一种双抗体组合物及其在制备治疗肝癌转移药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物制剂，具体涉及一种双抗体组合物及其在制备治疗肝癌转移药物中的应用。

背景技术：

1、肝癌是常见的恶性肿瘤之一，患者死亡率在所有恶性肿瘤中高居第二位。肝癌患者术后5年生存率较低，复发和肝内转移是患者死亡的主要原因。肿瘤细胞转移是一系列级联步骤统称，涉及原发灶扩增，局部侵袭进入循环系统，循环肿瘤细胞抵抗失巢凋亡，出血管进入转移灶以及形成转移克隆。整合素是细胞中一类跨膜二聚体蛋白家族，包含18个α亚基和8个β亚基。α亚基和β亚基形成二聚体可作为细胞膜受体感知细胞外基质成分并调控下游信号，导致细胞极性、细胞骨架结构、基因表达、细胞存活和增殖等变化。该家族成员在肿瘤细胞转移的各个环节发挥不同程度的促进作用。

2、目前整合素的抑制剂已经有多种药物，针对四种整合素：αiibβ3、α4β7、α4β1和αlβ2。αiibβ3抑制剂是最早被开发，包括两种小分子tirofiban和eptifibatide以及抗体abciximab，均针对急性冠状动脉综合征和血栓性心血管患者。此外，以整合素αlβ2为靶点的药物有一种上市的小分子lifitegrast，用于干眼症的局部治疗，αlβ2抑制剂也被研究用于自身免疫性疾病和炎症性疾病。其余上市的整合素药物vedolizumab和natalizumab是作用于白细胞整合素α4β7和α4β1的抗体，用于治疗溃疡性结肠炎、克罗恩病和多发性硬化症。目前还有两种口服α4β7拮抗剂正在进行临床试验：一种来自morphic therapeutics的小分子(i期)和一种来自protagent therapeutics的多肽(ii期)。

3、尽管靶向整合素在多种临床疾病中展现不错的疗效，但在治疗癌症方面效果欠佳。例如研究最多、进展最快的αvβ3抑制剂分子环肽cilengitide(merck kgaa)，对胶质母细胞瘤的iii期治疗试验中未能达到预期效果，总体生存率没有改善。针对αvβ3的抗体，如etaracizumab(medi-522；abergrin)也进入了包括癌症在内的多种疾病的临床试验，但进展已经停止。glpg0187是一种广谱αv抑制剂，尽管耐受性良好，但在实体瘤患者的ib期试验中同样未能显示出疗效迹象。针对肝癌转移，目前更是尚无整合素抑制剂的临床研究和应用，针对各整合素亚基在肝癌转移中作用的相关研究也较少。

4、鉴于特定单一的整合素靶向抑制剂对肿瘤的疗效有限，根据不同整合素亚基在肿瘤进展、特别是肿瘤转移不同阶段的作用，寻找能产生作用协同的整合素亚基进行抗体联合治疗，或是一项具有潜力的肿瘤转移治疗策略，但尚未有此方案成功的报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种双抗体组合物，该组合物相比两种单抗单独治疗，显示出明显协同效应，治疗效果远高于两种单抗分别单独使用对肝癌转移的抑制效果，且安全性好。

2、本发明提供的双抗体组合物，包含itgb1单抗和itgb4单抗，所述itgb1单抗与itgb4单抗质量比0.1:1-1:0.1。

3、进一步，所述itgb1单抗是小鼠igg1单克隆抗体。

4、进一步，所述itgb4单抗是小鼠igg2a,单克隆抗体。

5、本发明还提供所述双抗体组合物在制备治疗肝癌转移药物中的应用。

6、本发明还提供一种双抗体组合物制剂，所述制剂包含：0.1-1mg/ml的itgb1单抗；0.1-1mg/ml的itgb4单抗；20mm的l-组氨酸缓冲液，ph为6.0；120mm蔗糖稳定剂；0.02％(w/v)tween-20表面活性剂；防止抗体蛋白聚合的100mm的l-精氨酸。

7、优选为，所述itgb1单抗为0.1mg/ml，所述itgb4单抗为0.1mg/ml。

8、更优选为，所述itgb1单抗为0.5mg/ml，所述itgb4单抗为0.5mg/ml。

9、最优选为，所述itgb1单抗为1mg/ml，的所述itgb4单抗为1mg/ml。

10、上述双抗体组合物制剂的制备方法为，用l-组氨酸缓冲液、蔗糖稳定剂、l-精氨酸和tween-20表面活性剂的混合液，将单抗冻干固体粉剂溶解及稀释至所需的蛋白浓度，混合均匀后通过0.22μm过滤膜过滤制得。

11、上述双抗体组合物制剂的使用方法为，所述制剂通过腹腔注射、静脉注射或任何其他非肠道给药方式施用。

12、如上所述，本发明提供两个在肿瘤转移过程中发挥协同促进作用的整合素亚基itgb1和itgb4作为干预靶点，提供这两种整合素亚基的单抗组合物制剂以改善肝癌细胞转移问题。

13、为了验证itgb1基因或itgb4基因的功能，本发明构建了itgb1或itgb4基因缺失的肝癌细胞系：

14、利用gecko(v2)库设计合成靶向基因itgb1或itgb4的guide rna(grna)各3条，序列如seq id no.1-6所示，将其分别构建入表达gfp荧光蛋白的携带cas9蛋白表达的crispr质粒，分别携带不同grna的三种质粒1:1:1比例混合后转染入hcclm3肝癌细胞系，通过流式细胞仪分选带绿光的阳性单克隆细胞进行体外培养扩增和基因敲除鉴定。

15、为了评估肝癌细胞系整合素基因缺失或抗体治疗效果，本发明构建了肿瘤体内转移小鼠模型：

16、选择8周龄裸鼠进行麻醉，每只小鼠手术开腹暴露左肝叶或脾脏，平行于肝叶下表面靠近正中位置或平行脾脏长边正中位置进针1/3注射2×106个hcclm3肝癌细胞，拔针后医用胶快速封闭创口止血，手术缝合。构建肝癌细胞裸鼠肝脏原位移植瘤肝内转移模型或肝癌细胞裸鼠脾脏肝转移模型。本发明提供的itgb1单抗和itgb4单抗形成的抗体组合物制剂，需要解决稳定性问题以防止抗体降解，同时更好的发挥itgb1单抗和itgb4单抗的协同作用。

17、本发明提供的itgb1单抗(小鼠igg1，单克隆抗体，克隆号p4c10)；itgb4单抗(小鼠igg2a,单克隆抗体，克隆号um-a9)。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

19、本发明通过新发现的两个促进肝癌转移，可作为临床肝癌转移靶点的整合素亚基itgb1和itgb4，提供了靶向两个整合素的单抗组合制剂。该组合物相比两种单抗单独治疗，显示出明显协同效应，治疗效果远高于两种单抗分别单独使用对肝癌转移的抑制效果，且安全性好。

技术特征：

1.一种双抗体组合物，其特征在于，所述组合物包含itgb1单抗和itgb4单抗，所述itgb1单抗与itgb4单抗质量比0.1:1-1:0.1。

2.根据权利要求1所述的双抗体组合物，其特征在于，所述itgb1单抗是小鼠igg1单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的双抗体组合物，其特征在于，所述itgb4单抗是小鼠igg2a,单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的双抗体组合物在制备治疗肝癌转移药物中的应用。

5.一种双抗体组合物制剂，其特征在于，所述制剂包含：

6.根据权利要求5所述的双抗体组合物制剂，其特征在于，所述itgb1单抗为0.1mg/ml，所述itgb4单抗为0.1mg/ml。

7.根据权利要求5所述的双抗体组合物制剂，其特征在于，所述itgb1单抗为0.5mg/ml，所述itgb4单抗为0.5mg/ml。

8.根据权利要求5所述的双抗体组合物制剂，其特征在于，所述itgb1单抗为1mg/ml，的所述itgb4单抗为1mg/ml。

9.根据权利要求5所述的双抗体组合物制剂的制备方法，其特征在于，用l-组氨酸缓冲液、蔗糖稳定剂、l-精氨酸和tween-20表面活性剂的混合液，将单抗冻干固体粉剂溶解及稀释至所需的蛋白浓度，混合均匀后通过0.22μm过滤膜过滤制得。

10.根据权利要求5所述的双抗体组合物制剂的使用方法，其特征在于，所述制剂通过腹腔注射、静脉注射或任何其他非肠道给药方式施用。

技术总结
本发明提供一种双抗体组合物，包含ITGB1单抗和ITGB4单抗，所述ITGB1单抗与ITGB4单抗质量比0.1:1‑1:0.1。所述ITGB1单抗是小鼠IgG1单克隆抗体；所述ITGB4单抗是小鼠IgG2a,单克隆抗体。本发明还提供所述双抗体组合物在制备治疗肝癌转移药物中的应用。本发明通过新发现的两个促进肝癌转移、可作为临床肝癌转移靶点的整合素亚基ITGB1和ITGB4，提供了靶向两个整合素的单抗组合制剂。该组合物相比两种单抗单独治疗，显示出明显协同效应，治疗效果远高于两种单抗分别单独使用对肝癌转移的抑制效果，且安全性好。

技术研发人员：向俊宇,苏立,王斌,张妮
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军特色医学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13