一种克隆柚ATP合酶β亚基基因的方法

一种克隆柚atp合酶
β
亚基基因的方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种克隆柚atp合酶β亚基基因的方法。


背景技术：

2.atp合酶广泛存在于线粒体内膜、叶绿体类囊体膜和细菌质膜上，是氧化磷酸化和光合磷酸化过程中的关键酶。atp合酶由cf0和cf1两部分组成。cf1由α、β、γ、δ和ε5种亚基组成，其中β亚基是催化亚基，具有结合adp的功能，在跨膜质子梯度存在下能将adp转化为atp。因此，克隆atp合酶具有重要的意义。
3.近年来，atp合酶β基因的功能在模式植物中得到广泛的研究，而柚子atp合酶β基因的功能还存在许多盲区，甚至此基因尚未被克隆。柚子是广泛种植于热带和亚热带的经济作物，克隆atp合酶β基因可为其表达载体构建、遗传转化以及抗逆的研究奠定基础。传统的基因克隆技术主要包含简并序列克隆技术、定位克隆技术和转座子标签克隆技术等，这些方法虽能较好地完成基因克隆的目的，但实验步骤繁琐、试剂用量大且时间太长，并耗费大量人力和物力。


技术实现要素：

4.本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种克隆柚atp合酶β亚基基因的方法，以解决常规方法步骤繁琐、试剂用量大且时间过长等技术问题。
5.为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种克隆柚atp合酶β亚基基因的方法，包括以下步骤：
7.1)在ncbi数据库中找到拟南芥诱饵基因；
8.2)在柚子的est库中通过blastn搜寻同源的est序列，选择能够覆盖探针核苷酸序列的est序列；
9.3)对序列进行组装和衍生，得到的cdna；
10.4)得到的cdna继续对比，直至无新的est序列可组装；
11.5)利用ncbi数据库进行blastx蛋白比对，比较5
′
端和3
′
端，验证表达蛋白两端的完整性，确定基因是完整的；
12.6)得到新基因。
13.作为优选，步骤1)所述的拟南芥诱饵基因，其gene id为830770。
14.作为优选，步骤3)是利用cap3在线软件(http://doua.prabi.fr/software/cap3)实现的。
15.本发明基于基因电子克隆技术实现，利用现有数据库对目标基因的表达序列标签(est序列)进行采集、组装和衍生，得到所需要的cdna序列，该技术不仅能准确、快速地得到新基因，而且节省大量的人力物力。
16.本发明的有益效果包括以下方面：
17.1、获得了柚atp合酶β亚基基因全长cdna序列，其全长序列为1497bp。
18.2、能准确、快速地得到新基因，节省大量的人力物力。
19.3、本研究为该基因的克隆、表达载体的构建和遗传转化提供参考。
附图说明
20.图1是本发明中atpβ基因的cdna序列及推导的氨基酸序列。
具体实施方式
21.以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
22.一种克隆柚atp合酶β亚基基因的方法：
23.一、以拟南芥的atpβ基因序列(gene id:830770)为探针，使用ncbi中的blastn工具检索，得到与探针序列同源性较高的est序列，在线工具cap3对序列进行组装和衍生，然后以拼接好的conting重叠群为新探针，再次对比检索，直至无新的est序列可组装。
24.二、选择大部分覆盖框的cdna序列，用软件bioxm2.6翻译出氨基酸序列。
25.序列分析结果显示(图1)，atpβ基因全长为1497碱基，0-1494为该基因的编码区，编码框长度为1494个碱基，共编码498个氨基酸。atg为起始密码子，tga为终止密码子。
26.三、blastx蛋白比对，确定是否为此蛋白一个完整的基因，比对氨基酸数量：5
′
端先比对，第1个氨基酸比对上，说明是cdna的开头是完整的，最后3
′
端也比对到，说明cdna结尾是完整的。
27.以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种克隆柚atp合酶β亚基基因的方法，其特征在于包括以下步骤：1)在ncbi数据库中找到拟南芥诱饵基因；2)在柚子的est库中通过blastn搜寻同源的est序列，选择能够覆盖探针核苷酸序列的est序列；3)对序列进行组装和衍生，得到的cdna；4)得到的cdna继续对比，直至无新的est序列可组装；5)利用ncbi数据库进行blastx蛋白比对，比较5
′
端和3
′
端，验证表达蛋白两端的完整性，确定基因是完整的；6)得到新基因。2.根据权利要求1所述的一种克隆柚atp合酶β亚基基因的方法，其特征在于，步骤1)所述的拟南芥诱饵基因，其gene id为830770。3.根据权利要求1所述的一种克隆柚atp合酶β亚基基因的方法，其特征在于，步骤3)是利用cap3在线软件实现的。

技术总结
本发明提供了一种克隆柚ATP合酶β亚基基因的方法，包括以下步骤：1)在NCBI数据库中找到拟南芥诱饵基因；2)在柚子的EST库中通过blastn搜寻同源的EST序列，选择能够覆盖探针核苷酸序列的EST序列；3)对序列进行组装和衍生，得到的cDNA；4)得到的cDNA继续对比，直至无新的EST序列可组装；5)利用NCBI数据库进行blastx蛋白比对，比较5


技术研发人员：杜尚广 曹文艳 徐雅楠 余波 龚琼
受保护的技术使用者：南昌师范学院
技术研发日：2022.07.28
技术公布日：2022/10/25