疫原性组合物，所述hcmv免疫原性组合物包含(a)包含编码hcmv gh多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)多核苷酸；(b)包含编码hcmv gl多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(c)包含编码hcmv ul128多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(d)包含编码hcmv ul130多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；(e)包含编码hcmv ul131a多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸；和(f)包含编码hcmv gb多肽的开放阅读框的mrna多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hcmv或hcmv抗原的抗原特异性免疫反应，其中所述hcmv免疫原性组合物以25μg-300μgmrna的剂量施用，并且其中在施用所述hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，抗gb结合抗体(ab)相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

31、在一些实施方案中，在施用所述hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，在人类受试者中测量的针对上皮细胞感染的中和抗体的几何平均比(gmr)为约8-14。在一些实施方案中，在施用所述hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中抗五聚体结合抗体(bab)的几何平均比(gmr)为约6-10。

32、在一些实施方案中，在施用所述hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中针对成纤维细胞感染的中和抗体的几何平均比(gmr)为约2。在一些实施方案中，在施用所述hcmv免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中的抗gb结合抗体(ab)的几何平均比(gmr)为约2。

33、本发明的每个限制可涵盖本发明的各种实施方案。因此，预期涉及任一要素或要素组合的本发明的每个限制均可包括在本发明的每个方面中。本发明的应用不限于在以下描述中阐述或在附图中说明的构造细节和组件排列。本发明能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实践或进行。