用于美容和整容治疗以及刺激毛发生长的方法和组合物1.本技术是2020年3月26日提交的题为“用于美容和整容治疗以及刺激毛发生长的方法和组合物”的中国专利申请202080011846.9的分案申请。
技术领域：
：2.本文公开了用于刺激毛发生长和美容(aesthetic)及整容(cosmetic)治疗的方法和组合物，其包含胎盘衍生的粘附基质细胞及其衍生的因子。
背景技术：
：：3.皮肤老化是一个多系统退化过程，其涉及皮肤和皮肤支持系统(sjerobabski&poduje，2008)。皮肤老化的过程可以分为内因性老化和外因性老化。它可能由若干因素引起，如uv照射、压力、ros的产生或吸烟。皱纹的形成是光老化皮肤的特征，且可由胶原原纤维和明胶纤维的降解所引起。此外，由于黑色素合成增加，在各种皮肤病症中观察到色素沉着过度的皮肤，即黑斑病(melasma)、日光性着色斑和雀斑(solarlentiginesandephelides)。这些临床状况是由于经常暴露于uv射线和某些药物以及化学物质下，从而导致皮肤变深。通常开处方脱色剂来治疗这种病症。市售的亮肤和脱色剂包括l-抗坏血酸基-2-磷酸镁(map)、羟基茴香醚、n-乙酰基-4-s-半胱氨酚、熊果苷(氢醌-β-d-吡喃葡萄糖苷)和氢醌(hq)(parvezsetal.，2006)。这些合成化合物的某些副作用是不可逆的皮肤损伤、褐黄病等。这些副作用导致了对替代性化妆品制剂的研究。4.受损的皮肤屏障5.经表皮水分丢失(tewl)是皮肤病学中所用的术语，用来表征通过扩散和蒸发过程从身体内部经由表皮层(皮肤)进入周围大气的水分丢失。twel也用于评估受损的皮肤屏障功能。6.tewl可能有遗传和/或环境病因。这可能是遗传多态性所致，其导致保护性蛋白表达减少，因此使得皮肤屏障受损。主要由外部刺激物引起的皮肤炎症也可导致水分丢失。基因和环境因素共同或分别导致过多的tewl，并最终触发不同的tewl相关皮肤病，从皮肤干燥到更严重的状况如湿疹。7.tewl会引起皮肤干燥、反应性皮肤或湿疹。在某些情况下，例如当与经由皮肤暴露于过敏原有关时，这会导致变应性湿疹/特应性皮炎，即伴随变应性致敏的湿疹。8.在tewl相关病症中，由于表皮屏障功能减弱，正常失水率增加，从而导致表皮脱水，其有时表现为刺激和/或干燥或鳞状皮肤，通常与特应性皮炎(也称为湿疹)反应性皮肤(例如，冬季皮疹)和/或易受感染有关。其它增加tewl和皮肤炎症的疾病包括随时间老化(chronologicalaging)。tewl增加也可能继发于损伤、感染、烧伤、银屑病和炎性皮肤状况，如玫瑰痤疮和口周皮炎中的特应性素质(diathesis)。9.秃发(alopecia)10.秃发有多种类型，包括雄激素性秃发(也称为男性或女性型脱发(hairloss))、急性秃发和斑秃(包括全秃和普秃)。11.雄激素性秃发是最常见的秃发形式。雄激素性秃发是一种影响例如白种人或亚洲人后裔的男性和女性的遗传性脱发状况。雄激素性秃发的特征在于毛发量逐渐减少，或甚至秃顶。如果不加以治疗，雄激素性秃发患者的毛发数量在发病后将以每年约5％的速度减少，例如，ellisetal,expertreviewsinmolecularmedicine,4:1-11,2002。据报道，雄激素性秃发影响到多达70％的总人口，估计30％的男性在30岁时出现雄激素性秃发，50％的男性在50岁时受到雄激素性脱发影响(sinclairr,jmhg,1(4):319-327,2004；leeandlee,ann.dermatol.,24(3):243-252,2012)。据报道，多达10％的绝经前妇女表现出女性型脱发的迹象，并且随着妇女进入更年期，发病率显著增加，影响多达50-75％的65岁或以上的妇女(norwoodot,dermatolsurg.,27(1):53-4,2001)。技术实现要素：12.本文提供了用于美容、整容和美化(beauty)治疗以及刺激毛发生长的方法和组合物，其包含胎盘粘附基质细胞、其裂解物或条件培养基、或由其衍生的级分。13.胎盘粘附基质细胞(asc)是指来自胎盘组织的粘附基质细胞。本文所用的(一或多种)条件培养基/cm是指已用于孵育细胞培养物的生长培养基。本公开并不旨在限于特定的培养基配方；相反，适用于孵育胎盘asc的任何培养基都包括在内。本文提及的“培养的”胎盘asc是指根据本文所述方法扩增的asc，其中每一个都代表一个单独的实施方案。14.在某些实施方案中，所述胎盘asc已在二维(2d)基材(substrate)、三维(3d)基材或其组合上培养。在具体实施方式和实施例中提供了2d和3d培养条件的非限制性实例。15.可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的；或者在其它实施方案中，是异种的。16.本文提到的细胞群体的“生长”与细胞群的扩增同义。在某些实施方案中，asc(在某些实施方案中，其可以是胎盘asc)在没有显著分化的情况下扩增。在各种实施方案中，所述扩增是在2d基材上、3d基材上、或先在2d基材上后在3d基材上进行的。17.除非另有说明，本文提及的所有范围都是包括性的。18.除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等价于本文描述的那些方法和材料的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，以下描述了适合的方法和材料。19.如有冲突，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在限制。附图说明20.在此参考附图，仅通过示例的方式描述本发明。在现在具体参考详细附图的情况下，要强调的是，示出的细节是作为示例，且仅仅是为了示例性地讨论本发明的实施方案的目的，并且是为了提供被认为是对本发明的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述而呈现的。在这方面，除了对本发明的基本理解所必需的之外，没有试图更详细地示出本发明的结构细节，结合附图的描述使本领域技术人员明白本发明的几种形式如何可以在实践中实施。21.在附图中：22.图1是可用于制备细胞的生物反应器的示意图。23.图2包含脂肪生成试验后骨髓(bm)衍生的msc(顶行)或胎盘细胞的图片。细胞用(左栏)或不用(右栏)分化培养基孵育。胎盘asc在srm(中间3行描绘了3个不同批次)或全dmem(底行)中扩增。24.图3包含骨生成试验后bm衍生的msc(顶行)或胎盘细胞的图片。细胞用(左栏)或不用(右栏)分化培养基孵育。胎盘asc在srm(中间3行描绘了3个不同批次)或全dmem(底行)中扩增。25.图4.stagetips装置的图示。26.图5a-j是微球的发光图，其反映了il-1-ra、collageniv-1a、fibronectin、il-13、hgf、vegf-a、il-4、pdgf-aa、timp-1、tgfb2和tgfb1(分别在a-j中)的浓度(纵轴)。p250416r21和p150518r02为母体批次；r090418r01和r170216r19为胎儿/血清批次；且pd060918s2437br01、pd030316441br09为胎儿sf批次。来自不同批次的生物反应器cm(横轴)进行如下：未经处理(br；从左侧起，泳道1-6)；切向流过滤(tff；pallcorporation；泳道7-12)；或冻干(lyp；泳道13-18)(上图)。下图描述了以较高的细胞/培养基比率在平板中产生的条件培养基的分析。27.图6a-b显示由(a)或elisa(b)评估的血管生成因子表达(横轴)的图。用荧光强度测量的表达显示在纵轴上。在正常或缺氧条件下孵育asc(每个系列中的左和右栏)。28.图7是在生长培养基(泳道1、3、5和7)或与重悬的asc-cm混合的培养基(泳道2、4、6和8)中培养72小时后成纤维细胞群倍增(纵轴)的图。泳道1-2、3-4、5-6和7-8分别描绘了0、2.1、8.6和12.3日龄的pd。29.图8是暴露于h2o2后并用生长培养基(实线)或asc-cm(虚线)孵育后的成纤维细胞活力的图(纵轴；表示暴露于h2o2后即时的细胞数量中的活细胞百分比)。30.图9a-b是通过划痕试验伤口区域中的细胞密度(纵轴)评估年轻(a)和年老(b)的成纤维细胞在sf-dmem(浅色线)或冻干胎儿胎盘asc-cm并重悬于sf-dmem(深色线)中的迁移图。c-d是以相同的方式评估和绘制的年轻(c)和年老(d)的成纤维细胞在sf-dmem(浅色线)或直接胎儿胎盘asc-cm(深色线)中的迁移图。31.图10是在生长培养基(泳道1、3、5和7)或与重悬的asc-cm混合的培养基(泳道2、4、6和8)中培养72小时后成dp群倍增(纵轴)的图。泳道1-2、3-4、5-6和7-8分别描绘了0、2.1、8.6和12.3日龄的pd。32.图11a-c是显示血流(a；纵轴)或形成直径为1-4微米(b)或4-8微米(c)的功能性新血管(纵轴)的图。cd34染色表示新的血管，fitc右旋糖酐表示血管功能性。在a中，上方的实线和虚线显示了来自动物手术处理的和对侧腿的数据；下方的深色和灰色线显示了给予安慰剂的动物的手术处理的和对侧腿。在b-c中，每个系列的第一和第二栏显示了经手术的肢体中给予安慰剂和asc处理的动物。33.图12显示了一位患buerger氏病的病人在治疗前(左图)和治疗后(右图)患趾的照片。具体实施方式34.在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是，本发明的应用不限于以下描述中阐述的细节或由实施例举例说明的细节。本发明能够有其它实施方案，或者能够以各种方式实践或进行。此外，应当理解，本文使用的措辞和术语是出于描述的目的，不应视为限制。35.本发明的方面涉及包含胎盘粘附基质细胞(asc)、其裂解物或条件培养基以及由其衍生的级分的方法和组合物。在一些实施方案中，所述asc可以是人asc，或者在其它实施方案中，可以是动物asc。36.在一个实施方案中，提供了治疗对象皮肤状况的方法，或在另一个实施方案中提供了预防对象皮肤状况的方法，或在另一个实施方案中提供了改善对象皮肤状况的方法，所述方法包括施用包含培养的胎盘asc的组合物，从而治疗、预防或减轻皮肤状况的严重程度。如本文所提供的，有效量的所述组合物改善了各种皮肤状况。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc(来自胎盘母体部分的asc)；胎儿组织衍生的asc(来自胎盘胎儿部分的asc)；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的；或者在其它实施方案中，是异种的。在某些实施方案中，所述组合物是注射的组合物。37.在一个实施方案中，提供了治疗对象皮肤状况的方法，或在另一个实施方案中提供了预防对象皮肤状况的方法，或在另一个实施方案中提供了改善对象皮肤状况的方法，所述方法包括施用组合物，从而治疗、预防或减轻皮肤状况的严重程度，所述组合物包含培养的胎盘asc的条件培养基(cm)、其裂解物或条件培养基、或由其衍生的级分。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc(来自胎盘母体部分的asc)；胎儿组织衍生的asc(来自胎盘胎儿部分的asc)；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的；或者在其它实施方案中，是异种的。在某些实施方案中，所述组合物是注射的组合物。38.在另一个实施方案中，提供了一种治疗、预防或改善对象皮肤状况的组合物，其包含培养的胎盘asc、其裂解物或条件培养基、或由其衍生的级分。在某些实施方案中，所述组合物是注射的组合物。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的。胎盘asc、其裂解物和cm、以及由其衍生的级分，每一个都代表一个单独的实施方案。39.在各种实施方案中，所描述的皮肤状况可以是面部治疗的副作用，其非限制性实例是激光换肤(laserresurfacing)和化学剥脱治疗。副作用的一个更具体的实施方案是受损的皮肤屏障。在其它实施方案中，所述状况是微针治疗后的副作用、中胚层疗法(mesotherapy)的副作用；痤疮；皱纹形成；皮肤老化(更具体的实例是皮肤光老化)；皮肤弹性降低；皮肤撕裂伤；色素沉着过度的瑕疵；色素沉着不足的瑕疵；皮肤干燥；表皮变薄；或者弹性组织变性。在其它实施方案中，皮肤状况是特应性皮炎。每个状况代表一个单独的实施方案。增强皮肤从各种损伤(在一些实施方案中，包括本文中列举的那些)中再生是又一实施方案。在各种实施方案中，激光换肤可以是烧蚀性的或非烧蚀性的。40.本文所用的化学剥脱是指用于改善面部、颈部或手部皮肤外观的技术。将化学溶液涂在皮肤上，使其脱落并最终剥离，从而产生通常更光滑且皱纹更少的再生皮肤。41.在其它实施方案中，提供了一种减少对象经表皮水分丢失(tewl)的方法，包括施用包含培养的胎盘asc、其裂解物或条件培养基或由其衍生的级分的组合物，从而减少tewl。如本文所提供的，所述asc分泌因子诸如sod1和sod2(超氧化物歧化酶1和2；uniprot编号分别为p00441和p04179)，其在皮肤屏障完整性中起作用，且它们刺激真皮成纤维细胞的增殖并保护它们免受氧化性损伤。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的；或者在其它实施方案中，是异种的。在某些实施方案中，所述组合物是注射的组合物。在某些实施方案中，tewl继发于损伤、感染、烧伤、特应性皮炎或银屑病。胎盘asc、其裂解物和cm、以及由其衍生的级分，每一个都代表一个单独的实施方案。42.在又一其它实施方案中，提供了一种用于降低对象tewl的组合物，其包含包含培养的胎盘asc、其裂解物或条件培养基、或由其衍生的级分的组合物。在某些实施方案中，所述组合物是注射的组合物。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的。在某些实施方案中，tewl继发于损伤、感染、烧伤、特应性皮炎或银屑病。胎盘asc、其裂解物和cm、以及由其衍生的级分，每一个都代表一个单独的实施方案。43.在其它实施方案中，提供了一种减少对象皮肤炎症的方法，或在另一个实施方案中提供了一种改善对象皮肤炎症的方法，包括施用包含培养的胎盘asc、其裂解物或条件培养基、或由其衍生的级分的组合物，从而减少或改善皮肤炎症。如本文所提供的，有效量的所述组合物减少皮肤炎症。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的；或者在其它实施方案中，是异种的。在某些实施方案中，所述组合物是注射的组合物。在某些实施方案中，皮肤炎症继发于玫瑰痤疮中的特应性素质，或者在其它实施方案中，继发于口周皮炎。胎盘asc、其裂解物和cm、以及由其衍生的级分，每一个都代表一个单独的实施方案。44.在又一其它实施方案中，提供了一种用于减少或改善对象皮肤炎症的组合物，其包含培养的胎盘asc、其裂解物或条件培养基、或由其衍生的级分。在某些实施方案中，所述组合物是注射的组合物。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的。在某些实施方案中，皮肤炎症继发于玫瑰痤疮中的特应性素质，或者在其它实施方案中，继发于口周皮炎。胎盘asc、其裂解物和cm、以及由其衍生的级分，每一个都代表一个单独的实施方案。45.在又一其它实施方案中，提供了一种治疗对象脱发的方法，或在其它实施方案中提供了一种预防对象脱发的方法，或在其它实施方案中提供了一种改善对象脱发的方法，其包括施用包含培养的胎盘asc(或在其它实施方案中为培养的胎盘asc群)的组合物，从而治疗、预防或减轻脱发的严重程度。在某些实施方案中，所述组合物是表面(topical)组合物。在某些实施方案中，所述组合物是凝胶。在其它实施方案中，所述组合物是洗剂。在其它实施方案中，所述组合物是泡沫。在其它实施方案中，所述组合物是水性溶液，或者在其它实施方案中，是混悬液。在其它实施方案中，所述组合物是包含衍生自胎盘asc的cm、裂解物或级分的洗发水。在其它实施方案中，所述组合物是可注射的制剂。如本文所提供的，有效量的所述组合物改善脱发，并且在其它实施方案中，促进毛发生长。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的。胎盘asc、其裂解物和cm、以及由其衍生的级分，每一个都代表一个单独的实施方案。如本文所提供的，所述的asc分泌在毛囊健康中起作用的hgf、pdgf、mmp-2和/或vegf，并且它们刺激真皮乳头细胞的复制。46.在又一其它实施方案中，提供了一种治疗对象脱发的方法，或在其它实施方案中提供了一种预防对象脱发的方法，或在其它实施方案中提供了一种改善对象脱发的方法，其包括施用包含培养的胎盘asc的cm或裂解物(或在其它实施方案中包含培养的胎盘asc群)、或在其它实施方案中包含衍生自所述cm的级分的组合物，从而治疗、预防或减轻脱发的严重程度。在某些实施方案中，所述组合物是表面组合物。在某些实施方案中，所述组合物是凝胶。在其它实施方案中，所述组合物是洗剂。在其它实施方案中，所述组合物是泡沫。在其它实施方案中，所述组合物是水性溶液，或者在其它实施方案中，是混悬液。在其它实施方案中，所述组合物是包含衍生自胎盘asc的培养基、裂解物或级分的洗发水。在其它实施方案中，所述组合物是可注射的制剂。如本文所提供的，有效量的所述组合物改善脱发，并且在其它实施方案中，促进毛发生长。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的。胎盘asc裂解物、asc-cm、以及由其衍生的级分，每一个都代表一个单独的实施方案。47.在又一其它实施方案中，提供了一种用于治疗、预防或改善对象脱发的组合物，其包含培养的胎盘asc、其裂解物或cm、或由其衍生的级分。在某些实施方案中，所述组合物是凝胶。在其它实施方案中，所述组合物是洗剂。在其它实施方案中，所述组合物是泡沫。在其它实施方案中，所述组合物是水性溶液，或者在其它实施方案中，是混悬液，在一些实施方案中，其可是可注射制剂。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对于对象是同种异体的；或者在其它实施方案中，是自体的。胎盘asc、其裂解物和cm、以及由其衍生的级分，每一个都代表一个单独的实施方案。48.在又一其它实施方案中，提供了一种用于治疗对象秃发的方法，或在其它实施方案中预防对象秃发的方法，或在其它实施方案中改善对象秃发的方法，其包括施用表面组合物，所述表面组合物包含培养的胎盘asc、其裂解物或cm、或由其衍生的级分，从而治疗、预防或减轻秃发的严重程度。在某些实施方案中，所述组合物是凝胶。在其它实施方案中，所述组合物是洗剂。在其它实施方案中，所述组合物是泡沫。在其它实施方案中，所述组合物是水性溶液，或者在其它实施方案中，是混悬液。在其它实施方案中，所述组合物是包含衍生自胎盘asc的cm、裂解物或级分的洗发水。在其它实施方案中，所述组合物是可注射的制剂。如本文所提供的，有效量的所述组合物改善秃发。在各种实施方案中，胎盘asc是母体组织衍生的asc；胎儿组织衍生的asc；或它们的混合物。可选地或额外地，胎盘asc相对物”是指用破坏细胞膜的物质处理细胞群后产生的组合物。在其它实施方案中，无论在本文中哪里提到培养的胎盘asc时，都可以使用培养的胎盘asc群。57.cm和细胞裂解物的级分58.如前所述，在某些实施方案中，所述方法和组合物包含胎盘asc-cm的级分。在其它实施方案中，所述方法和组合物包含胎盘asc裂解物的级分。每一种可能性都代表一个单独的实施方案，并且每一个都可以与每一种分级分离方法自由组合。59.在某些实施方案中，所述级分是胎盘asc的cm(“胎盘asc-cm”)，或者在其它实施方案中，是胎盘asc裂解物的cm。除非另有说明，术语胎盘asc-cm是指在其中孵育胎盘asc的生长培养基。在某些实施方案中，随后将cm与asc分离。在更具体的实施方案中，在与细胞生长相容的条件下，将胎盘asc在cm中孵育6-150小时；或者在其它实施方案中，孵育6-144小时；6-120小时；6-96小时；6-72小时；6-48小时；6-36小时；6-24小时；12-150小时；12-144小时；12-120小时；12-96小时；12-72小时；12-48小时；12-36小时；12-24小时；24-150小时；24-144小时；24-120小时；24-96小时；24-72小时；24-48小时；或24-36小时。60.在其它实施方案中，对所述胎盘asc裂解物或asc-cm进行冻干，在更具体的实施方案中，冻干可以是冷冻干燥或喷雾干燥。在某些实施方案中，将冻干物进行包封，和/或在其它实施方案中，掺入乳液中。冻干、包封和乳化的每个实施方案可以自由组合。61.在又一其它实施方案中，对胎盘asc裂解物或asc-cm进行透析。在更具体的实施方案中。在更具体的实施方案中，透析膜可以具有2-50kda(千道尔顿)的截留值。在其它实施方案中，截留值为2-100、2-70、2-40、2-30、2-20、2-15、2-10、3-100、3-70、3-40、3-30、3-20、3-15、3-10、5-100、5-70、5-40、5-30、5-20、5-15、5-10、7-100、7-70、7-40、7-30、7-20、7-15、7-10、10-100、10-70、10-40、10-30、10-20或10-15kda。在某些实施方案中，将透析液包封，和/或在其它实施方案中，掺入乳液中。透析、包封和乳化的每个实施方案可以自由组合。62.在更具体的实施方案中，所述级分可以富含分泌的蛋白。富含分泌的蛋白的级分的非限制性实例是蛋白提取物。63.在其它实施方案中，所述级分富含肽。本文所用的肽是指长度不超过50个氨基酸残基的蛋白质或蛋白质片段。64.在又一其它实施方案中，所述级分富含分泌的脂质。65.在又一其它实施方案中，囊泡成分富含细胞外囊泡，其可以是外泌体；或者，在其它实施方案中是微泡；或者，在其它实施方案中是外泌颗粒(exomere)。在再一其它实施方案中，囊泡成分基本上由细胞外囊泡组成，其可以是外泌体；或者，在其它实施方案中是微泡；或者，在其它实施方案中是外泌颗粒。在又一其它实施方案中，囊泡成分由细胞外囊泡组成，其可以是外泌体，或者在其它实施方案中是微泡。在又一其它实施方案中，囊泡成分包含细胞外囊泡，其可以是外泌体；或者，在其它实施方案中是微泡；或者，在其它实施方案中是外泌颗粒。66.在各种实施方案中，微泡(在本文中也称为微粒)是基于它们的大小(例如100nm至1μm)、表面标记物或外膜中带负电荷的磷脂酰丝氨酸的暴露来识别的(johnstoneetal.和panetal.)。分离微泡的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如hugeletal.和vanwijketal.中。67.在某些实施方案中，外泌颗粒是指平均尺寸约为35nm(纳米)的非膜分泌的纳米颗粒。在其它实施方案中，外泌颗粒是尺寸小于50nm(例如1-50nm)且硬度在140-820兆帕(mpa)范围内的分泌的纳米颗粒。外泌颗粒描述于zhanghetal.中。68.在某些实施方案中，所述方法包括通过离心和任选的流式细胞术分离微粒，例如在burgerdetal.或其中引用的参考文献中所述。仅出于举例说明的目的而提供的一个这样的方案涉及低速离心以去除大的细胞碎片，表面蛋白的荧光标记，以及基于细胞计数的分选。低速离心可以例如以1500xg持续15分钟。在某些实施方案中，将来自该离心的上清液再次沉淀(pellet)，以确保去除大的碎片。然后可以例如通过以20,000×g离心20分钟将微粒沉淀。然后将沉淀重悬，接着为了获得高纯度制备物，可以用微粒表面标记物(例如annexin)染色并进行流式细胞术。流式细胞术领域的技术人员应明白，可以使用前向散射和侧向散射参数来建立尺寸上限(例如，1微米)。69.在其它实施方案中，所述方法包括通过离心分离微粒，例如braga-lagacheetal.中或其中引用的参考文献中所述。仅出于举例说明的目的提供了一种这样的方案，其涉及在室温以16,000×g进行2分钟的预清除离心步骤。然后将上清液在室温以16000×g离心持续20-40分钟。接着吸出上清液，然后在缓冲溶液中重新溶解沉淀。任选地，将mp通过以16,000×g在室温离心20分钟再次沉淀，接着进行1-2个任选的洗涤步骤。70.在再一其它实施方案中，所述级分富含外泌体(例如通过超速离心获得)。在更具体的实施方案中，所述级分可以包括外泌体稳定剂。制备外泌体的方法在本领域是已知的，并且描述于例如mincheva-nilssonletal.(isolationandcharacterizationofexosomesfromculturesoftissueexplantsandcelllines.currprotocimmunol.2016nov1；115:14.42.1-14.42.21)；al-nedawiketal.(analysisofextracellularvesiclesinthetumormicroenvironment.methodsmolbiol.2016；1458:195-202.doi:10.1007/978-1-4939-3801-8_14)；pinlietal.(progressinexosomeisolationtechniques.theranostics.2017；7(3):789–804.doi:10.7150/thno.18133)；和banjjetal.(lowphincreasestheyieldofexosomeisolation.biochembiophysrescommun.2015may22；461(1):76-9.doi:10.1016/j.bbrc.2015.03.172)。在又一其它的实施方案中，可以通过以下步骤来分离外泌体：首先预清除培养基以除去细胞，以15,000g离心30分钟以除去细胞碎片，然后通过以150,000g超离心90分钟从上清液中沉淀外泌体(jethwasaetal.,exosomesbindtoautotaxinandactasaphysiologicaldeliverymechanismtostimulatelpareceptorsignallingincells.jcellsci.2016oct15；129(20):3948-3957)。71.在再一其它实施方案中，所述级分是可溶级分。在其它实施方案中，所述级分是可沉淀级分。制备固体和可沉淀级分的方法的非限制性实例描述于bachfcetal.(solubleandpelletablefactorsinporcine,canineandhumannotochordalcell-conditionedmedium:implicationsforivdregeneration.eurcellmater.2016aug30；32:163-80)中。72.在再一其它实施方案中，使用尺寸排除色谱法(例如sephadextm柱)产生级分。73.分级分离cm和细胞裂解物的方法在本领域是已知的，并且描述于例如8100分级分离系统(expedeon,sandiego,ca)的产品资料中，该系统能够根据电泳迁移率对分析物进行制备级分级分离；以及描述于wengyetal.(in-depthproteomicquantificationofcellsecretomeinserum-containingconditionedmedium.analchem.2016may3；88(9):4971-8.doi:10.1021/acs.analchem.6b00910)中。74.在其它实施方案中，使用两水相体系(atps)生产级分。这种体系在本领域中是已知的，并且描述于例如mujahidiqbaletal.(aqueoustwo-phasesystem(atps):anoverviewandadvancesinitsapplications.biolprocedonline.2016；18:18.doi:10.1186/s12575-016-0048-8)中。在某些更具体的实施方案中，所述体系是由两种聚合物(在某些实施方案中为聚乙二醇[peg]和右旋糖酐)形成的两相体系。在其它实施方案中，所述体系由聚合物和盐(其非限制性实施方案是磷酸盐、硫酸盐或柠檬酸盐)形成。在其它实施方案中，使用离子液体和短链醇(griloaletal；vanberlometal)。在其它实施方案中，将离子和/或非离子表面活性剂用于形成胶束和反胶束atps(liucetal；和xiaojxetal)。在再一其它实施方案中，所述体系是聚合物/聚合物体系，或者在又一其它实施方案中，是聚合物/盐体系(albertsson)。在再一其它实施方案中，所述体系是醇-盐atps(louwriera；和jiangbetal.)。在又一其它实施方案中，所述体系是两水相胶束体系(bordierc.1981)；混合胶束体系(lyegjetal)；基于离子液体(il)的atps(berthodaetal.)；或多相体系(例如具有三个或四个聚合物相)也已经被构建用于分离生物分子(hatti-kaulr2001)。[0075]在其它实施方案中，所述体系是单聚合物atps，其仅利用一种聚合物以在水中形成atps(johanssonh-oetal)。[0076]举例来说，stagetip(图4)可用于所述的方法和组合物(yanbaoyuetal.,aspinnableandautomatablestagetipforhighthroughputpeptidedesaltingandproteomics.protocolexchange(2014)doi:10.1038/protex.2014.033；rappsilberjetal.,protocolformicro-purification,enrichment,pre-fractionationandstorageofpeptidesforproteomicsusingstagetips.natprotoc.2007；2(8):1896-906).[0077]仅出于举例说明目的而提供的非限制性stagetip方案使用了以下缓冲剂和试剂：[0078]·缓冲剂a：100％甲醇；·缓冲剂b：0.5％乙酸于h2o中；·缓冲剂c：0.5％乙酸、60％乙腈和40％h2o；·缓冲剂d：0.5％乙酸、80％乙腈和20％h2o。[0079]·adaptor(minispincolumncollar，配有microspin柱；thenestgroup,inc.,ma；目录号sumss18v)。[0080]·emporec18萃取盘(3m,mn；目录号2215)。[0081]方案步骤：[0082]1)按需将单层或多层c18萃取盘装入tip中。[0083]2)将装好的tip用adaptor放入2.0ml的微管中(如图4所示)。[0084]3)调节i:将200μl缓冲剂a(甲醇)装入tip中；以4000rpm旋转约1分钟；[0085]调节ii:将200μl缓冲剂d(0.5％乙酸、80％乙腈和20％h2o)装入tip中，以4000rpm旋转约1分钟。[0086]4)平衡:将200μl缓冲剂b(0.5％乙酸于水中)装入tip中，以4000rpm旋转约1分钟。[0087]5)将干燥的肽样品重悬于100μl的缓冲剂b中，并涡旋约10分钟。所述肽可能来自胶内消化、溶液内消化、超滤辅助样品制备(fasp)或96fasp16。[0088]6)结合:将100μl的溶液装入tip中，并以4000rpm旋转约1.5分钟。将流过物重新装入tip，并再次旋转。重复此结合步骤2-3次。[0089]7)洗涤:装入200μl的缓冲剂b，以4000rpm旋转2-3分钟。弃去流过物。[0090]8)洗脱:将stagetip放入新的收集管中；装入200μl的缓冲剂c，以4000rpm旋转约2分钟；装入200μl的缓冲剂d，以4000rpm旋转约2分钟，用缓冲剂d再洗脱一次。洗脱的总体积约为600μl。[0091]9)将肽洗脱物在speed-vac中干燥，用hplc缓冲剂重悬，以便立即进行分析，或者在-80℃储存直至进一步使用。[0092]在再一其它实施方案中，所述级分是来自生物反应器中培养的胎盘asc的细胞外基质(ecm)。在再一其它实施方案中，所述级分是来自生物反应器中培养的胎盘asc的ecm的级分。本领域技术人员应明白，ecm是指由细胞分泌的蛋白质和其它分子的基质。[0093]包含外泌体的组合物[0094]在又一另一个实施方案中，提供了一种用于本文所述适应征的方法，其利用包含衍生自培养的胎盘asc的外泌体或其它细胞外囊泡的组合物。在某些实施方案中，所述组合物如本文中所述制备。[0095]微针方法和组合物[0096]在其它实施方案中，提供了一种例如针对本文所述适应征的整容或美容治疗，包括微针刺对象的皮肤，随后施用本文所述的组合物。在各种实施方案中，所述组合物可以是洗剂、泡沫、凝胶、溶液或混悬液，或者在又一其它实施方案中，是本文所述的任何其它组合物。在某些实施方案中，所述组合物包含胎盘asc，或者在其它实施方案中，包含其裂解物、asc-cm、或由其衍生的级分。可选地或额外地，所述治疗用于修复老化的皮肤、修复干燥的皮肤、恢复受损的皮肤屏障或刺激毛发生长。[0097]在其它实施方案中，提供了一种用于例如本文所述适应征的整容或美容治疗药盒，其包含微针装置和本文所述的组合物。在各种实施方案中，所述组合物可以是洗剂、泡沫、凝胶、溶液或混悬液，或者在又一其它实施方案中，是本文所述的任何其它组合物。在某些实施方案中，所述组合物包含胎盘asc，或者在其它实施方案中，包含其裂解物、asc-cm、或其级分。可选地或额外地，所述治疗用于修复老化的皮肤、修复干燥的皮肤、恢复受损的皮肤屏障或刺激毛发生长。[0098]微针刺装置在本领域中是已知的，并且可从例如(vancouver,canada)获得。[0099]扩增asc的方法[0100]本领域技术人员应明白将生长培养基用于扩增本文所述的胎盘asc和/或产生用于本文所述组合物和方法的所述cm。可用于2d和3d培养中的基础培养基的非限制性实例包括minimumessentialmediumeagle、adc-1、lpm(不含牛血清白蛋白)、f10(ham)、f12(ham)、dccm1、dccm2、rpmi1640、bgjmedium(进行或未进行fitton-jackson改良)、basalmediumeagle(bme-添加了earle氏盐基)、dulbecco’smodifiedeaglemedium(dmem-不含血清)、yamane、imem-20、glasgowmodificationeaglemedium(gmem)、leibovitzl-15medium、mccoy’s5amedium、mediumm199(m199e-添加了earle氏盐基)、mediumm199(m199h-添加了hank盐基)、minimumessentialmediumeagle(mem-e-添加了earle氏盐基),minimumessentialmediumeagle(mem-h-添加了hank氏盐基)和minimumessentialmediumeagle(mem-naa，含有非必需的氨基酸)，尤其还有许多，包括medium199、cmrl1415、cmrl1969、cmrl1066、nctc135、mb75261、mab8713、dm145、williams’g、neuman&tytell、higuchi、mcdb301、mcdb202、mcdb501、mcdb401、mcdb411、mdbc153，及其以任何比例的混合物。在某些实施方案中，使用dmem。这些和其它可用的培养基尤其可从gibco,grandisland,n.y.,usa和biologicalindustries,bethaemek,israel获得。[0101]在一些实施方案中，培养基可以补充额外的物质。这种物质的非限制性实例是血清，在一些实施方案中，其是母牛或其它物种的胎儿血清，在一些实施方案中，其占培养基体积的5-15％。在某些实施方案中，培养基含有1-5％、2-5％、3-5％、1-10％、2-10％、3-10％、4-15％、5-14％、6-14％、6-13％、7-13％、8-12％、8-13％、9-12％、9-11％或9.5％-10.5％的血清，血清可以是fbs，或者在其它实施方案中是另一种动物血清。[0102]可选地或额外地，培养基可以补充有生长因子、维生素(例如抗坏血酸)、细胞因子、盐(例如b-甘油磷酸盐)、类固醇(例如地塞米松)和激素，例如生长激素、促红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素3、白细胞介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、骨保护素配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板源性生长因子和骨形态生成蛋白。[0103]应当明白，可以向培养基中添加额外的成分。这种成分可以是抗生素、抗真菌药、白蛋白、氨基酸和细胞培养领域已知的其它成分。[0104]本文所述的各种培养基，即2d生长培养基和3d生长培养基，可以独立地选自与培养基组合物有关的所述实施方案中的每一个。在各种实施方案中，可以使用任何适合在标准组织装置和/或生物反应器中使细胞生长的培养基。[0105]还应明白，在某些实施方案中，当所述asc欲施用于人对象时，细胞和培养基(例如，具有上述培养基添加剂)基本上不含异种，即，不含任何动物污染物，例如支原体。例如，培养基可以补充有血清替代物、人血清和/或合成或重组产生的因子。[0106]asc及其来源[0107]在某些实施方案中，所述asc(以其本身使用或者生产用于所述方法和组合物的产品)是胎盘衍生的。除非另有说明，本文使用的术语“胎盘”、“胎盘组织”等是指胎盘的任何部分。在各种实施方案中，胎盘衍生的asc可以从胎儿区域获得，或者在其它实施方案中，从母体区域获得，或者在其它实施方案中，从这两个区域获得。母体源的更具体的实施方案是底蜕膜和壁蜕膜。胎儿源的更具体的实施方案是羊膜、绒毛膜和绒毛。在某些实施方案中，将组织样本在生理缓冲剂中洗涤，所述生理缓冲剂的非限制性实例是磷酸盐缓冲盐水(pbs)和hank氏缓冲剂。在某些实施方案中，从中收获asc的胎盘组织包括胎盘的绒毛膜和蜕膜区域中的至少一者，或者，在其它实施方案中，包括胎盘的绒毛膜和蜕膜区域两者。绒毛膜区域的更具体的实施方案是绒毛膜间充质和绒毛膜滋养层组织。蜕膜的更具体的实施方案是底蜕膜、包蜕膜和壁蜕膜。在非限制性实施方案中，母体和胎儿胎盘细胞的混合物可以通过切碎整个胎盘或在其它实施方案中切碎其一部分来获得；或者，在其它实施方案中，通过切碎除羊膜、绒毛膜和/或脐带之外的整个胎盘来获得。[0108]在各种实施方案中，胎盘细胞可以得自足月或早产胎盘。在一些实施方案中，任选将胎盘组织切碎，然后进行酶消化。在其它实施方案中，可以通过用消化酶(见下文)和/或物理破碎处理组织来制备单细胞悬浮液，物理破碎的非限制性实例是切碎和通过尼龙过滤器或通过轻柔移液(例如falcon,becton,dickinson,sanjose,ca)冲洗组织部分。在一些实施方案中，组织处理包括使用dnase，其非限制性实例是merck的benzonase。[0109]任选地，在细胞收获前从胎盘中除去残余的血液。这可以通过本领域技术人员已知的多种方法(例如通过灌流)来完成。本文所用的术语“灌流(perfuse或perfusion)”是指使流体倒入或流经器官或组织上或倒入或流经器官或组织中的行为。在某些实施方案中，胎盘组织可以来自任何哺乳动物，而在其它实施方案中，胎盘组织是人。胎盘组织的便利来源是产后胎盘(例如，出生后不到10小时)，然而，技术人员可以考虑多种胎盘组织或细胞的来源。在其它实施方案中，胎盘在出生后8小时内、6小时内、5小时内、4小时内、3小时内、2小时内或1小时内使用。在某些实施方案中，胎盘在收获细胞前保持冷冻。在其它实施方案中，使用产前胎盘组织。这种组织可以例如从绒毛膜绒毛取样或通过本领域已知的其它方法获得。一旦获得胎盘细胞，在某些实施方案中，允许其粘附到粘附材料(例如，配置为表面)，从而分离粘附细胞。在一些实施方案中，供体为35岁或更年轻，而在其它实施方案中，供体可以是任何育龄妇女。[0110]在一些实施方案中，可以通过使用2d和3d培养条件的组合来增殖胎盘衍生的细胞。在2d和3d培养中增殖粘附细胞的条件将在下文和随后的实施例部分进一步描述。[0111]根据本公开，本领域技术人员应明白，在一些实施方案中，可以例如使用物理和/或酶组织破碎从胎盘中提取细胞，接着进行基于标记物的细胞分选，然后可以进行本文所述的培养方法。[0112]具有促炎细胞因子的细胞的治疗[0113]在所述方法和组合物的某些实施方案中，培养基的组成在用于扩增胎盘asc的培养过程中不变，所述胎盘asc用于所述方法和组合物中和/或用于产生所述其cm、级分或裂解物。换句话说，没有试图通过添加或去除因子或添加与先前培养基具有不同组成的新鲜培养基来有意改变培养基组成。本领域技术人员应明白，所提及的改变培养基组成不包括由于长期培养(例如由于其中的细胞吸收营养物和分泌代谢物)而自动发生的培养基组成的变化。[0114]在其它实施方案中，用于扩增的方法的步骤包括2d培养，随后进行3d培养。在某些实施方案中，3d培养方法包括以下子步骤：(a)在3d培养装置中在第一生长培养基中孵育asc，其中在所述第一生长培养基中没有添加炎性细胞因子；和(b)随后在3d培养装置中在第二生长培养基中孵育所述asc，其中所述第二生长培养基中已添加了一种或多种促炎细胞因子。本领域技术人员应明白，根据本公开，通过向培养装置中的培养基简单地添加细胞因子，或者在其它实施方案中，通过从培养装置中移除培养基并用含细胞因子的培养基替换，可将相同的3d培养装置用于第一和第二生长培养基的孵育。在其它实施方案中，在细胞因子存在下，可将不同的3d培养装置用于孵育，例如通过在添加含细胞因子的培养基之前将细胞移动(例如传代)到不同的孵育器中来进行。[0115]促炎细胞因子及包含其的方法的其它实施方案描述于pluristemltd的wo2017/141181(zamiabermanetal.)中，其通过引用并入文本中。[0116]在又一其它实施方案中，所述细胞(下文中是指在所述方法和组合物中使用的细胞，或者在其它实施方案中是指用于产生在所述方法和组合物中使用的cm或其级分的细胞)是胎儿衍生的胎盘asc(本文中也称为“胎儿asc”或“胎儿细胞”)和母体衍生的胎盘asc(本文中也称为“母体asc”或“母体细胞”)的混合物，并且主要包含母体细胞。在更具体的实施方案中，所述混合物包含至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少99.92％、至少99.95％、至少99.96％、至少99.97％、至少99.98％、或至少99.99％的母体细胞，或含有介于90-99％、91-99％、92-99％、93-99％、94-99％、95-99％、96-99％、97-99％、98-99％、90-99.5％、91-99.5％、92-99.5％、93-99.5％、94-99.5％、95-99.5％、96-99.5％、97-99.5％、98-99.5％、90-99.9％、91-99.9％、92-99.9％、93-99.9％、94-99.9％、95-99.9％、96-99.9％、97-99.9％、98-99.9％、99-99.9％、99.2-99.9％、99.5-99.9％、99.6-99.9％、99.7-99.9％、或99.8-99.9％的母体细胞。[0117]在再一其它实施方案中，所述细胞主要或完全为母体细胞制备物，或者主要或完全为胎儿细胞制备物，每种制备物代表一个单独的实施方案。主要或完全的母体细胞制备物可以通过本领域技术人员已知的方法获得，包括实施例1中详述的方案和pct公开第wo2007/108003、wo2009/037690、wo2009/144720、wo2010/026575、wo2011/064669和wo2011/132087号中详述的方案。这些公开中的每一个的内容都通过引用的方式并入本文中。主要或完全的胎儿细胞制备物可以通过本领域技术人员已知的方法获得，包括通过其标记物(例如男性胎儿的情况下为y染色体)选择胎儿细胞并扩增这些细胞。在某些实施方案中，在所述方法和组合物中使用母体细胞群。在其它实施方案中，使用胎儿细胞。[0118]在其它实施方案中，所述细胞是不包含可检测量的母体细胞的群体，因此完全是胎儿细胞。可检测量是指如本文所述，使用存在于母体细胞而非胎儿细胞上的标记物或标记物组合，通过facs可检测到的细胞量。在某些实施方案中，“可检测量”可以指至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、或至少1％。[0119]在又一其它实施方案中，所述制备物是胎儿和母体细胞的混合物，且富含胎儿细胞。在更具体的实施方案中，所述混合物包含至少70％的胎儿细胞。在更具体的实施方案中，至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是胎儿细胞。cd200的表达可以在一些条件下用作胎儿细胞的标记物，所述表达使用同种型对照来定义阴性表达，通过流式细胞术来测量。在再一其它实施方案中，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.9％的所述细胞是胎儿细胞。[0120]在更具体的实施方案中，所述混合物包含20-80％的胎儿细胞；30-80％的胎儿细胞；40-80％的胎儿细胞；50-80％的胎儿细胞；60-80％的胎儿细胞；20-90％的胎儿细胞；30-90％的胎儿细胞；40-90％的胎儿细胞；50-90％的胎儿细胞；60-90％的胎儿细胞；20-80％的母体细胞；30-80％的母体细胞；40-80％的母体细胞；50-80％的母体细胞；60-80％的母体细胞；20-90％的母体细胞；30-90％的母体细胞；40-90％的母体细胞；50-90％的母体细胞；或者60-90％的母体细胞。[0121]在某些实施方案中，所述asc区别于间充质基质细胞(msc)，msc在某些实施方案中可从骨髓中分离出来。在进一步的实施方案中，细胞是由themesenchymalandtissuestemcellcommitteeoftheinternationalsocietyforcellulartherapy(dominicietal.,2006)基于以下3个标准定义的人msc：1.在标准培养条件下(α最低必需培养基+20％牛胎儿血清(fbs))保持塑料粘附。2.表达表面分子cd105、cd73和cd90，以及不表达cd45、cd34、cd14或cd11b、cd79α或cd19和hla-dr。3.体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力。相比之下，在某些实施方案中，所述胎盘细胞的特征在于分化潜能下降，如本文中进一步举例说明和描述的那样。[0122]无血清和血清替代培养基[0123]在其它实施方案中，所述细胞群是通过在含有少于5％动物血清的培养基中扩增胎盘asc的群体而产生的。在某些实施方案中，细胞群至少主要包含胎儿细胞(称为“胎儿细胞群”)，或者在其它实施方案中，至少主要包含母体细胞(“母体细胞群”)。在其它实施方案中，在所述方法和组合物中使用了得自母体细胞的因子，或者在其它实施方案中使用了得自胎儿细胞的因子。[0124]在某些实施方案中，前述培养基包含少于4％；少于3％；少于2％；少于1％；少于0.5％；少于0.3％；少于0.2％；或少于0.1％的动物血清。在其它实施方案中，所述培养基不含动物血清。在其它实施方案中，培养基是没有添加血清的成分限定培养基。低血清和无血清培养基统称为“血清缺乏培养基”。[0125]本领域的技术人员应明白，本文中提及的动物血清包括来自多种物种的血清，只要所述血清刺激asc群的扩增。在某些实施方案中，血清是哺乳动物血清，其非限制性实例是人血清、牛血清(例如，胎牛血清和小牛血清)、马血清、山羊血清和猪血清。[0126]在其它实施方案中，所述细胞群通过包括以下步骤的方法产生：a.在第一培养基中孵育asc群，其中所述第一培养基含有少于5％的动物血清，从而获得第一扩增细胞群；和b.在第二培养基中孵育第一扩增细胞群，其中所述第二培养基也含有少于5％的动物血清，并且其中将一种或多种活化成分添加到第二培养基中。所述第二培养基在本文中也可称为活化培养基。在其它实施方案中，第一培养基或第二培养基是不含血清的，或在其它实施方案中第一和第二培养基都不含血清。在又一其它实施方案中，所述第一培养基包含添加了一种或多种生长因子的第一基础培养基，统称为“第一扩增培养基”(任选向其中添加小浓度的动物血清)；并且所述活化培养基包含添加了一种或多种生长因子的第二基础培养基(“第二扩增培养基”)，向所述第二基础培养基中添加了(一种或多种)活化成分。在更具体的实施方案中，第二扩增培养基与第一扩增培养基相同；而在其它实施方案中，第二扩增培养基的一个或多个成分不同于第一扩增培养基。[0127]在某些实施方案中，在第一培养基中孵育asc群的前述步骤进行至少17次倍增，或者在其它实施方案中进行至少6次、8次、12次、15次或至少18次倍增；或12-30、12-25、15-30、15-25、16-25、17-25或18-25次倍增。[0128]在其它实施方案中，在上述第一培养基中孵育asc群以进行限定数量的传代，例如2-3次传代，或在其它实施方案中1-4次传代、1-3次传代、1-2次传代或2-4次传代；或者限定次数的群体倍增，例如4-7次，或者在其它实施方案中至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、4-10次、4-9次、4-8次、5-10次、5-9次或5-8次。然后将细胞冷冻保存，接着在第一培养基中进行额外培养。在一些实施方案中，在第一培养基中额外培养进行6-10次群体倍增，或者在其它实施方案中进行至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、6-20次、7-20次、8-20次、9-20次、10-20次、6-15次、7-15次、8-15次、9-15次或10-15次群体倍增。或者，在第一培养基中额外培养进行2-3次传代，或者在其它实施方案中进行至少1次传代、至少2次、至少3次、1-5次、1-4次、1-3次、2-5次或2-4次传代。[0129]在又一其它实施方案中，在第二培养基中进行孵育第一扩增细胞群的步骤以进行限定数量的总传代，例如3-5次传代，或者在其它实施方案中为1-4、1-3、2-3、2-5或2-4次传代；或者限定次数的总群体倍增，例如12-20次，或者在其它实施方案中为12-15次，或者在其它实施方案中为15-20、12-18、12-16、14-20或14-18次倍增。[0130]在其它实施方案中，asc群在第二培养基中孵育限定的天数，例如4-10天、5-10天、6-10天、4-9天、4-8天、4-7天、5-9天、5-8天、5-7天、6-10天、6-9天或6-8天；或者限定数量的群体倍增，例如至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、3-10次、3-9次、3-8次、4-10次、4-9次或4-8次。然后在生物反应器中的第二培养基中对细胞进行额外培养。在一些实施方案中，生物反应器培养进行至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、4-10、4-9、4-8、5-10、5-9、5-8、6-10、6-9或6-8次群体倍增；或者在其它实施方案中，持续至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、4-15天、4-12天、4-10天、4-9天、4-8天、4-7天、4-15天、5-12天、5-10天、5-9天、5-8天、5-7天、6-15天、6-12天、6-10天、6-9天、6-8天或6-7天。在某些实施方案中，生物反应器包含3d载体，在3d载体上培养细胞。[0131]在某些实施方案中，在前述两阶段孵育之前在含有超过5％动物血清的培养基(例如如本文所述)中进行培养。通常，对于这样的实施方案，保留了前述步骤的命名。因此，第一培养基(含有少于5％的动物血清)仍保留其“第一培养基”的命名，而活化培养基保留其“第二[或活化]培养基”的命名。[0132]在某些实施方案中，所述无血清的培养基补充有在没有血清的情况下刺激细胞扩增的因子。这种培养基在本文中称为血清替代培养基或srm，且其在例如细胞培养和扩增中的用途在本领域中是已知的，并且例如kinzebachetal.中所述。[0133]srm制剂包括mscxf全培养基(包括补充剂)和mscxf基础培养基(biologicalindustries)；sfm和sfm-xf(thermofisherscientific)；pprf-msc6；d-hesf10；therapeaktmmscgm-cdtm(lonza，目录号190632)；以及mesencult-xf(stemcelltechnologies，目录号5429)。培养基包含pdgf-bb、bfgf、tgf-β和胰岛素(chaseetal.)。us2010/0015710中描述了pprf-msc6的组成，该专利通过引用方式并入本文中。d-hesf10包含胰岛素(10mcg/ml)；转铁蛋白(5mcg/ml)；与牛白蛋白缀合的油酸(9.4mcg/ml)；fgf-2(10ng/ml)；和tgf-β1(5ng/ml)，以及肝素(1mg/ml)和标准培养基成分(mimuraetal.)。[0134]在又一其它实施方案中，使用化学成分确定的培养基。化学成分确定的培养基的一个非限制性实例包含补充有50ng/mlpdgf-bb、15ng/mlbfgf和2ng/mltgf-β的dmem/f-12。这种培养基产生了与sfm-xf相似的效果。dmem/f-12是一种已知的基础培养基，可从thermofisherscientific(目录号10565018)购得。1-10、1-8、1-7、1-6、1-5、2-20、2-15、2-10、3-20、3-15、3-10、3-8、3-7、4-8、4-7、4-6、4.5-5.5、约5或5ng/ml的浓度存在。[0142]在其它实施方案中，pdgf(若存在)以1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-10、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-50、2-40、2-30、2-20、2-15、2-10、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、3-50、3-40、3-30、3-20、3-15、3-10、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-40、4-30、4-20、5-40、5-30、5-20、5-15、5-12、5-10、10-20、10-18、10-16、或10-15、2-20、约2、约3、约5、约10、约15、约20、2、3、5、10、15或20ng/ml的浓度存在。[0143]在又一其它实施方案中，从胎盘中提取asc到含血清的培养基中。在estherlukasiewiczhagai等人名下的国际专利申请wo2016/098061的实例1中描述了一种非限制性的提取方案，该申请案于2016年6月23日公开，其全部内容通过引用方式并入本文中。在初始提取后，在进一步的实施方案中，将细胞在srm中扩增，在一些实施方案中传代约2-3次，或者通常在第一次传代后进行约4-12次群体倍增。在再一进一步的实施方案中，在培养后任选进行细胞浓缩、配制和冷冻保存，以及任选的解冻和额外培养。在某些实施方案中，初始培养全部在2d基材上进行。本领域技术人员应明白，冷冻保存赋形剂的非限制性实例包括dmso和血清。本文描述了冷冻保存培养基的其它实施方案。[0144]在某些实施方案中，在上述培养步骤之后，在生物反应器中进行培养，在一些实施方案中，所述培养在srm中进行。在其它实施方案中，所述生物反应器包含含血清的培养基。在更具体的实施方案中，生物反应器培养进行2-5次额外的倍增，或者在其它实施方案中进行高达10次额外的倍增。在某些实施方案中，生物反应器包含3d基材。在其它实施方案中，使用血小板裂解物代替血清，血小板裂解物的非限制性实例是人血小板裂解物。在又一其它实施方案中，用含细胞因子的培养基代替含血清的培养基。[0145]任选地，在生物反应器生长之后可以进行收获、细胞浓缩、洗涤、配制和/或冷冻保存中的任何一项或全部。[0146]在其它实施方案中，在sfm/spm中孵育asc群的步骤在分批培养中进行，并且后续步骤的至少一部分在灌流下进行。在又一其它实施方案中，在灌流下在含血清培养基中进行额外扩增之前，在分批培养中启动上述后续步骤以持续2-6次，或者在其它实施方案中持续至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、1-5、2-5、3-5、1-2、1-3或1-5次细胞倍增。[0147]其它sfm和srm的实施方案公开在2019年3月28日以liorraviv等人的名义提交的国际专利申请公开第wo2019/186471号中，其通过引用的方式并入本文中。[0148]asc的表面标记物和额外特征[0149]可选地或额外地，所述的asc(其用于所述方法和组合物中，或用于产生cm、裂解物、或其级分)可以表达具有msc或间充质样基质细胞特征的标记物或一组标记物(例如表面标记物)。在一些实施方案中，asc表达以下标记物中的一些或全部：cd105(uniprotkb登录号p17813)、cd29(uniprotkb登录号p05556)、cd44(uniprotkb登录号p16070)、cd73(uniprotkb登录号p21589)、以及cd90(uniprotkb登录号p04216)。在一些实施方案中，asc不表达以下标记物中的一些或全部：cd3(例如，uniprotkb登录号p09693[γ链]p04234[δ链]、p07766[ε链]和p20963[ζ链])、cd4(uniprotkb登录号p01730)、cd11b(uniprotkb登录号p11215)、cd14(uniprotkb登录号p08571)、cd19(uniprotkb登录号p15391)、和/或cd34(uniprotkb登录号p28906)。在更具体的实施方案中，asc还缺乏cd5(uniprotkb登录号p06127)、cd20(uniprotkb登录号p11836)、cd45(uniprotkb登录号p08575)、cd79-α(uniprotkb登录号b5qtd1)、cd80(uniprotkb登录号p33681)和/或hla-dr(例如，uniprotkb登录号p04233[γ链]、p01903[α链]和p01911[β链])的表达。上述非限制性标记物表达模式在某些在3d基材上扩增的母体胎盘细胞群中被发现。本段提到的所有uniprotkb条目都是在2014年7月7日访问的。本领域技术人员应明白，诸如cd3和hla-dr的复合抗原的存在可以通过识别它们的任何组成部分的抗体来检测，例如但不限于本文所述的那些。[0150]在一些实施方案中，asc具有不同于骨髓间充质干细胞(bm-msc)的标记物表型。在某些实施方案中，asc中cd10的表达为阳性(在一些实施方案中，其在母体和胎儿asc中均出现)；cd49d的表达为阳性(在一些实施方案中，其至少出现在母体asc中)；cd54的表达为阳性(在一些实施方案中，其在母体和胎儿asc中均出现)；或者在其它实施方案中，cd56的表达为双峰(在一些实施方案中，其出现在母体asc中)；和/或cd106的表达为阴性。除非另有说明，双峰是指细胞群中有显著百分比(例如至少20％)的细胞表达感兴趣的标记物，且有显著百分比的细胞不表达该标记物的情形。[0151]标记物的“阳性”表达表示高于同型对照直方图主峰范围的值；该术语在本文中与将细胞表征为“表达”标记物同义。标记物的“阴性”表达表示低于同型对照直方图主峰范围的值；该术语在本文中与将细胞表征为“不表达”标记物同义。标记物的“高”表达和术语ꢀ“高表达”表示表达水平比同型对照直方图或与所述同型对照直方图匹配的钟形曲线的表达峰高多于2个标准差。[0152]相对于同型对照，如果蛋白质或因子的存在可通过标准方法检测到，则将细胞称为表达所述蛋白质或因子，标准方法的一个实例是使用荧光活化细胞分选(facs)。本文提及的“分泌”是指所示因子高于标准测定中的背景水平的可检测到的分泌。例如，可以将0.5x106的胎儿或母体asc悬浮在4ml培养基(dmem+10％fbs+2mml-谷氨酰胺)中，并添加到6孔板的每个孔中，然后在加湿的培养箱(5％co2，37℃)中培养24小时。24小时后，移除dmem，并将细胞在1mlrpmi1640培养基+2mml-谷氨酰胺+0.5％hsa中再培养24小时。从所述板收集cm，通过离心除去细胞碎片。[0153]根据一些实施方案，所述asc能够抑制对象的免疫反应。确定细胞群免疫抑制能力的方法是本领域技术人员熟知的，并且示例性方法在pct公开第wo2009/144720号的实施例3中描述，其全部内容通过引用的方式并入本文中。例如，可以进行混合淋巴细胞反应(mlr)。在一个示例性的非限制性的mlr试验中，在存在或不存在待测试的细胞群的情况下，将经照射的脐带血(icb)细胞(例如人细胞或来自另一物种的细胞)与外周血衍生的单核细胞(pbmc；例如人pbmc或另一物种的pbmc)一起孵育。与免疫应答强度相关的pbmc细胞复制可以通过本领域已知的多种方法来测量，例如通过3h-胸腺嘧啶脱氧核苷摄入来测量。当与测试细胞共同孵育时，pbmc细胞复制的减少表明免疫抑制能力。或者，可以用外周血衍生的mnc代替cb细胞来进行类似的试验。可选地或额外地，当在有或没有asc的情况下，可以测量当受到刺激时(例如通过与非匹配细胞或与非特异性刺激物如pha一起孵育)，血细胞群(如cb细胞或pbmc)的促炎和抗炎细胞因子的分泌。在某些实施方案中，例如在人asc的情况下，如wo2009/144720中所提供的，当150,000个asc与50,000个同种异体pbmc共孵育48小时，随后用1.5mcg/ml的lps刺激5小时，pbmc分泌的il-10的量为不存在asc的情况下用lps刺激观察到的量的至少120％、至少130％、至少150％、至少170％、至少200％或至少300％。[0154]在其它实施方案中，asc分泌促进血管发生的(一种或多种)因子。在某些实施方案中，asc分泌选自vegf(血管内皮生长因子)、血管生成素、angiopoietin1、mcp-1、il-8、serpine1和gcp2/cxcl6的因子。在其它实施方案中，asc分泌vegf、angiogenin、angiopoietin1、mcp-1、il-8和serpine1，这些因子发现是由母体细胞分泌的。在其它实施方案中，asc分泌vegf、angiogenin、angiopoietin1、mcp-1、il-8、serpine1、以及gcp2/cxcl6，这些因子发现是由胎儿细胞分泌的。[0155]在再一其它实施方案中，asc分泌(一种或多种)抗纤维化因子。在某些实施方案中，asc分泌选自serpine1(纤溶酶原活化剂抑制剂1；uniprot登录号p05121)和upar(尿激酶型纤溶酶原活化剂表面受体；uniprot登录号q03405)的因子。在其它实施方案中，asc分泌促进的因子。在又一其它实施方案中，asc分泌serpine1和upar，这些因子发现是由母体和胎儿细胞分泌的。本段提到的所有uniprot条目都是在2017年4月3日访问的。[0156]在其它实施方案中，asc分泌(一种或多种)促进细胞外基质(ecm)重塑的因子。在某些实施方案中，asc分泌选自timp1、timp2、mmp-1、mmp-2和mmp-10的因子。在其它实施方案中，asc分泌timp1、timp2、mmp-1、mmp-2和mmp-10，这些因子发现是由母体细胞分泌的。在其它实施方案中，asc分泌timp1、timp2、mmp-1和mmp-10，这些因子发现是由胎儿细胞分泌的。[0157]在其它实施方案中，当在2d条件下培养时，所述asc呈现纺锤形。[0158]根据一些实施方案，asc表达cd200，而在其它实施方案中，asc缺乏cd200的表达。在又一其它实施方案中，少于30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％或2％、1％或0.5％的粘附细胞表达cd200。在再一其它实施方案中，大于70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％或98％、99％或99.5％的粘附细胞表达cd200。[0159]在又一其它实施方案中，所述asc具有zamiaberman等人的国际专利申请公开第wo2019/239295号(于2019年6月10日提交且通过引用的方式并入本文中)中提及的任何其它标记物表型、其它特征(例如，(一种或多种)因子的分泌、分化能力、抗分化性、抑制t细胞增殖或刺激成肌细胞增殖)或其组合。[0160]在又一其它实施方案中，细胞可以是同种异体的，或者在其它实施方案中，细胞可以是自体的。在其它实施方案中，细胞可以是新鲜的，或者在其它实施方案中，可以是冷冻的(例如，冷冻保存的)。[0161]在某些实施方案中，在所述的方法和组合物中使用任何前述的asc群。在其它实施方案中，在所述方法和组合物中使用得自细胞的裂解物或cm、或其级分。每个群体可以自由地与所述的每种美容治疗组合，并且每个组合代表一个单独的实施方案。此外，在各种实施方案中，用于产生cm或包含在所述组合物中的细胞相对于被治疗的对象是自体的、同种异体的或异种的。每种类型的细胞可以与本文提到的治疗实施方案自由组合。[0162]制备asc和由其衍生的裂解物、cm和级分的额外方法特征[0163]在一些实施方案中，所述胎盘asc已经在3d生物反应器中孵育。在一些实施方案中，所述级分(例如外泌体)是从3d生物反应器产生的cm中分离出来的，在所述cm中已经孵育了asc。每个所述的细胞扩增的实施方案可以与任何所述的asc、cm、裂解物或由其衍生的外泌体的治疗用途的实施方案组合。[0164]在一些实施方案中，所述的asc或cm是从其中已孵育了asc的3d生物反应器中收获的。可选地或额外地，将细胞冷冻保存，然后解冻，之后进一步扩增细胞和/或从中分离出cm、级分、裂解物或外泌体。在其它实施方案中，解冻后，将细胞在2d培养物中培养，从中分离出asc、cm、级分、裂解物或外泌体。[0165]在某些实施方案中，如本文进一步描述的，所述asc经过或已经经过3d孵育。在更具体的实施方案中，在3d培养步骤之前，已经在2d粘附细胞培养装置中孵育了asc。在一些实施方案中，使asc在2d粘附细胞培养装置中进行孵育的先前步骤，随后进行所述的3d培养步骤。[0166]术语“二维培养”和“2d培养”是指其中细胞暴露于与细胞生长相容并允许细胞在单层中生长的条件的培养。适合这种生长的装置被称为“2d培养装置”。这种装置通常具有平坦的生长表面(也称为“二维基材”或“2d基材”)，在一些实施方案中，其包括平坦或弯曲的粘附材料。用于2d培养的装置的非限制性实例是细胞培养皿和细胞培养板。该定义中包括多层托盘，如nunctm制造的cellfactorytm，前提条件是每层都支持单层培养。应明白，即使在2d装置中，当允许过度汇合时，细胞也可以在彼此之上生长。这并不影响将装置归类为“二维的”。[0167]术语“三维培养”和“3d培养”是指其中细胞暴露于与细胞生长相容并允许细胞相对于彼此在3d方向上生长的条件的培养。术语“三维(或3d)培养装置”是指用于在与细胞生长相容并允许细胞相对于彼此在3d方向生长的条件下培养细胞的装置。这种装置通常具有3d生长表面(也称为“三维基材”或“3d基材”)，在一些实施方案中，其包括存在于3d培养装置(例如生物反应器)中的粘附材料。适于扩增粘附基质细胞的3d培养条件的某些非限制性实施方案描述于pct申请公开第wo/2007/108003号中，其全部内容通过引用的方式并入本文中。[0168]在各种实施方案中，“粘附材料”是指合成的材料，或者在其它实施方案中是天然存在的材料，或者在其它实施方案中是两者的组合。在某些实施方案中，所述材料是非细胞毒性的(或者，在其它实施方案中，是生物相容的)。可选地或额外地，所述材料是纤维性的，在更具体的实施方案中，其可以是纺织纤维基质、非纺织纤维基质或任何类型的纤维基质。[0169]在又一其它实施方案中，使所述asc经受或已经经受于2019年6月10日提交的zamiaberman等人的国际专利申请公开第wo2019/239295号中提到的培养条件(例如生长基材、孵育时间、生物反应器、接种密度或收获密度)，该案通过引用方式并入本文中。[0170]在其它实施方案中，3d培养的长度为至少4天；在4-12天之间；在其它实施方案中，在4-11天之间；在其它实施方案中，在4-10天之间；在其它实施方案中，在4-9天之间；在其它实施方案中，在5-9天之间；在其它实施方案中，在5-8天之间；在其它实施方案中，在6-8天之间；或者在其它实施方案中，在5-7天之间。在其它实施方案中，3d培养进行5-15次细胞倍增，在其它实施方案中5-14次倍增，在其它实施方案中5-13次倍增，在其它实施方案中5-12次倍增，在其它实施方案中5-11次倍增，在其它实施方案中5-10次倍增，在其它实施方案中6-15次细胞倍增，在其它实施方案中6-14次倍增，在其它实施方案中6-13次倍增，或在其它实施方案中6-12次倍增，在其它实施方案中6-11次倍增，或在其它实施方案中6-10次倍增。[0171]在某些实施方案中，3d培养可以在3d生物反应器中进行。在一些实施方案中，3d生物反应器包括用于容纳培养基的容器和布置在其中的3d附着基材，以及控制装置，所述控制装置用于控制ph、温度和氧气水平以及任选的其它参数。术语附着基材和生长基材是可互换的。[0172]图1中描述了另一个示例性的非限制性生物反应器celligen310bioreactor。纤维床篮(16)装有聚酯圆盘(10)。在一些实施方案中，容器通过外部端口(1[该端口在其它实施方案中也可用于细胞收获])填充去离子水或等渗缓冲剂，然后任选地进行高压灭菌。在其它实施方案中，在灭菌后，用生长培养基替换液体，从而使(9)中所示的圆盘床饱和。在又一其它实施方案中，在接种前设定温度、ph、溶解氧浓度等。在再一其它实施方案中，使用缓慢的初始搅拌速率来促进细胞附着，然后增强搅拌。可选地或额外地，通过经由外部端口(2)添加新鲜培养基启动灌流。如果需要，可以从篮(8)上方的无细胞培养基中收获代谢产物。在一些实施方案中，叶轮的旋转在导流管(18)中产生负压，这使得不含细胞的流出物从储罐(15)经由导流管、然后经由叶轮端口(19)，从而导致培养基在连续回路中均匀循环(12)。在其它实施方案中，调节管(6)以控制液位；在一些实施方案中，该管的外部开口(4)用于收获。在其它实施方案中，环形喷射器(不可见)位于叶轮通气室(11)内，用于通过从外部端口(3)(其可保持在壳体(5)内)和喷射器管线(7)添加的气体对流经叶轮的培养基加氧。可选地或额外地，局限在远端室中的喷射气体被营养培养基吸收，所述培养基冲刷固定化的细胞。在又一其它实施方案中，存在水套(17)，其配有将水套移入(13)和移出(14)的端口。[0173]在又一其它实施方案中，基质类似于celligentmplugflow生物反应器，在某些实施方案中，其填充有载体(或在其它实施方案中，为其它载体)。[0174]在某些实施方案中，可以进行对asc的进一步纯化或富集的步骤。这种方法包括但不限于使用asc标记物进行细胞分选，和/或在各种实施方案中，使用间充质基质细胞或间充质样asc的标记物进行细胞分选。[0175]在这种背景下，细胞分选指的是基于细胞一个或多个标记物的表达、一个或多个标记物的表达缺失或其组合来选择细胞的任何程序，无论其是手动的、自动的，等等。本领域技术人员应明白，来自一个或多个标记物的数据可以在分选过程中单独使用或组合使用。[0176]在更具体的实施方案中，当基质保留在生物反应器中时，可以从3d基质中移取细胞。在某些实施方案中，在从生物反应器收获时，至少约10％、20％或30％的细胞处于s期和g2/m期(共计)。[0177]在某些实施方案中，收获方法包括振动或搅拌，例如pct国际申请公开第wo2012/140519号中所述，其通过引用方式并入本文中。在某些实施方案中，在收获期间，在用蛋白酶处理期间或在其它实施方案中用蛋白酶处理期间和之后，将细胞以0.7-6赫兹搅拌，或在其它实施方案中以1-3赫兹搅拌，所述蛋白酶任选地还包含钙螯合剂。在某些实施方案中，将含有细胞的载体以0.7-6赫兹搅拌，或者在其它实施方案中以1-3赫兹搅拌，同时浸没在包含蛋白酶的溶液或培养基中，所述蛋白酶任选地还包含钙螯合剂。[0178]本领域技术人员应明白，各种等渗缓冲剂都可用于洗涤细胞和类似的用途。汉克氏平衡盐溶液(hbss；lifetechnologies)只是众多可使用的缓冲剂之一。[0179]对于在所述方法中使用的任何制备物，其治疗有效量或剂量初始可根据体外和细胞培养试验进行估计。通常，在动物模型中配制剂量以实现期望的浓度或滴度。这种信息可用于更准确地确定对人有用的剂量。[0180]本文所述活性成分的毒性和治疗功效可在体外、在细胞培养物或实验动物中通过标准制药程序确定。[0181]从这些体外和细胞培养试验以及动物研究中获得的数据可用于配制一系列供人使用的剂量。剂量可以根据采用的剂型和施用途径而变化。在一些实施方案中，确切的制剂、施用途径和剂量可以由各个医师根据患者的状况来选择。[0182]根据待治疗状况的严重程度和反应性，可以是单次给药，或者在其它实施方案中，可以是多次施用，疗程持续2天至3周，或者在其它实施方案中，持续3周至3个月，或者在其它实施方案中，持续直到疾病状态得到缓解。[0183]在某些实施方案中，在施用后，大部分细胞在施用后1个月内在对象体内不再能检测到，在其它实施方案中，超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过95％、超过96％、超过97％、超过98％或超过99％的细胞在施用后1个月内在对象体内不再能检测到。[0184]制剂[0185]在某些实施方案中，所述组合物是表面组合物，其通过将一种或多种赋形剂(例如稳定剂和渗透增强物质)添加到未稀释的裂解物、cm或其级分而制备。在其它实施方案中，所述组合物是表面组合物，其通过将一种或多种赋形剂添加到浓缩的裂解物、cm或其级分而制备。在其它实施方案中，所述组合物是表面组合物，其通过将一种或多种赋形剂添加到稀释的裂解物、cm或其级分而制备。在其它实施方案中，所述组合物是表面组合物，其通过将一种或多种赋形剂添加到浓缩的外泌体制备物而制备。[0186]在其它实施方案中，所述组合物是可注射的组合物，其通过向胎盘asc、裂解物、cm(例如未稀释的cm)或其级分添加一种或多种赋形剂，例如稳定剂和水性缓冲剂而制备。在其它实施方案中，所述组合物是可注射的组合物，其通过将一种或多种赋形剂添加到浓缩的裂解物、cm或其级分而制备。在其它实施方案中，所述组合物是可注射的组合物，其通过将一种或多种赋形剂添加到稀释的裂解物、cm或其级分而制备。在其它实施方案中，所述组合物是可注射的组合物，其通过将一种或多种赋形剂添加到浓缩的外泌体制备物而制备。[0187]在其它实施方案中，洗涤asc以除去其中存在的血清。在更具体的实施方案中，异种血清成分可以减少至少90％、95％、99％、99.5％、99.8％或99.9％，或者在其它实施方案中，用标准方法(例如质谱法)检测不到。[0188]在又一其它实施方案中，所述裂解物或cm以其原始浓度存在。在其它实施方案中，将裂解物或cm稀释至原始浓度的5-7％、7-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-85％、85-90％、90-95％或95-100％。在其它实施方案中，将裂解物或cm浓缩至原始浓度的150-300％、150-400％、150-500％、150-200％、120-150％、120-300％或120-200％。[0189]在其它实施方案中，将裂解物、cm或级分处理以除去其中存在的血清。在更具体的实施方案中，异种血清成分可以减少至少90％、95％、99％、99.5％、99.8％或99.9％，或者在其它实施方案中，用标准方法(例如质谱法)检测不到。[0190]在其它实施方案中，所述组合物的载体选自混悬液和乳液。在其它实施方案中，载体选自霜剂、软膏、泡沫、糊剂、化妆品、化妆品精华液(serum)制剂或吸收基(absorptionbase)组合物，其中每一个都代表一个单独的实施方案。[0191]泡沫[0192]在其它实施方案中，将所述组合物配制成泡沫。除非另有说明，泡沫是指一种分散体，其中大部分体积的气体以气泡的形式分散在液体、固体或凝胶中。气泡的直径通常大于1微米，但是气泡之间的薄层厚度一般在通常的胶体尺寸范围内，即在1纳米和1微米之间。在某些实施方案中，泡沫用于所述裂解物、cm或级分。[0193]化妆品精华液制剂[0194]本领域技术人员应明白，化妆品精华液制剂(也称为化妆品精华液)是不包含阻止水分蒸发的封闭保湿成分(例如凡士林或矿物油)的表面制剂。它们也比霜剂含有更少的润滑剂和增稠剂。在某些实施方案中，化妆品精华液是水基的，完全消除了油。在优选的实施方案中，化妆品精华液表现出快速吸收和渗透到头皮深层的能力，同时其还具有不油腻的表面和含有非常高浓度活性物质的强力配方。在某些实施方案中，化妆品精华液含有以重量计超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％或超过90％的活性成分。在某些实施方案中，将化妆品精华液制剂用于所述裂解物、cm或级分。[0195]凝胶[0196]在其它实施方案中，所述组合物是凝胶。除非另有说明，凝胶是指一种非流动的胶体网络或聚合物网络，其通过流体扩张至整个体积。在某些实施方案中，asc裂解物、cm或其级分分散在凝胶中。[0197]霜剂[0198]在某些实施方案中，所述组合物是霜剂。在更具体的实施方案中，霜剂可以进一步包含表皮渗透剂。在其它实施方案中，霜剂未进一步包含表皮渗透剂。在某些实施方案中，霜剂的粘度至少为2000厘泊，或者在其它实施方案中，至少为3000厘泊，或者在其它实施方案中，至少为5000厘泊，或者在其它实施方案中，至少为10,000厘泊。iupac对霜剂的定义是通过霜化稀乳液形成的高浓度乳液，其中霜化(creaming)是指在重力或离心力场作用下将稀乳液宏观分离成高度浓缩的乳液(其中球间接触很重要)和连续相。这种分离通常向上发生，但是如果分散相和连续相的相对密度使得浓缩的乳液向下沉降，则该术语仍然适用。在某些实施方案中，asc裂解物、cm或其级分分散在霜剂中。[0199]本文提到的粘度是指在标准大气条件下(25℃和1巴的压力)测量的粘度。[0200]表皮渗透剂[0201]除非另有说明，术语表皮渗透剂是指相对于不存在所述剂或物质转运的情况下，增加转运药剂或其它有益物质进入头皮的剂。渗透剂的非限制性实例包括曲树脂纤辣椒或其组分，或含有与烃链连接的杂环的特定分子。在某些实施方案中，表皮渗透剂与包含所述裂解物、cm或级分的制剂一起使用。[0202]表皮渗透剂的额外非限制性实例包括阳离子、阴离子或非离子表面活性剂(例如十二烷硫酸钠、polyoxamers等)；脂肪酸和醇(例如，乙醇、油酸、月桂酸、脂质体等)；抗胆碱能剂(例如，苯咯溴铵、奥芬溴铵)；烷酮(例如正庚烷)；酰胺(例如，尿素、n,n‑ꢀ二甲基-间甲苯酰胺)；脂肪酸酯(例如，正丁酸酯)；有机酸(例如柠檬酸)；多元醇(例如，乙二醇、甘油)；亚砜(例如，二甲基亚砜)；萜烯(例如，环己烯)；尿素；糖；碳水化合物或其它剂。[0203]其它的表皮渗透剂描述于arnaudgrenier、darionorbertorcarrara和celinebesse的美国专利第7,425,340号中，该案以引用的方式并入本文中。[0204]软膏[0205]在其它实施方案中，所述活性成分被配制成软膏。用于所述方法和组合物的软膏可以是许多种类或类型的软膏基，例如jeanninem.conwayetal；和uspharmacopeia中所述。在更具体的实施方案中，软膏包含烃基(例如油质基)，其非限制性实例是硬石蜡、软石蜡、微晶蜡和地蜡。在其它实施方案中，软膏包含吸收基，其非限制性实例是羊毛脂肪、蜂蜡、亲水性凡士林和羊毛脂。在其它实施方案中，吸收基是油包水乳液。在其它实施方案中，软膏包含水包油乳液基(例如亲水性软膏或霜剂)。在某些实施方案中，水包油乳液基易于除去水。在再一其它实施方案中，软膏包含水溶性基(例如，水混溶基)，其非限制性实例是macrogol200、300和400以及聚乙二醇。在某些实施方案中，软膏不含不溶于水的物质，如凡士林、无水羊毛脂或蜡。在再一其它实施方案中，软膏包含乳化基，其非限制性实例是乳化蜡和西三溴胺。在再一其它实施方案中，软膏包含植物油，其非限制性实例是橄榄油、椰子油、芝麻油、杏仁油和花生油。在某些实施方案中，软膏具有至少1000厘泊的粘度。在某些实施方案中，asc裂解物、cm或其级分分散在软膏中。[0206]洗剂[0207]在其它实施方案中，所述活性成分被配制成洗剂。除非另有说明，本文提及的洗剂是指意欲应用于头皮的低粘度表面制备物。在某些实施方案中，所述洗剂是油包水乳液。在其它实施方案中，洗剂是水包油乳液。在某些实施方案中，洗剂的粘度为2000-10,000、2000-8000、3000-8000、4000-7000、5000-10,000、5000-15,000或5000-20,000厘泊。在某些实施方案中，asc裂解物、cm或其级分分散在洗剂中。[0208]乳液[0209]在其它实施方案中，所述活性成分(例如裂解物、cm或其级分)被配制成乳液。除非另有说明，本文提及的乳液是指其中液滴分散在另一种液体中的流体系统。典型地是，(a)一种液体是水性的，而另一种是有机的；和(b)一种液体(分散相)分散在另一种液体(连续相)中。在一些实施方案中，所述乳液是油/水(o/w)乳液，其中分散相是有机材料，而连续相是水或水性溶液。在其它实施方案中，所述乳液是水/油(w/o)乳液，其中分散相是水或水性溶液，而连续相是有机液体(“油”)。在又一其它实施方案中，乳液是水包油包水乳液，或者在其它实施方案例中，是油包水包油乳液。乳液在本领域中是已知的，并且描述在例如khanetal.和其中引用的参考文献中。通常，乳液含有乳化剂，例如如本文中所述。[0210]在各种实施方案中，分散相的液滴可以是无定形的、液晶的或它们的混合物。可选地或额外地，构成分散相的液滴的直径可以在10nm(纳米)至100mcm(微米)的范围内。在其它实施方案中，直径范围为10-1000nm，或者在其它实施方案中，为10-700、10-500、10-300、10-200、10-150、10-100、10-80、10-60、10-50、10-40、20-1000、20-700、20-500、20-300、20-200、20-150、20-100、20-80、20-60、20-50、20-40、30-1000、30-700、30-500、30-300、30-200、30-150、30-100、30-80、30-60、30-50、30-40、50-1000、50-700、50-500、50-300、50-200、50-150、50-100、50-80、70-1000、70-700、70-500、70-300、70-200、70-150、活性剂是指在水性溶液中解离以形成带正电荷阳离子的物质，其表现出乳化特性。阳离子表面活性剂的非限制性实例是苯扎氯铵盐、聚季铵盐化合物、聚(乙烯吡啶)和甲基丙烯酸co-n,n二甲基乙酯。在某些实施方案中，阳离子表面活性剂与非离子利泄剂结合使用。[0218]在其它实施方案中，乳化剂是阴离子表面活性剂。除非另有说明，阴离子表面活性剂是指在水性溶液中解离以形成带负电荷的阳离子的物质，其具有乳化特性。阴离子表面活性剂的非限制性实例是硬脂酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基苯磺酸钠、聚丙烯酸、阴离子硫酸盐基表面活性剂和阴离子磺酸盐基表面活性剂。[0219]在其它实施方案中，乳化剂是两性表面活性剂。除非另有说明，两性表面活性剂是指根据体系的ph，同时具有正电荷和负电荷基团的物质。它们在低ph下为阳离子型，在高ph下为阴离子型。两性表面活性剂的非限制性实例是卵磷脂。[0220]在又一其它实施方案中，乳化剂是非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的非限制性实例包括聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、脂肪酸的山梨醇酯和乙氧基化脂肪醇、以及聚山梨醇酯型非离子表面活性剂。[0221]在再一其它实施方案中，乳化剂是亲水胶体，其非限制性实例是阿拉伯胶、海藻酸盐、壳聚糖、羧甲基纤维素、交联羧甲纤维素、微晶纤维素和黄原胶。[0222]在其它实施方案中，乳化剂是固体细末，其非限制性实例是皂粘土和硅酸镁铝。[0223]在其它实施方案中，乳化剂是去垢剂，其非限制性实例是柠檬酸；柠檬酸二铵；柠檬酸钙；柠檬酸钾；柠檬酸钠；柠檬酸异丙酯；柠檬酸三乙酯；柠檬酸十八烷酯；酒石酸、葡糖二酸、粘酸、葡糖酸、抗坏血酸，以及它们的盐。其它实施方案包括亚氨基二乙酸(ida)衍生物，例如，正nta和n-甲基二钾ida。[0224]表面活性剂的其它实施方案包括烷基糖甙(“apg”)表面活性剂，其非限制性实例是以下公开的烷基多糖：giret等人的美国专利第5,776,872号；furman等人的美国专利第5,883,059号；addison等人的美国专利第5,883,062号；以及ouzounis等人的美国专利第5,906,973号，这些专利全部以引用的方式并入本文中。适用于本文的烷基糖苷也公开在llenado的美国专利第4,565,647号中，该专利描述了烷基糖苷，其具有含有约6至约30个碳原子，或约10至约16个碳原子的疏水基，以及多糖，例如，含有约1.3至约10个，或约1.3至约3个，或约1.3至约2.7个糖单元的多糖苷亲水基团。任选地，可以存在连接疏水部分和多糖部分的聚环氧烷链。合适的环氧烷是环氧乙烷。典型的疏水基团包括含有约8-18个或约10-16个碳原子的饱和或不饱和、支链或非支链的烷基。适当地，烷基可以含有至多约3个羟基和/或聚环氧烷链可以含有至多约10个或少于约5个环氧烷部分。合适的烷基多糖是辛基、壬基癸基、十一烷基十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基和十八烷基、二-、三-、四-、五-和六-葡萄糖苷、半乳糖苷、乳苷、葡萄糖、果糖苷、果糖和/或半乳糖。合适的混合物包括椰油烷基、二-、三-、四-、和五-葡萄糖苷以及牛油烷基四-、五-和六-葡萄糖苷。[0225]其它表面活性剂描述于mariaochomogo等人的us2008/0318822中，该案通过引用的方式并入本文中。[0226]本领域技术人员应明白，在一些实施方案中，洗剂和霜剂可以通过以下两步法来制备：1)将润肤剂(保湿剂)和润滑剂分散在含有混合剂和增稠剂的油中；和2)将香精、色素和防腐剂(都是可选的)分散在水循环中。活性成分在两个循环中都被分解，这取决于所涉及的原料和洗剂或霜剂的期望性质。[0227]在其它实施方案中，水包油乳液通过以下方法制备：1)向用于制备油相的油中加入薄片/粉末成分；2)分散活性成分；3)制备含有乳化剂和稳定剂的水相；4)将所述油和水混合形成乳液，在某些情况下加热至(45-85℃)之间；以及5)继续混合，直到获得最终产物。[0228]混悬液和胶体[0229]在一些实施方案中，将所述的asc(或在其它实施方案中，裂解物或cm的颗粒级分)配制成混悬液。除非另有说明，本文提及的混悬液是指固体颗粒分散在液体中。通常，混悬液是一种异质混合物，其含有足够大至沉降的固体颗粒。在更具体的实施方案中，颗粒可以是胎盘asc，或者在其它实施方案中，可以是由其衍生的物质的聚集体。[0230]在其它实施方案中，所述的asc被配制成胶体，其中悬浮颗粒较小且不沉降。在更具体的实施方案中，颗粒可以是来自胎盘asc的物质的囊泡或聚集体。[0231]纳米包封[0232]在再一其它实施方案中，将所述的胎盘asc、裂解物、cm或其级分进行纳米包封。纳米包封技术在本领域中是已知的，并且描述于例如khoee,sepideh等人的美国专利申请公开第2015/0307649号；abbasi,soleiman等人的第2015/0147367号；以及naturacosmeticoss.a名下的第2019/0031937号中，这些专利的全部内容都通过引用的方式并入本文中；以及seidmahdijafari编著的nanoencapsulationtechnologiesforthefoodandnutraceuticalindustries(academicpress)中。纳米包封技术的非限制性实例包括在聚合物材料中的包封，所述聚合物材料可以例如选自单环氧化合物、多价环氧化合物或其混合物(例如，如us2015/0307649中所述)；通过阳离子聚电解质与阴离子聚电解质的凝聚产生的聚合物(例如，如us2015/0147367中所述)；或腈基丙烯酸酯型单体的聚合物(例如，如us2019/0031937中所述)。在又一其它实施方案中，将asc或其它活性成分包封在纳米脂质颗粒中，纳米脂质颗粒的非限制性实例描述于美国专利申请公开第2017/0042826号、第20150342226号和第2012/0195940号中，所有这些专利都属于michaelw.fountain，并通过引用的方式并入本文中。[0233]在其它实施方案中，所述asc活性成分(例如，裂解物、cm或其级分)被配制在纳米球中。纳米球通常是本领域技术人员已知的，并且可从例如dermazonesolutions(st.petersburg,fl)获得。在某些实施方案中，纳米球包含磷脂部分，其非限制性实例是纳米球(dermazone)，其平均直径为125-150纳米，且可从dermazone获得。[0234]额外的药物载体[0235]在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种额外的药学上可接受的载体。本文中，术语“药学上可接受的载体”是指载体或稀释剂。在一些实施方案中，药学上可接受的载体不会对对象造成显著的刺激。在一些实施方案中，药学上可接受的载体不会消除所施用细胞的生物活性和特性。载体的实例包括但不限于丙二醇、盐水、乳液，以及有机溶剂与水的混合物。在一些实施方案中，药物载体是盐水性溶液。[0236]在其它实施方案中，组合物还包含至少一种成分以促进所述组合物的配制、稳定性和/或表面施用。在更具体的实施方案中，所述成分包括流动调节剂、填充剂、赋形剂、醇、防腐剂、悬浮剂、稳定剂、表面活性剂、油相、水相、湿润剂或增稠剂。在其它实施方案中，至少一种额外的成分包括胶体二氧化硅、二氧化钛、异丙醇、苯扎氯铵、硬脂酸、十六烷基醇、棕榈酸异丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、山梨醇、聚山梨醇酯、牛奶、椰子油、杏仁油、羊毛脂、卵磷脂或蜂蜡。在其它实施方案中，所述组合物是凝胶。在其它实施方案中，所述组合物是洗剂。[0237]在其它实施方案中，所述组合物包含胎盘asc与赋形剂的组合，所述赋形剂选自渗透保护剂或冷冻保护剂，其是保护细胞免受冷冻和结冰的损伤效应的物质。在某些实施方案中，冷冻保护剂是渗透性化合物，其非限制性实例是二甲基亚砜(dmso)、甘油、乙二醇、甲酰胺、丙二醇、聚乙二醇、乙酰胺、丙二醇和核糖醇；或者在其它实施方案中可以是非渗透性化合物，其非限制性实例是乳糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖和d-甘露醇。在其它实施方案中，渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂都存在。在其它实施方案中，赋形剂是载体蛋白，其非限制性实例是白蛋白。在又一其它实施方案中，渗透保护剂和载体蛋白都存在；在某些实施方案中，渗透保护剂和载体蛋白可以是相同的化合物。可选地或额外地，组合物是冷冻的。这些细胞可以是本文中提到的asc的任何实施方案，其中每一个都视为单独的实施方案。在更具体的实施方案中，dmso以2-5％；或者在其它实施方案中，以5-10％；或者在其它实施方案中，以2-10％、3-5％、4-6％、5-7％、6-8％、7-9％、8-10％的浓度存在。在其它实施方案中，dmso与载体蛋白一起存在，载体蛋白的非限制性实例是白蛋白，例如人血清白蛋白。[0238]在其它实施方案中，为了注射，所述的asc或其它活性成分可以配制在水性溶液中，例如在生理上相容的缓冲剂中，其非限制性实例是hank氏溶液、ringer氏溶液和生理盐水缓冲剂。[0239]途径[0240]在某些实施方案中，所述方法和组合物通过表皮途径施用，其非限制性实例是表面组合物。在其它实施方案中，所述方法和组合物通过皮内途径施用，其非限制性实例是注射的组合物。在又一其它实施方案中，所述方法和组合物通过真皮下施用，其非限制性实例是注射的组合物。在再一其它实施方案中，所述方法和组合物通过皮下施用，其非限制性实例是注射的组合物。[0241]在各种实施方案中，在皮肤损伤、或者在其它实施方案中在激光治疗1小时内、2小时内、3小时内、4小时内、6小时内、8小时内、10小时内、12小时内、15小时内、18小时内、24小时内、30小时内、36小时内、48小时内、3天内、4天内、5天内、6天内、8天内、10天内、12天内或20天内，给对象施用所述asc。在更具体的实施方案中，在皮肤损伤后、或者在其它实施方案中在激光治疗后1-24、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、8-24、10-24、12-48、1-48、2-48、3-48、4-48、5-48、6-48、8-48、10-48、12-48、18-48、24-48、1-72、2-72、3-72、4-72、5-72、6-72、8-72、10-72、12-72、18-72、24-72或36-72小时，施用所述组合物。在又一其它实施方案中，在皮肤损伤后、或者在其它实施方案中在激光治疗后3-48小时、4-48小时、5-48小时或6-48小时，施用所述组合物。[0242]在各种实施方案中，当施用胎盘asc时，不需要将所述细胞移植到宿主中以使细胞发挥所述治疗效果，其中每一个都被认为是单独的实施方案。在其它实施方案中，需要移植来使细胞发挥(一种或多种)效果。例如，在各种实施方案中，细胞在施用后其自身存活不超过3天、不超过4天、不超过5天、不超过6天、不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天或不超过14天的情况下，能够发挥治疗效果。[0243]也可以制备包含在相容的药物载体中配制的所述制备物的组合物，将其置于合适的容器中，并贴上标签以治疗指示的状况。[0244]如果需要，可以将所述组合物包装在附有施用说明的容器中。[0245]需要阐明的是，所述asc、裂解物、cm和级分的每个实施方案可以与涉及治疗方法或药物组合物的每个实施方案自由组合。[0246]对象[0247]在某些实施方案中，通过所述方法和组合物治疗的对象是患有皮肤刺激、撕裂伤、受损皮肤屏障或老化、皱纹或其它受损皮肤的人。可选地或额外地，对象已经经历了激光脱毛、微针治疗、中胚层疗法或其它皮肤治疗。在其它实施方案中，对象患有秃发。在其它实施方案中，对象表现出过度的经表皮水分丢失。在一些实施方案中，对象是男性。在其它实施方案中，对象是女性。在某些实施方案中，对象是老年对象，例如年龄超过60岁、超过65岁、超过70岁、超过75岁、超过80岁、60-85岁、65-85岁或70-85岁的对象；是少儿对象，例如年龄在18岁以下、15岁以下、12岁以下、10岁以下、8岁以下、6岁以下、5岁以下、4岁以下、3岁以下或2岁以下，或18个月、15个月、12个月、10个月、8个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月或1个月以下的对象；或者是成年对象，例如年龄在18-60岁、18-55岁、18-50岁、20-60岁、20-55岁、20-50岁、20-45岁、20-40岁、20-35岁、20-30岁、25-60岁、30-60岁、40-60岁或50-60岁的对象。在某些实施方案中，对象是动物。在一些实施方案中，所治疗的动物包括家养动物和实验室动物，例如，非哺乳动物和哺乳动物，例如非人灵长类动物、啮齿动物、猪、狗和猫。在某些实施方案中，给对象施用额外的治疗剂或细胞。[0248]本文还公开了制备的药盒和制品，其涉及可用于实施本文公开的方法的试剂。药盒和制品可包括本文所讨论的任何试剂或试剂组合，或被认为在包括asc的所公开方法的实践中是必需的或有益的，另一方面，制备的药盒和制品包括标签、说明书和包装材料，以例如用于治疗本文提及的病症或治疗适应征。[0249]对于本领域普通技术人员来说，本发明的其它目的、优点和新颖特征在检查下列实例后将变得明显，这些实例不旨在限制。此外，如上文所述和权利要求部分所要求的本发明的各种实施方案和方面的每一个都在以下实例中得到实验支持。[0250]实施例[0251]现在参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性的方式说明某些实施方案。[0252]实施例1：粘附胎盘细胞的培养和生产[0253]如国际专利申请wo2016/098061的实施例1所述，制备含有超过90％母体组织衍生细胞的胎盘衍生细胞群，该申请全部内容通过引用的方式并入本文中。[0254]对按照先前段落所述制备的胎盘细胞和bm粘附细胞进行骨生成和脂肪生成试验。在骨生成试验中，超过50％的bm细胞经过分化成为骨细胞，而没有一个胎盘衍生的细胞显示骨生成分化的迹象。在脂肪生成试验中，超过50％的bm衍生的细胞经过分化成为脂肪细胞。相反，没有一个胎盘衍生的细胞表现出脂肪细胞典型的形态变化。这些实验如wo2016/098061的实施例2所述进行，该案通过引用的方式并入本文中。[0255]实施例2：在无血清培养基(sfm)中培养胎盘细胞[0256]方法[0257]细胞收获和扩增过程由3个阶段组成，随后是下游加工步骤：阶段1，中间细胞原种(ics)生产；阶段2，解冻ics并进行初始进一步的培养步骤；和阶段3，在血清存在下进行额外的培养步骤。下游加工步骤包括从烧瓶或生物反应器中收获、细胞浓缩、洗涤、配制、填充和冷冻保存。该程序包括定期测试生长培养基的无菌性和污染，所有这些都描述于国际专利申请公开第wo2019/239295号中，该案通过引用的方式并入本文中。骨髓迁移试验也如wo2019/239295中所述进行。[0258]结果[0259]提取胎盘细胞并在无血清(sf)培养基中扩增3代。对八个批次的细胞特性进行了评估，如表1所示的代表性批次，发现它们显示出相似的细胞尺寸和pdl(自第1代以来的群体倍增水平)模式。在骨髓迁移(bmm)试验中，细胞也显著增强了造血作用。[0260]表1.在sf培养基中扩增的胎盘细胞的特征。[0261][0262]实施例3：骨细胞和脂肪细胞分化试验[0263]如实施例1所述制备asc。如estherlukasiewiczhagai和rachelofir的wo2016/098061中所述获得bm粘附细胞，该案全部内容通过引用的方式并入本文中。骨生成和脂肪生成试验如wo2016/098061中所述进行。[0264]骨细胞诱导.在骨生成诱导培养基中孵育bm衍生的粘附细胞导致超过50％的bm细胞分化，茜素红染色呈阳性证明了这一点。相反，没有一个胎盘衍生的细胞显示骨生成分化的迹象。[0265]接下来，使用包含维生素d和更高浓度的地塞米松的改良骨生成培养基。超过50％的bm细胞经过分化成为骨细胞，而没有一个胎盘衍生的细胞显示骨生成分化的迹象。[0266]脂肪细胞诱导.在脂肪细胞诱导培养基中，胎盘或bm衍生的粘附细胞的脂肪细胞分化导致超过50％的bm衍生的细胞分化，油红染色呈阳性和典型的形态变化(例如，油滴在细胞质中的积聚)证明了这一点。相反，没有一个胎盘衍生的细胞分化成脂肪细胞。[0267]接下来，使用含有更高吲哚美辛浓度的改良培养基。超过50％的bm衍生的细胞经过分化成为脂肪细胞。相反，没有一个胎盘衍生的细胞表现出脂肪细胞的典型形态变化。[0268]实施例4：进一步的骨细胞和脂肪细胞分化试验[0269]如实施例2所述制备asc。分别使用adipogenesisdifferentiationkit(gibco,cat#a1007001)和osteogenesisdifferentiationkit(gibco,cat#a1007201)评估脂肪生成和骨生成。[0270]结果[0271]对在srm或全dmem中生长的胎盘细胞测试脂肪生成和骨生成。各组如表2所示。[0272]表2：实验组[0273]组别产品批次a1骨髓衍生的msc(阳性对照)bm-122b1在srm中生长的ascpd220914sfms3r001b1.2c1在srm中生长的ascr050115r01d1在srm中生长的ascr280115r01e1在全dmem中生长的ascpt041011r36[0274]在脂肪生成试验中，用分化培养基处理的bm-msc用油红o染色呈阳性(图2)。相比之下，2/3的srm批次显示出可忽略的染色，而剩下的srm批次，以及全dmem生长的细胞，根本没有显示出任何染色，表明它们缺乏显著的脂肪生成潜力。[0275]在骨生成试验中，用分化培养基处理的bm-msc用茜素红s染色呈阳性(图3)。相比之下，在srm或全dmem培养的胎盘细胞批次中没有一个显示出染色，表明缺乏显著的骨生成潜力。[0276]实施例5：胎盘asc分泌的因子的研究[0277]在生物反应器中孵育6天后；或在板中孵育2天后(每天更换一次培养基)，分两批制备cm，每一批都含有母体asc、在含血清的培养基中扩增的胎儿asc和在sfm扩增的胎儿asc。[0278]通过测量分泌的蛋白表达。collagen1-α在所有样品中都高度表达。il-1-ra、collageniv-1a、fibronectin、il-13、hgf、vegf-a、il-4、pdgf-aa、timp-1、tgfb2、tgfb1在至少一些样品中全部显著表达，而il-16的表达水平可忽略不计或没有(图5a-j和表3-4)。[0279]表3总结了指示蛋白在生物反应器培养基中的蛋白表达。-、+、++和+++分别表示《10、10-100、100-1000和》1000pg/ml。[0280]总结[0281]蛋白质母体胎儿/血清胎儿/sfcollagen1a+++++++++il-10‑‑‑egf‑‑‑il-1ra-++++bfgf‑‑++collageniva1+++++++fibronectin+++++++++il-13++++hgf-++++++mmp-1+++++++++mmp-2+++++++++il-16+++vegf-a++++il-4+++pdgf-aa+++timp1+++++++++tgfb3‑‑‑tgfb2+++tgfb1+++++++++[0282]对来自生物反应器孵育的胎儿/胎盘asc-cm进行质谱分析，通过它们的序列鉴定人源胰蛋白酶肽。肽如表4中所示。[0283]表4来自胎盘asc-cm的胰蛋白酶肽。“hs”指智人。[0284][0285][0286][0287][0288][0289][0290]实施例6：胎盘asc的浓缩、冻干和蛋白质阵列研究[0291]使来自前述实施例中的cm进行无处理(br)、通过10kda截留膜的切向流过滤(tff；pallcorporation)、或冻干(lyp)。表5-6显示了tff和lyp的浓度数据。[0292]表5.tff的起始样品体积和浓缩系数。[0293]批次起始体积tff之后的体积浓缩系数胎儿/血清#19012x7.5胎儿/血清#224015x16母体#122015x15母体#218010x18胎儿/sfm#118012x15胎儿/sfm#222018x12[0294]表6.lyp的起始样品蛋白质浓度和浓缩系数。[0295][0296]表7总结了在有或没有浓缩过程的情况下，胎儿/血清批次中的表达水平(pg/ml)。+++表示超出试剂盒检测极限的值。[0297][0298][0299]实施例7：通过胎盘asc分泌促血管生成因子[0300]将母体胎盘asc在正常或缺氧条件下孵育，通过测量促血管生成因子的分泌。大量因子表达(图6a)。所选因子的表达通过elisa测定(图6b)。因此，胎盘asc分泌促血管生成因子。[0301]实施例8：胎盘asc-cm增加真皮成纤维细胞的增殖[0302]将hdfa(成人原代人真皮成纤维细胞；atcc目录号#pcs-201-012)细胞在培养物中扩增并在不同阶段冷冻保存，即在培养物中1天、10天和22天后(分别为2.1、8.6或12.3次群体倍增[pd])，以模拟人真皮中的年轻和年老的成纤维细胞。将细胞解冻并在完全成纤维细胞生长培养基(gm；来自atcc)中孵育72小时，所述培养基用(a)双蒸水ddw(阴性对照)；或(b)经冻干并重悬(用ddw至30mg./ml)的来自胎儿胎盘asc的cm(胎盘asc-cm)进行两倍稀释。asc-cm刺激所有年龄的成纤维细胞增殖(图7)。[0303]实施例9：胎盘asc-cm保护真皮成纤维细胞免受氧化应激[0304]将hdfa细胞暴露于200微摩尔(μm)的过氧化氢(h2o2)中3小时，然后在扩增的(a)hdfa完全gm(atcc目录号#pcs-201-041)(阴性对照)中；或(b)在hdfa完全gm中产生的母体胎盘asc-cm中孵育24小时，之后使用realtime-glotmmt细胞活力测定试剂(promega)评估细胞活力。asc-cm保护细胞免于由于氧化应激的死亡(图8)。[0305]实施例10：胎盘asc-cm增加真皮成纤维细胞的迁移[0306]将年轻或年老的hdfa细胞(0或7pd)铺板在单层中，并使用live-cellanalysis试剂盒(essenbioscience)进行分析。使用woundmakertm刮擦单层，然后在(a)无血清(sf)dmem(阴性对照)中；或(b)在冻干并重悬在sf-dmem(最终浓度为5mg/ml)中的胎儿胎盘asc-cm(来自于在生物反应器中在sfm中生长的asc)中孵育。使用试剂盒附带的照相机评估细胞向伤口区域的迁移。asc-cm在所有时间点都刺激年轻和年老细胞两者的迁移(分别见图9a-b)。同样绘制sf-dmem对直接胎儿胎盘asc-cm(来自在板中在sfm中生长的asc)的图。再一次，cm在所有时间点都刺激年轻和年老细胞的迁移(分别见图9c-d)。[0307]实施例11：胎盘asc-cm增加真皮乳头细胞的增殖[0308]将原代人毛囊真皮乳头细胞(hfdpc)在完全dmem生长培养基(gm)中扩增96小时，所述完全dmem生长培养基(gm)用(a)ddw(阴性对照)；或(b)冻干并重悬(30mg./ml)的来自胎儿胎盘asc的cm(胎盘asc-cm)进行两倍稀释。asc-cm刺激hfdpc的增殖(图10)。[0309]实施例12：来自胎盘asc的cm的额外的培养研究[0310]如上述实施例所述制备胎儿和母体胎盘asc-cm并与角质形成细胞一起孵育。分析细胞的增殖、迁移和细胞生长因子的产生，如madaanaetal.、rajendranrletal.、hwangietal.中及其中引用的参考文献中所述。[0311]实施例13：胎盘asc的体内血流研究[0312]对小鼠进行股动脉结扎，然后在第二天施用一百万个胎盘asc。asc的施用改善了血流(图11)，这通过doppler激光成像得到了证实，并且形成了功能性新血管(图11b-c)。[0313]实施例14：胎盘asc或由其衍生的因子用于毛发再生的体内研究[0314]将人头皮移植物移植到scid小鼠上，如sintovaetal.中所述，并用媒介物(阴性对照)与胎盘asc、asc裂解物、asc-cm或所述裂解物或cm的级分进行处理。进行/分析组织学、毛发生长初期/毛发生长终期比率(反映毛发周期)、ki-67/tunel染色(增殖和凋亡)、毛发计数、毛发直径和毛发长度。毛发生长增强表示有治疗效果。[0315]实施例15：胎盘asc用于毛发再生的人体试验[0316]一名患有buerger氏病和开放性慢性伤口难治疗的患者接受了2剂150x106个胎盘asc，在患肢进行了肌内施用。伤口有显著好转。此外，在患肢脚趾的背面长出了浓密的毛发，通过对治疗前(图12，左图)和治疗后(图12，右图)患趾的比较可以看出。在其它研究中，在细胞注射部位反复观察到毛发生长。[0317]在雄激素性秃发患者中进行了通过注射胎盘asc或表面asc进行毛发修复的一项安慰剂对照的i期/ii期临床研究。评估毛发密度、直径和生长速度。在其它实验中，对胎盘asc、asc裂解物、asc-cm或级分进行类似地评估。[0318]实施例16：来自胎盘asc的cm用于皮肤屏障再生的人体试验[0319]人对象在接受专业面部治疗和化学剥脱后立即接受治疗。一半的脸用含有基础霜剂(含有封闭润肤剂和/或湿润剂或修复保湿剂)的霜剂治疗，而另一半用补充有胎盘asc-cm的基础霜剂治疗。几天后，由皮肤护理专业人员对屏障恢复和皮肤修复进行评估。在其它实施方案中，使用胎盘asc、裂解物或级分。[0320]实施例17：来自胎盘asc的cm用于干燥皮肤治疗的人体试验[0321]使皮肤极度干燥的人对象在面部分割研究中接受治疗，其中使用基础霜剂与补充有胎盘asc-cm的霜剂。一个月后，通过测量经表皮水分丢失(tewl)和角质计(corneometer)测量(khazakaelectronic,germany)来评估皮肤保湿效果。在其它实施方案中，使用胎盘asc、裂解物或级分。[0322]实施例18：来自胎盘asc的cm用于皮肤光损伤治疗的的人体试验[0323]患有皮肤光损伤的人对象在面部分割研究中接受治疗，其中使用基础霜剂与补充有胎盘asc-cm的霜剂。一个月后，通过测量tewl和角质计测量来评估皮肤保湿效果。在其它实施方案中，使用胎盘asc、裂解物或级分。[0324]应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方案中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案描述的本发明的各种特征也可以单独提供或者以任何合适的变形形式提供。[0325]尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明涵盖符合本发明权利要求和说明书的精神和宽范围内的替代、修改和变化。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以及genbank登录号均以其全部内容并入本文作参考，参考度如同每个单独的出版物、专利或者专利申请或者genbank登录号特别和单独指出并入本文作参考一样。另外，本技术中任何参考文献的引用或者标识不应被解释为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。[0326]参考文献(文本中可能引用的额外参考文献)[0327]albertssonfractionationofparticlesandmacromoleculesinaqueoustwo-phasesystems.biochempharmacol.1961；5:351–8.doi:10.1016/0006-2952(61)90028-4.[0328]bakdhetal.,humanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcellsengineeredtooverexpressgrowthfactorsaccelerateoutcomesinhairgrowth.koreanjphysiolpharmacol.2018sep；22(5):555-566.[0329]berthoda,ruiz-angelmj,carda-brochs.ionicliquidsinseparationtechniques.jchromatogra.2008；1184:6–18.doi:10.1016/j.chroma.2007.11.109.[0330]bordierc.phaseseparationofintegralmembraneproteinsintritonx-114solution.jbiolchem.1981；256:1604–7.[0331]burgerdetal,isolationandcharacterizationofcirculatingmicroparticlesbyflowcytometry.methodsmolbiol.2017；1527:271-281.doi:10.1007/978-1-4939-6625-7_21.[0332]chaselgetal,developmentandcharacterizationofaclinicallycompliantxeno-freeculturemediumingoodmanufacturingpracticeforhumanmultipotentmesenchymalstemcells.stemcellstranslmed.2012oct；1(10):750–758.[0333]conwayjeanninem.etal,aflowchartforselectinganointmentbase.amjpharmeduc.2014feb12；78(1):16.doi:10.5688/ajpe78116[0334]dominicietal,minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.theinternationalsocietyforcellulartherapypositionstatement.cytotherapy.2006；8(4):315-7.[0335]griloal,raquelaires-barrosm,azevedoam.partitioninginaqueoustwo-phasesystems:fundamentals,applicationsandtrends.seppurifrev.2016；45:68–80.doi:10.1080/15422119.2014.983128.[0336]hatti-kaulr.aqueoustwo-phasesystems.molbiotechnol.2001；19:269–77.doi:10.1385/mb:19:3:269.[0337]hugelb.,martínezm.c.,kunzelmannc.,freyssinetj.m.(2005)membranemicroparticles:twosidesofthecoin.physiology20,22–27.[0338]hwangietal.,neuralstemcellsrestorehairgrowththroughactivationofthehairfollicleniche.celltransplant.2016；25(8):1439-51.[0339]kimesetal.,conditionedmediafromhumanumbilicalcordblood-derivedmesenchymalstemcellsinhibitsmelanogenesisbypromotingproteasomaldegradationofmitf.plosone.2015may29；10(5):e0128078.[0340]madaanaetal.,reviewofhairfollicledermalpapillacellsasinvitroscreeningmodelforhairgrowth.intjcosmetsci.2018oct；40(5):429-450.[0341]manjitjaiswaletal,nanoemulsion:anadvancedmodeofdrugdeliverysystem.3biotech.2015apr；5(2):123–127.[0342]jiangb,liz-g,daij-y,zhangd-j,xiuz-l.aqueoustwo-phaseextractionof2,3-butanediolfromfermentationbrothsusinganethanol/phosphatesystem.processbiochem.2009；44:112–7.doi:10.1016/j.procbio.2008.09.019.[0343]johanssonh-o,perssonj,tjerneldf.thermoseparatingwater/polymersystem:anovelone-polymeraqueoustwo-phasesystemforproteinpurification.biotechnolbioeng.1999；66:247–57.doi:10.1002/(sici)1097-0290(1999)66:4《247::aid-bit6》3.0.co；2-5.inaqueoustwo-phasesystemsofcationic-anionicsurfactantmixtures.jchromatogrb.2000；743:327–38.doi:10.1016/s0378-4347(00)00214-0.[0360]zhanghetal,identificationofdistinctnanoparticlesandsubsetsofextracellularvesiclesbyasymmetricflowfield-flowfractionation.natcellbiol.2018mar；20(3):332-343.doi:10.1038/s41556-018-0040-4.当前第1页12当前第1页12