一种抗菌磁性纳米酶的碎裂结晶甘露糖结合凝集素修饰的磁性还原氧化石墨烯的制备方法

本发明涉及纳米材料抗菌，具体为一种磁性纳米酶的碎裂结晶甘露糖结合凝集素修饰的磁性还原氧化石墨烯(fc-mbl@rgo@fe3o4)的制备方法。

背景技术：

1、近年来，光热治疗(photothermal therapy,ptt)、光动力治疗、化学动力治疗(chemodynamic therapy,cdt)等方法被应用于抗菌治疗。近红外光(nir)诱导ptt的侵袭性低、副作用小，在抗菌治疗中受到广泛关注。nir辐射对微生物无影响，但是当具有nir响应的纳米颗粒受到波长为750-950nm的nir照射时，光能转化为热能可以杀死微生物。cdt是一种新兴的治疗方法，利用金属或金属氧化物等与过氧化物之间的(类)芬顿反应产生高活性的·oh，能有效杀灭细菌。然而，ptt通常需要较高功率密度nir照射，照射时间长，治疗效果有限，可能损伤正常组织。cdt和光动力治疗的应用也受到与细菌之间的弱相互作用和ros的寿命短等限制。

2、研究表明，ptt与cdt结合可产生协同效应。cdt产生的·oh可增加细菌细胞膜的通透性和对热的敏感性，同时，ptt诱导的热疗和加速抗氧化剂谷胱甘肽氧化均可促进·oh的生成。因此，开发基于光热剂的多功能纳米平台可以整合单一治疗的优势，减少抗菌剂的用量，提高治疗效果。石墨烯材料具有优良的电化学性能、超高的比表面积、优良的导热性和良好的生物相容性，在生物医学领域引起了广泛的关注。有报道称石墨烯材料具有较强的抗菌活性。石墨烯纳米片尖锐的边缘可能会对细胞膜造成物理损伤，破坏细菌膜并引起rna泄漏。石墨烯材料的官能团密度较高，体积较小，与细菌细胞相互作用的机会较多。石墨烯材料还具有优异的近红外吸收和生物相容性，可用于ptt。纳米酶的催化效率和安全性较高，是一种有效的抗菌纳米材料。通常，纳米酶可以将h2o2转化为·oh，实现cdt。自从fe3o4nps被发现具有过氧化物酶特性之后，纳米酶的研究迅速发展。与天然酶相比，纳米酶具有合成简单、成本低、稳定性高、催化性能优良等优点。但纳米酶与细菌的相互作用弱、寿命短、·oh扩散距离有限，严重制约了纳米酶的实际应用，而mbl可以与不同细菌、真菌和病毒表面的甘露糖和岩藻糖等结合，fc-mbl已成为一种广谱性的细菌亲和剂，用于富集微生物。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种抗菌磁性纳米酶fc-mbl@rgo@fe3o4的制备方法。

2、实现本发明目的的技术方案是提供一种抗菌磁性纳米酶fc-mbl@rgo@fe3o4的制备方法，该方法通过原位还原法合成还原氧化石墨烯负载四氧化三铁磁性纳米酶(rgo@fe3o4)，并在磁性纳米酶表面修饰细菌广谱性亲和剂工程化的甘露糖凝集素(fc-mbl)。

3、进一步的，具体步骤为：

4、s1.rgo@fe3o4制备：将go溶液和fecl2·4h2o混合，溶液中出现棕色絮状悬浮物，待fecl2·4h2o完全溶解后，分批加入nh3·h2o混合，磁性分离，用无菌水洗涤，合成的rgo@fe3o4分散于无菌水中；

5、s2.sio2@rgo@fe3o4制备：取s1中合成的rgo@fe3o4磁性分离，去除上清液，加入乙醇和正硅酸乙酯，25℃下机械搅拌反应2h后磁性分离，用无菌水洗涤，重悬于无菌水中，得到sio2@rgo@fe3o4；

6、s3.fc-mbl@rgo@fe3o4制备：3-氨丙基三乙氧基硅烷、(boc-氨氧基)乙酸和edc溶于乙腈，室温下搅拌反应12h，得到boc-aotes；取s2中得到的sio2@rgo@fe3o4分散于异丙醇中，加入boc-aotes，室温下机械搅拌反应24h，然后加入三氟乙酸，反应1h，磁性分离，用乙醇和水分别清洗，得到rgo@fe3o4@sio2-onh2；在fc-mbl中加入plp溶液，室温孵育过夜，将fc-mbl-plp置于pbs缓冲溶液中透析成fc-mbl，rgo@fe3o4@sio2-onh2分散于上述fc-mbl中，在垂直震荡器上室温反应12h，磁性分离除去上清液后，pbs缓冲溶液清洗后重悬于pbs缓冲溶液中，得到fc-mbl@rgo@fe3o4。

7、进一步的，s1所述加入nh3·h2o混合后溶液中出现黑色颗粒，当混合溶液中的黑色颗粒不再增加时，停止加入氨水，此时保持溶液的ph＝9.0。

8、进一步的，s2所述乙醇和正硅酸乙酯用量比为40:1。

9、进一步的，s3所述boc-aotes需用层析柱减压浓缩纯化，再用乙酸乙酯洗脱后得到。

10、进一步的，该方法制得的磁性纳米酶在体外抗菌中的应用。

11、采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：

12、(1)本发明合成的抗菌磁性纳米酶具有cdt与ptt协同的抗菌能力，构建了一个靶向细菌的ptt和cdt结合的抗菌平台，在抗菌治疗方面具有更为广阔的应用前景。

13、(2)本发明fc-mbl的广谱细菌亲和性和石墨烯的物理特性提高了材料捕获细菌的能力；利用fe3o4优异的类过氧化物酶活性和rgo良好的光热转化性能，实现了ptt和cdt协同抗菌治疗；fc-mbl@rgo@fe3o4能够在5min内实现细菌的快速富集，并能催化低浓度的h2o2转化为对细菌具有毒性的·oh；在nir照射下，fc-mbl@rgo@fe3o4产生的光热效应具有杀灭细菌的能力，并增强了cdt的抗菌作用，在低浓度(40μg/ml)和较温和温度下(47℃)实现了更有效的抗菌治疗。

14、(3)本发明实现抗菌光热治疗所需材料浓度更低，治疗温度更温和，更适合应用于抗感染治疗。

15、(4)本发明制备的抗菌磁性纳米酶表现出良好的生物相容性和广谱抗菌能力，为快速有效的体内抗菌治疗提供了一种潜在的选择。

技术特征：

1.一种抗菌磁性纳米酶fc-mbl@rgo@fe3o4的制备方法，其特征在于，该方法通过原位还原法合成还原氧化石墨烯负载四氧化三铁磁性纳米酶(rgo@fe3o4)，并在磁性纳米酶表面修饰细菌广谱性亲和剂工程化的甘露糖凝集素(fc-mbl)。

2.根据权利要求1所述的抗菌磁性纳米酶fc-mbl@rgo@fe3o4的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

3.根据权利要求2所述的抗菌磁性纳米酶fc-mbl@rgo@fe3o4的制备方法，其特征在于，s1所述加入nh3·h2o混合后溶液中出现黑色颗粒，当混合溶液中的黑色颗粒不再增加时，停止加入氨水，此时保持溶液的ph＝9.0。

4.根据权利要求2所述的抗菌磁性纳米酶fc-mbl@rgo@fe3o4的制备方法，其特征在于，s2所述乙醇和正硅酸乙酯用量比为40:1。

5.根据权利要求2所述的抗菌磁性纳米酶fc-mbl@rgo@fe3o4的制备方法，其特征在于，s3所述boc-aotes需用层析柱减压浓缩纯化，再用乙酸乙酯洗脱后得到。

6.根据权利要求1-5所述的抗菌磁性纳米酶fc-mbl@rgo@fe3o4的制备方法，其特征在于，该方法制得的磁性纳米酶在体外抗菌中的应用。

技术总结
本发明涉及一种磁性纳米酶Fc‑MBL@rGO@Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;的制备方法，构建了一个靶向细菌的PTT和CDT结合的抗菌平台。Fc‑MBL的广谱细菌亲和性和石墨烯的物理特性提高了材料捕获细菌的能力。利用Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;优异的类过氧化物酶活性和rGO良好的光热转化性能，实现了PTT和CDT协同抗菌治疗。Fc‑MBL@rGO@Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;能够在5min内实现细菌的快速富集，并能催化低浓度的H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;转化为对细菌具有毒性的·OH。在NIR照射下，Fc‑MBL@rGO@Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;产生的光热效应具有杀灭细菌的能力，并增强了CDT的抗菌作用，在低浓度(40μg/mL)和较温和温度下(47℃)实现了更有效的抗菌治疗。此外，Fc‑MBL@rGO@Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;表现出良好的生物相容性和广谱抗菌能力，为快速有效的体内抗菌治疗提供了一种潜在的选择。

技术研发人员：余绍宁,薛雨燕,高文静,冯彬
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13