一种钛表面细菌生物膜的柚皮苷清洁试剂及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料领域。具体涉及一种钛表面细菌生物膜的柚皮苷清洁试剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细菌生物膜被认为是口腔种植体周围疾病的主要病因。治疗种植体周围疾病的首要目标是去除钛表面的生物膜。物理清洁是去除钛植入物表面细菌生物膜的最常见方法，例如使用刮匙、超声波、空气粉末抛光、钛刷等。尽管物理去除显示出一些效果，但它不能完全去除钛表面的生物膜，尤其是在设备难以接近的一些较深和较窄的位置。此外，物理清洁可可能会影响种植体表面的生物相容性和重新骨整合。
3.化学清洁是防止种植体感染进一步发展的最有希望的治疗选择之一。常用的口腔化学清洁试剂有氯己定、过氧化氢、和生理盐水等。但由于细菌耐药性，去除效率低和生物相容性受损等问题，目前化学清洁试剂的应用受到限制。有必要进一步探索新的化学清洁试剂。
4.柚皮苷(4,5,7-三羟基黄酮-7-β-d-α-l-鼠李糖基(1
→
2)β-d-葡萄糖苷)是一种黄酮类天然植物提取物，可从柑橘类水果中大量提取，也广泛存在于多种中草药中，具有多种生物活性，能够抵抗细菌和真菌。但其作为一种化学清洁试剂，破坏和去除粗糙钛表面上成熟菌斑生物膜的有效性并无报导。


技术实现要素：

5.本发明针对上述现有技术的不足，提供柚皮苷的在清除口腔植入物表面细菌生物膜中的应用，并提供一种细菌生物膜清洁试剂及其制备方法。本发明具有恢复钛表面特征，清洁效率高和生物相容性好的特点。仅通过溶液配比和磁力搅拌完成制备，工艺简单，易于加工，制备成本低廉。
6.本发明技术方案如下：
7.本发明的第一个目的是提供柚皮苷在制备细菌生物膜清洁试剂中的应用。
8.进一步的，所述细菌生物膜为存在于口腔植入物表面的细菌生物膜。
9.进一步的，所述口腔植入物的材质包括钛、钛合金中的至少一种。
10.进一步的，所述细菌生物膜为金黄色葡萄球菌生物膜。
11.本发明的第二个目的是提供一种细菌生物膜清洁试剂，所述试剂中包括柚皮苷。
12.进一步的，所述试剂的溶剂为无水乙醇和/或水。
13.本发明的第三个目的时提供一种细菌生物膜清洁试剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
14.步骤a)将柚皮苷加入无水乙醇中；
15.步骤b)将步骤a)所述溶液搅拌使溶解；
16.步骤c)将溶解后的溶液用去离子水稀释；
17.步骤d)使用细菌滤过器过滤，得到细菌生物膜清洁试剂。
18.进一步的，步骤a)中柚皮苷与无水乙醇的比例为20mg/ml。
19.进一步的，步骤c)中去离子水稀释倍数为20倍。
20.本发明的第四个目的是提供柚皮苷或前述细菌生物膜清洁试剂在制备促进成骨细胞粘附和/或增殖的试剂中的应用。
21.有益效果：
22.本发明创造性的发现柚皮苷对于已经形成的生物膜具有优异的解离效果，基于此提供柚皮苷的在清除口腔植入物表面细菌生物膜中的应用，并提供一种细菌生物膜清洁试剂及其制备方法。本发明细菌生物膜清洁试剂制备工艺简单，易于加工，成本低廉。具有恢复口腔种植体表面特征，清洁效率高和生物相容性好的特点。与口腔疾病常用的化学冲洗剂过氧化氢和“金标准”氯己定相比，柚皮苷和本发明细菌生物膜清洁试剂可以更有效清除粗糙钛等口腔种植体表面材质上已经形成的金黄色葡萄球菌的生物膜，恢复表面微观特点，并且具有更低的细胞毒性，可以促进成骨细胞的粘附和增殖，有利于再次骨整合，预防和治疗种植体周围炎。
附图说明
23.图1为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，清洁sla钛表面和覆盖金黄色葡萄球菌生物膜sla钛表面为对照组，所测得的5组钛片的水接触角；
24.图2为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，清洁sla钛表面和覆盖金黄色葡萄球菌生物膜sla钛表面为对照组，所测得的5组钛片的粗糙度；
25.图3为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，覆盖金黄色葡萄球菌生物膜sla钛表面为对照组，所得到的样本扫描电镜图(5000倍；20000倍)；
26.图4为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，覆盖金黄色葡萄球菌生物膜sla钛表面为对照组，采用结晶紫染色后，所测得的表面菌斑残留量；
27.图5为为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，覆盖金黄色葡萄球菌生物膜sla钛表面为对照组，采用活死菌染色后，所得到的激光共聚焦显微镜图(200倍)；
28.图6为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，覆盖金黄色葡萄球菌生物膜sla钛表面为对照组，采用活死菌染色后，所测得残留生物膜的细菌成分；
29.图7为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，覆盖金黄色葡萄球菌生物膜sla钛表面为对照组，将mc3t3-e1成骨细胞系接种于其表面培养4小时后，激光共聚焦显微镜观察到的细胞粘附图(200倍)；
30.图8为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，清洁sla钛表面为对照组，将mc3t3-e1成骨细胞系接种于其表面后，所测得的细胞活力；
31.图9为本发明、过氧化氢和氯己定为实验组，清洁sla钛表面为对照组，将mc3t3-e1成骨细胞系接种于其表面培养1、3、5天后，所测得细胞增殖cck-8值柱状图，*表示存在显著性差异；
具体实施方式
32.以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
33.实施例1制备细菌生物膜清洁试剂
34.步骤a)将柚皮苷加入无水乙醇中，柚皮苷的纯度为98％，质量为100mg；无水乙醇的体积为5ml；
35.步骤b)将溶液置于磁力搅拌器上充分搅拌，磁力搅拌器的速度为500r/min,搅拌时间为10min，温度为4℃；
36.步骤c)将溶解后的溶液用去离子水稀释至体积为100ml；
37.步骤d)使用细菌滤过器过滤，并保存在4℃的密封容器中，得到柚皮苷细菌生物膜清洁试剂，细菌滤过器的孔径为0.22μm。
38.实施例2
39.本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液和0.12％氯己定溶液为实验组，无菌大颗粒喷砂酸蚀钛表面清洁sla钛表面(清洁钛)和覆盖金黄色葡萄球菌生物膜大颗粒喷砂酸蚀钛表面(载菌钛)为对照组。
40.载菌钛的制备方法为：将复苏的金黄色葡萄球菌菌株(atcc 25923)分散在luria bertani(lb)肉汤中，置于37℃培养箱培养2天。在对数生长阶段，用新鲜的lb将金黄色葡萄球菌菌液稀释至最终浓度1
×
106cfu/ml，加入等量的菌液至钛片表面培养24小时后，谨慎去除培养液，得到覆盖金黄色葡萄球菌生物膜的钛表面。
41.清洁步骤：使用实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液和0.12％氯己定溶液处理载菌钛。将载菌钛浸泡在不同的清洁剂中1分钟后取出。
42.检测5组钛片的水接触角，检测方法为：在室温下，随机选取样品表面五个点，将2μl去离子水滴至样品表面，使用自动接触角测量仪测量接触角大小。结果显示本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂组水接触角更接近清洁sla钛表面，表明本发明可以更好的恢复表面性能(图1)。
43.实施例3
44.本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液和0.12％氯己定溶液为实验组，无菌大颗粒喷砂酸蚀钛表面(清洁钛)和覆盖金黄色葡萄球菌生物膜大颗粒喷砂酸蚀钛表面(载菌钛)为对照组，将载菌钛浸泡在三种不同的清洁剂中1分钟后取出(同实施例2“清洁步骤”)，检测5组钛片的粗糙度，检测方法为：在室温下，随机选取样品表面五个点，将光学轮廓仪探头置于样品表面，使用光学轮廓仪测量粗糙度大小。结果显示本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂组粗糙度更接近清洁sla钛表面，表明本发明可以更好的恢复表面性能(图2)。
45.实施例4
46.用扫描电子显微镜观察使用本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液、0.12％氯己定溶液浸泡1分钟后的载菌钛和未清洁的载菌钛，得到的样本扫描电镜图(5000倍；20000倍)，其表面细菌生物膜微观连续性被破坏，露出粗糙的钛基底，本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂组残留细菌数量更少(图3)。
47.实施例5
48.本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液和0.12％氯己定溶液为实验组，覆盖金黄色葡萄球菌生物膜大颗粒喷砂酸蚀钛表面为对照组，将载菌钛浸泡在三种不同的清洁剂中1分钟后取出，采用结晶紫染色，处理条件为将样本置于4％多聚甲醛中固定15分钟，然后使用37℃的烘箱干燥。在室温下向每个样本表面加入500μl 0.1％结晶紫染料染色5分钟，漂洗净多余染料，向每个样本表面加入500μl 95％乙醇，放置于摇床上，以100转/每分钟的速度脱色30分钟。使用酶标仪测量脱色后乙醇的吸光度值，波长为595nm，测得表面菌斑残留量(图4)，结果显示本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂组表面菌斑残留量更少。表面本发明可以去除更多的生物膜。
49.实施例6
50.本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液和0.12％氯己定溶液为实验组，覆盖金黄色葡萄球菌生物膜大颗粒喷砂酸蚀钛表面为对照组，将载菌钛浸泡在三种不同的清洁剂中1分钟后取出，采用活死细菌染色，处理条件为将3μl核酸染色试剂syto 9和3μl碘化丙锭稀释混匀在2ml去离子水中，向每个样本表面加入500μl染料混合物，室温下在黑暗中孵育15分钟，漂洗净多余染料，用激光扫描显微镜观察到的样本荧光染色图(图5；200倍；)和分析残留生物膜的细菌成分(图6)，结果显示本发明组表面活细菌和死细菌残留量和比例更少。表面本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂可以去除更多的生物膜，同时具有杀菌活性。
51.实施例7
52.本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液和0.12％氯己定溶液为实验组，覆盖金黄色葡萄球菌生物膜大颗粒喷砂酸蚀钛表面为对照组，将载菌钛浸泡在三种不同的清洁剂中1分钟后取出。将mc3t3-e1细胞分散在含有10％胎牛血清和1％青霉素与链霉素的α-mem培养基中，置于含有5％二氧化碳和95％空气的37℃培养箱中培养。将3000个mc3t3-e1成骨细胞接种于样本表面，置于含有5％二氧化碳和95％空气的37℃培养箱中培养4小时，将样本置于4％多聚甲醛中固定15分钟，然后在黑暗中使用罗丹明标记鬼笔环肽染色30分钟，用dapi染色60秒，使用激光共聚焦显微镜观察到的细胞粘附图像，结果显示本发明组表面成骨细胞粘附数量更多，伪足铺展面积更大(图7)。
53.实施例8
54.本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液和0.12％氯己定溶液为实验组，无菌大颗粒喷砂酸蚀钛表面为对照组，将相同数量的mc3t3-e1细胞分散在含有10％胎牛血清和1％青霉素与链霉素的α-mem培养基中，置于含有5％二氧化碳和95％空气的37℃培养箱中培养1天。将等量的实验对象加入贴壁的mc3t3-e1成骨细胞中1分钟，去净培养基，加入含有10％ cck-8试剂的培养液，黑暗中置于含有5％二氧化碳和95％空气的37℃培养箱中培养2小时，使用酶标仪测量吸光度值，波长为450nm，测得细胞活力，结果显示本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂组细胞活力更高。表面本发明无明显细胞毒性(图8)。
55.实施例9
56.本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂、3％过氧化氢溶液和0.12％氯己定溶液为实验组，无处理的无菌大颗粒喷砂酸蚀钛表面(清洁钛)为对照组，将清洁钛浸泡在三种不同的清洁剂中1分钟后取出。将5000个mc3t3-e1成骨细胞接种于其表面，培养条件为置于
含有5％二氧化碳和95％空气的37℃℃培养箱中培养，培养1、3、5天后，测得细胞增殖cck-8值柱状图；结果显示本发明实施1制备的细菌生物膜清洁试剂组成骨细胞数量增长更多，表明本发明可以促进成骨细胞增殖(图9)。
57.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。