藤黄酸联合奥沙利铂在制备结直肠癌治疗药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及藤黄酸联合奥沙利铂在制备结直肠癌治疗药物中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌是世界上第三大常见的癌症类型，每年有超过100万人被诊断出结肠癌，并具有高致死性。结肠癌患者的临床治疗手段有限，以奥沙利铂为代表的化疗药为其一线治疗药物，可通过诱导肿瘤细胞dna损伤达到治疗的目的，但常面临毒副作用高和耐药等问题。
3.因此，如何改善奥沙利铂的毒副作用和耐药性是亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供藤黄酸联合奥沙利铂在制备结直肠癌治疗药物中的应用。
5.本发明通过mtt实验检测了48h内天然化合物藤黄酸(gambogic acid,ga)与奥沙利铂(oxaliplatin,oxa)联用后对结直肠癌细胞株sw-480生长活力的影响。实验结果显示，相较于奥沙利铂单用组，藤黄酸联合奥沙利铂显著抑制结直肠癌细胞sw-480的生长活力，半数抑制率(ic50)为42.21μm，该结果初步证实了藤黄酸可以协同奥沙利铂抗结直肠癌的作用。
附图说明
6.图1为藤黄酸联用奥沙利铂对结直肠癌细胞sw-480生长活力的影响结果。
7.图2为单用奥沙利铂对结直肠癌细胞sw-480生长活力的影响结果。
8.图3为单用藤黄酸对结直肠癌细胞sw-480生长活力的影响结果。
具体实施方式
9.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
10.实施例1
11.1、实验材料
12.1.1试剂
13.(1)藤黄酸(c
38h44
o8，分子量：628.75)由中国药科大学提供，黄色粉末，纯度大于97％，使用前用二甲亚砜(dmso)将药物粉末配制为0.01m浓度的母液，置于-80℃保存。奥沙利铂购自csnpharm公司，白色粉末，使用前用无菌水将药物粉末配制为5mm浓度的母液，置于-80℃保存。临用前用含10％胎牛血清的dmem培养基配成所需浓度。
14.(2)细胞培养试剂
15.①
dmem培养基：美国gibco公司产品。取dmem粉末13.48g溶于1000ml灭菌三蒸水中，用3.7g nahco3调节ph值至7.3～7.4，0.22微米微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱。使用前加入10％热灭活的胎牛血清、100u/ml青霉素和100mg/l链霉素配制成完全培养基。
16.②
胎牛血清：美国gibco公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。
17.③
pbs缓冲液：称取nacl 8.0g、kcl 0.20g、na2hpo4·
h2o 1.56g、kh2po4.2.0g，溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
18.④
0.02％edta溶液：称取20mg edta粉末，溶于100ml pbs缓冲液中，低速搅拌，调节ph值至7.3～7.4，高压蒸汽灭菌后保存于4℃冰箱。
19.⑤
0.25％胰蛋白酶：美国gibco公司产品。称取胰酶粉末0.25g，溶于100ml pbs缓冲液中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱。
20.(3)细胞生长活力抑制检测相关试剂
21.mtt粉末和dmso溶液购自sigma-aldrich公司。
22.1.2细胞株
23.结直肠癌细胞株sw-480购自上海中国科学院细胞所。细胞用含100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10％胎牛血清的dmem培养基培养。
24.2、实验方法
25.mtt实验
26.mtt溶液能够被活细胞内的线粒体脱氢酶还原为蓝紫色的结晶甲臜，dmso可溶解甲臜，形成的溶液颜色深浅与细胞活力成正比，据此可以检测细胞的活力。将细胞按照5*104个/ml的细胞密度培养在96孔酶标板内，每孔内的细胞体积为100μl，将细胞置于孵箱培养24h后，分别加入100μl 0.5μm的藤黄酸和0、5μm、10μm、20μm、40μm、80μm的奥沙利铂的混合溶液(图1)，0、5μm、10μm、20μm、40μm、80μm、160μm、320μm的奥沙利铂溶液(图2)以及0、1μm、2μm、4μm、8μm、16μm的藤黄酸溶液(图3)；将给过药物的细胞继续置于孵箱培养48h后，每孔加入20μl mtt溶液；继续孵育4h后将上清液移除，每孔加入100μl dmso，置于微型振荡器振荡，待结晶完全溶解后，使用570nm波长检测其吸光度。将检测后的吸光值整理后按下面的公式计算药物对细胞的生长抑制率：
[0027][0028]
采用联合作用指数(ci)判断两种药物的协同性。ci＝da/icx,a+db/icx,b(a、b代表两种不同药物，icx,a和icx,b是两种药物单独使用使生长抑制率达x时的药物浓度，da和db是两药联用使生长抑制率达x时两种药物的浓度)。根据soriano等的判断方法，0.9≤ci≤1.1为叠加作用，0.8≤ci《0.9为低度协同作用，0.6≤ci《0.8为中度协同作用，0.4≤ci《0.6为高度协同作用，0.2≤ci《0.4为强协同作用。该结果均采用calcusyn软件计算统计。
[0029]
3、实验结果
[0030]
如图1-图3所示，相较于奥沙利铂单用组，藤黄酸联合奥沙利铂显著抑制结直肠癌细胞sw-480的生长活力，半数抑制率(ic
50
)为42.21μm，该结果初步证实了藤黄酸可以协同奥沙利铂抗结直肠癌的作用。两药在不同浓度作用下的联合指数(ci)如表1所示，ci《0.9即
表明呈协同作用。
[0031]
表1藤黄酸联用奥沙利铂联合指数(ci)
[0032]
ga(μm)oxa(μm)ci0.554.5930.5101.1030.5200.8620.5400.8160.5800.754
[0033]
由结果可知，天然化合物藤黄酸(ga)联合奥沙利铂(oxa)能显著抑制结直肠癌细胞的生长。通过mtt实验验证了藤黄酸与奥沙利铂联用可发挥协同抗结直肠癌的作用，在一定剂量内，该协同作用随奥沙利铂剂量增加而增强，最高协同剂量为藤黄酸0.5μm、奥沙利铂80μm。以上结果提示了这种联合给药抗结直肠癌的应用潜力。


技术特征：
1.藤黄酸联合奥沙利铂在制备结直肠癌治疗药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述结直肠癌治疗药物中，藤黄酸和奥沙利铂的浓度比为0.5:20-80。3.一种结直肠癌治疗药物，其特征在于：所述药物的活性成分为藤黄酸和奥沙利铂。4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：藤黄酸和奥沙利铂的浓度比为0.5:20-80。

技术总结
本发明公开了藤黄酸联合奥沙利铂在制备结直肠癌治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过MTT实验检测了48 h内天然化合物藤黄酸（Gambogic Acid）与奥沙利铂（OXA）联用后对结直肠癌细胞株SW-480生长活力的影响。实验结果显示，相较于奥沙利铂单用组，藤黄酸联合奥沙利铂显著抑制结直肠癌细胞SW-480的生长活力，半数抑制率（IC50）为42.21


技术研发人员：惠慧 郭青龙 李慧 陈泓宇 郭永健 葛展虹
受保护的技术使用者：南京芩康医药科技有限公司
技术研发日：2022.03.21
技术公布日：2022/6/1