增强胆固醇的基于线粒体的流动和分解代谢的制作方法

所公开的过程、方法和系统是针对通过增强胆固醇穿梭进线粒体中和在线粒体内降解来治疗具有高水平胆固醇或处于其风险中的受试者。相关申请的引证本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2020年12月8日提交的名称为“增强胆固醇的基于线粒体的流动和分解代谢(enhancing mitochondrial-based flow and catabolism ofcholesterol)”的美国临时专利申请号63/122,886的优先权权益，在此将其通过引用全文并入本文。序列表本申请包含序列表，该序列表已经以asc ii格式电子提交并且通过引用以其全文结合在此。在2021年12月7日创建的所述asc ii拷贝命名为p289347_wo_01_sl.txt并且大小为52,905字节。

背景技术：

1、高胆固醇(或高胆固醇血症)是在血液中存在高水平的胆固醇，这可能是不良的饮食、生活方式、疾病(例如，糖尿病)或遗传学的结果。细胞内高浓度的胆固醇是多种疾病的特征，例如脂肪肝病、动脉粥样硬化等。

2、动脉粥样硬化涉及动脉的狭窄，这是由于携带胆固醇的脂蛋白在动脉壁内聚集而产生的。通常，死亡的主要原因的先兆(precursor)包括心血管疾病(cvd)、心肌梗塞、中风和外周血管疾病。用于这些疾病的许多当前疗法集中于通过降低低密度脂蛋白(ldl)的循环水平和/或增加高密度脂蛋白(hdl)来预防次生事件(second event)(或高风险个体中的原发事件(primary event))，因为尽管哺乳动物细胞能够合成胆固醇，但是它们不能将其分解(将其分解代谢)。

3、所需要的是用于降低患有过量脂质和胆固醇的受试者中的脂质和胆固醇水平的组合物和方法。

技术实现思路

1、在此公开了用于增强胆固醇(包括各种修饰的胆固醇化合物)转运到修饰的哺乳动物线粒体中的组合物、方法和系统，其中该修饰使得该线粒体能够分解代谢胆固醇。在许多实施例中，可以对细胞进行工程化以增强胆固醇穿过线粒体膜的流动。细胞还可以包含一种或多种可以帮助胆固醇转运穿过线粒体膜的蛋白质。

2、还公开了制造所公开的组合物的方法，以及使用所公开的组合物和方法来治疗患有高胆固醇或处于发展高胆固醇的风险中的受试者的方法，并且可以帮助降低受试者中的胆固醇。在不同的实施例中，所公开的组合物可以被给予至需要治疗高胆固醇的受试者。在许多实施例中，表达所公开的蛋白质的核酸可以结合至哺乳动物细胞的基因组中，或可以是基因组外的。所公开的细胞可以选自肝细胞、神经元细胞、骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞、造血细胞和干细胞或其前体细胞。

3、在此公开了用于修饰哺乳动物线粒体以增强胆固醇转运和降解的组合物、方法和系统。在许多实施例中，哺乳动物线粒体被工程化以包含一种或多种重组和/或非内源蛋白质，这些蛋白质可以帮助增强胆固醇穿过线粒体膜的流动。在许多实施例中，线粒体还可包括一种或多种可辅助胆固醇分解代谢的蛋白质。所公开的修饰的线粒体可用于降低细胞内胆固醇浓度，增加穿过线粒体膜的胆固醇运输，和/或降低处于发展高胆固醇或高胆固醇血症风险中或患有高胆固醇或高胆固醇血症的患者或受试者的血液中胆固醇的浓度。

4、在另一方面，修饰哺乳动物线粒体的方法包括将至少一种非天然的工程化的类固醇生成性急性调节(star)蛋白或其部分插入哺乳动物线粒体外膜中，并且其中线粒体包括一种或多种胆固醇降解蛋白(cdp)，包括胆固醇脱氢酶(chold)、3-酮类固醇δ1-脱氢酶(δ1-kstd)、厌氧胆固醇代谢b酶(acmb)、3-酮类固醇9α-羟化酶(kshab)、3β-羟类固醇脱氢酶2(hsd2)、p450-铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白融合蛋白(p450-fdxr-fdx)。

5、在本文公开的方法和组合物的各个方面，star蛋白可以包含seq id no：7的残基63至188、其重复、或tomm20蛋白的至少一部分。cdp可以包括p450或p450-铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白融合蛋白(p450-fdxr-fdx)。star蛋白和cdp可以包含至少一种线粒体信号传导蛋白和/或从细胞特异性启动子序列表达，和/或从基因组整合的或从外部基因组基因表达，和/或细胞中star蛋白和cdp的总量的至少约10％可以位于线粒体膜中。所公开的方法和组合物可以用于治疗患有高胆固醇或处于发展高胆固醇的风险中的受试者，如通过降低具有高胆固醇的受试者中的胆固醇。细胞可以选自肝细胞、神经元细胞、骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞、造血细胞和干细胞或其前体细胞。

技术特征：

1.一种核酸组合物，包含：

2.根据权利要求1所述的核酸，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63至188。

3.根据权利要求1或2所述的核酸，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63-188的重复。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中star蛋白包括tomm20蛋白的至少一部分。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸，其中所述cdp包括p450。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸，其中所述cdp包括p450-铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白融合蛋白(p450-fdxr-fdx)。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸，其中star蛋白和所述cdp包括至少一种线粒体信号传导蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸，其中，所述核酸进一步包含细胞特异性启动子序列。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸，其中，所述核酸包含在脂质纳米颗粒中。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸，其中，所述核酸包含在病毒载体中。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的核酸，用于在治疗具有高胆固醇的受试者中使用。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的核酸，用于在转化哺乳动物细胞中使用。

13.根据权利要求12所述的核酸，其中，所述哺乳动物细胞在体外转化。

14.根据权利要求12所述的核酸，其中，所述哺乳动物细胞在体内转化。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的核酸，其中，所述核酸包含在脂质纳米颗粒中。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸，其中，所述核酸包含在患有高胆固醇或处于发展高胆固醇风险中的受试者的细胞中。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的核酸，用于在降低具有高胆固醇的受试者中的胆固醇中使用。

18.一种哺乳动物细胞，包含：

19.根据权利要求18所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63至188。

20.根据权利要求18或19所述的核酸，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63-188的重复。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白包括tomm20蛋白序列的至少一部分。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述cdp包括p450。

23.根据权利要求18至22中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述cdp包括p450-铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白融合蛋白(p450-fdxr-fdx)。

24.根据权利要求18至23中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白和所述cdp包括至少一种线粒体信号传导蛋白。

25.根据权利要求18至24中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star或cdp的编码序列进一步包括细胞特异性启动子序列。

26.根据权利要求18至25中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star或cdp的编码序列整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。

27.根据权利要求18至25中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star或cdp的编码序列未整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。

28.根据权利要求18至27中任一项所述的哺乳动物细胞，用于在治疗患有高胆固醇或处于发展高胆固醇风险中的受试者中使用。

29.根据权利要求18至28中任一项所述的哺乳动物细胞，用于在降低受试者中的胆固醇中使用。

30.根据权利要求18至29中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，所述哺乳动物细胞选自肝细胞、神经元细胞、骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞、造血细胞和干细胞或其前体细胞。

31.一种哺乳动物细胞，包含：

32.根据权利要求31所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63至188。

33.根据权利要求31或32所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63-188的重复。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白包括tomm20蛋白的至少一部分。

35.根据权利要求31至34中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述cdp包括p450。

36.根据权利要求31至35中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述cdp包括p450-铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白融合蛋白(p450-fdxr-fdx)。

37.根据权利要求31至36中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白和所述cdp包括至少一种线粒体信号传导蛋白。

38.根据权利要求31至37中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，所述细胞中star蛋白和cdp的总量的至少10％位于线粒体膜中。

39.根据权利要求31至38中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白或所述cdp由整合到所述哺乳动物细胞的基因组中的基因编码。

40.根据权利要求31至39中任一项所述的哺乳动物细胞，其中star蛋白或所述cdp由基因组外基因编码。

41.根据权利要求31至39中任一项所述的哺乳动物细胞，用于在治疗患有高胆固醇或处于发展高胆固醇风险中的受试者中使用。

42.根据权利要求31至40中任一项所述的哺乳动物细胞，用于在降低受试者中的胆固醇中使用。

43.根据权利要求18至29中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，所述细胞选自肝细胞、神经元细胞、骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞、造血细胞和干细胞或其前体细胞。

44.一种增强哺乳动物细胞中胆固醇降解的方法，包括：

45.根据权利要求44所述的方法，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63至188。

46.根据权利要求44或45所述的方法，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63-188的重复。

47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中star蛋白包括tomm20蛋白的至少一部分。

48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中所述cdp包括p450。

49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中所述cdp包括p450-铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白融合蛋白(p450-fdxr-fdx)。

50.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中star蛋白和所述cdp包括至少一种线粒体信号传导蛋白。

51.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其中star蛋白和cdp由细胞特异性启动子序列表达。

52.根据权利要求44至51中任一项所述的方法，用于在治疗患有高胆固醇或处于发展高胆固醇风险中的受试者中使用。

53.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，用于在降低具有高胆固醇的受试者中的胆固醇中使用。

54.根据权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述细胞中star蛋白和cdp的总量的至少约10％位于线粒体膜中。

55.根据权利要求44至54中任一项所述的方法，其中star蛋白或所述cdp由整合到所述哺乳动物细胞的基因组中的基因表达。

56.根据权利要求44至54中任一项所述的方法，其中star蛋白或所述cdp来自基因组外基因。

57.根据权利要求44至56中任一项所述的方法，用于在治疗患有高胆固醇或处于发展高胆固醇风险中的受试者中使用。

58.根据权利要求44至57中任一项所述的方法，用于在降低受试者中的胆固醇中使用。

59.根据权利要求44至58中任一项所述的方法，其中，所述细胞选自肝细胞、神经元细胞、骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞、造血细胞和干细胞或其前体细胞。

60.根据权利要求44至59中任一项所述的方法，其中，所述胆固醇是ldl。

61.根据权利要求44至59中任一项所述的方法，其中，所述胆固醇是7kc。

62.一种治疗处于发展高胆固醇风险中或患有高胆固醇的患者的方法，包括：

63.根据权利要求62所述的方法，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63至188。

64.根据权利要求62或63所述的方法，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63-188的重复。

65.根据权利要求62至64所述的方法，其中star蛋白包括tomm20蛋白的至少一部分。

66.根据权利要求62至65所述的方法，其中所述cdp包括p450。

67.根据权利要求62至66所述的方法，其中所述cdp包括p450-铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白融合蛋白(p450-fdxr-fdx)。

68.根据权利要求62至67所述的方法，其中star蛋白和所述cdp包括至少一种线粒体信号传导蛋白。

69.根据权利要求62至68所述的方法，其中，star蛋白和cdp由细胞特异性启动子序列表达。

70.根据权利要求62至76所述的方法，用于在降低具有高胆固醇的受试者中的胆固醇中使用。

71.根据权利要求62至71所述的方法，其中，所述细胞中star蛋白和cdp的总量的至少约10％位于线粒体膜中。

72.根据权利要求62至72所述的方法，其中，star蛋白或所述cdp由整合到哺乳动物细胞的基因组中的基因表达。

73.根据权利要求62至72所述的方法，其中star蛋白或所述cdp来自基因组外基因。

74.根据权利要求62至73所述的方法，其中所述患者具有大于200mg/dl的总胆固醇。

75.根据权利要求62至74所述的方法，其中，所述患者患有非酒精性脂肪肝疾病。

76.根据权利要求62至74所述的方法，其中所述患者患有非酒精性脂肪肝炎。

77.根据权利要求62至76所述的方法，其中，所述修饰的细胞源自肝细胞、神经元细胞、骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞、造血细胞和干细胞或其前体细胞。

78.根据权利要求62至77所述的方法，其中所述方法将所述患者血液中的总胆固醇浓度降低大于5％。

79.一种修饰哺乳动物线粒体的方法，包括：

80.根据权利要求79所述的方法，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63至188。

81.根据权利要求79或80所述的方法，其中star蛋白包含seq id no：7的残基63-188的重复。

82.根据权利要求79至81中任一项所述的方法，其中，star蛋白包括tomm20蛋白的至少一部分。

83.根据权利要求79至82中任一项所述的方法，其中，所述cdp包括p450。

84.根据权利要求79至83中任一项所述的方法，其中所述cdp包括p450-铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白融合蛋白(p450-fdxr-fdx)。

85.根据权利要求79至84中任一项所述的方法，其中，star蛋白和所述cdp包括至少一种线粒体信号传导蛋白。

86.根据权利要求79至85中任一项所述的方法，其中，star蛋白和cdp由细胞特异性启动子序列表达。

87.根据权利要求79至86中任一项所述的方法，用于在治疗患有高胆固醇或处于发展高胆固醇风险中的受试者中使用。

88.根据权利要求79至87中任一项所述的方法，用于在降低具有高胆固醇的受试者中的胆固醇中使用。

89.根据权利要求79至88中任一项所述的方法，其中，细胞中star蛋白和cdp的总量的至少约10％位于线粒体膜中。

90.根据权利要求79至90中任一项所述的方法，其中，star蛋白或所述cdp由整合到哺乳动物细胞的基因组中的基因表达。

91.根据权利要求79至89中任一项所述的方法，其中，star蛋白或所述cdp来自基因组外基因。

92.根据权利要求79至91中任一项所述的方法，用于在治疗患有高胆固醇或处于发展高胆固醇风险中的受试者中使用。

93.根据权利要求79至92中任一项所述的方法，用于在降低受试者中的胆固醇中使用。

94.根据权利要求79至93中任一项所述的方法，其中，细胞选自肝细胞、神经元细胞、骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞、造血细胞和干细胞或其前体细胞。

技术总结
公开了用于增强细胞、组织或生物体中的胆固醇降解的组合物、方法和系统。在许多实施例中，本公开描述了一种或多种蛋白质或其编码序列用于增强胆固醇流入线粒体中的用途，其中胆固醇被包含细菌相关序列的一种或多种蛋白质降解。本文公开的组合物、方法和系统可用于预防或治疗与患者血液或细胞中高胆固醇水平相关的疾病、失调和病症。

技术研发人员：穆拉德·托珀斯,里森,吉列尔梅·切尔曼·佩尔迪冈·德·奥利维拉,马克·里迪拉,戴维·麦肯齐-刘,加勒特·斯特劳
受保护的技术使用者：修理生物科技公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15