用于靶向肿瘤相关巨噬细胞的纳米载体的制作方法

背景技术：

1、肿瘤具有动态微环境，其中癌细胞与未转化的宿主细胞密切相关。肿瘤相关基质被认为在肿瘤生长期间发挥重要作用，影响诸如血管生成、转移和免疫抑制的现象。因此，基质形成用于诊断和治疗性应用的有吸引力的靶标。

2、不同的骨髓细胞是肿瘤基质的重要组成部分。经常发现骨髓细胞浸润肿瘤，并与多种肿瘤促进活性有关。特别是，肿瘤相关巨噬细胞(tam)是小鼠模型和人类患者两者中的肿瘤基质的重要组成部分。tam可通过影响血管生成、免疫抑制和侵袭和转移来促进肿瘤生长。

3、巨噬细胞是可塑性细胞，其可根据免疫环境而采用不同的表型。微环境刺激可驱使巨噬细胞朝向“经典”(m1)或者“替代”(m2)活化状态，这是频谱中的两个极端。m1巨噬细胞的典型特征在于表达促炎细胞因子、诱导型一氧化氮合酶2(nos2)和mhc ii类分子。m2巨噬细胞具有降低水平的上述分子，并且通过其多种标记物(包括精氨酸酶-1和甘露糖以及清道夫受体)的印记表达来识别。已经表明tam显示出类似m2的表型。

技术实现思路

1、本文公开了一种有效靶向tam以治疗癌症的纳米载体系统。所公开的纳米载体是负载有治疗性货物诸如抗肿瘤剂的定制细胞外囊泡(ev)，并且经由用tam中的特异性受体的配体进行修饰而官能化以用于靶向递送。

2、这些纳米载体可在使用不同的转染技术(例如，大批电穿孔、纳米电穿孔、组织纳米转染、病毒转染)体外转染细胞或体内转染组织后获得。如图1所示，用抗肿瘤剂负载ev和/或用细胞靶向配体进行修饰可通过转染(例如，编码特定货物或配体的质粒dna)实现。货物可根据需要调节的炎症通路而变化，并且表面修饰可根据靶细胞类型而变化。

3、例如，可使用可编码膜糖蛋白cd200的质粒基因来靶向tam。用cd200官能化的ev优先与tam中的cd200r受体相互作用。还公开了用cd200r官能化的ev优先与表达cd200的细胞上的cd200受体相互作用。

4、cd200-cd200r相互作用在通过影响表达cd200r的肿瘤相关骨髓细胞(tamc)，诸如肿瘤相关巨噬细胞、树突状细胞和骨髓衍生的抑制细胞调节肿瘤微环境中是至关重要的。cd200在不同人类肿瘤的癌细胞、t细胞和内皮细胞中高度表达，并抑制tamc的功能，抑制肿瘤形成、转移和影响对t细胞疗法的倾向。因此，靶向cd200-cd200r相互作用可提供针对免疫疗法的选项。

5、cd200与检查点分子(pd-1、ctla4和cd47，其导致免疫检查点阻断)存在一些结构相似性。不同的研究已经显示出神经母细胞瘤肿瘤中与cd200–cd200r通路相关的抗肿瘤免疫下调(肿瘤位点处cd8+和cd4+t细胞的量减少)。因此，当使用抗cd200抗体阻断此通路时，对神经母细胞瘤存在潜在的益处。

6、神经元也表达cd200，作为自我保护机制，其与微胶质细胞表面上的cd200r相互作用，从而防止由这些细胞引起的继发性神经元损伤(例如，中风免疫疗法)。中风后，小胶质细胞被活化，并开始产生大量的促炎细胞因子，这些细胞因子可能损害神经元以及血脑屏障，进而影响神经发生。由小胶质细胞引起的损伤可通过受体-配体相互作用cd200-cd200r来修复，因为结合会导致抑制促炎介质的产生。另一个实例是帕金森病。

7、小鼠多发性硬化的模型是自身免疫性脑脊髓炎(eae)，其特征在于迁移至中枢神经系统的外周巨噬细胞、t细胞和粒细胞的活化，导致小胶质细胞活化、组织损伤和神经功能缺损(例如，瘫痪)。当cd200缺失时，疾病发作和进展增加。

8、人类类风湿性关节炎是一种关节的炎症性自身免疫性疾病，可用胶原诱导性关节炎(cia)模型来模拟。cd200对cd200r的刺激向骨髓细胞递送抑制信号。研究表明，使用cd200-fc(针对cd200r的激动剂)可用于阻断胶原诱导性关节炎的发展(5，6)。

9、已经显示出cd200-cd200r相互作用通过抑制炎症反应和诱导调节性t细胞来增加移植物接受性。

10、肺高度表达cd200(例如，肺泡巨噬细胞、肥大细胞和树突状细胞)，并且它被认为在肺免疫调节中发挥关键作用。更具体地，气道上皮呈现高水平的cd200，其与树突状细胞和肺泡巨噬细胞上的cd200r1相互作用。在没有炎症刺激的情况下，此种相互作用抑制它们的活化。在哮喘期间，这些水平的cd200在气道上皮上被下调，并且肺常驻免疫细胞显示出cd200r的过表达。

11、还可以使用质粒基因靶向tam，质粒基因可编码cd163、清道夫受体(sr-a，cd204)、tyro3、axl和mertk(tam受体酪氨酸激酶)、frβ(配体：免疫毒素)、甘露糖受体(mmr，cd206)、tim-3封闭抗体、vegf、cmaf、mgl1或mgl2。

12、可使用il4、il13、il10、tgfβ、pge2(活化m2)靶向tam，生长抑制特异性因子6(gas6)和蛋白s(pros1)是活化tyro3、axl、mertk、蜂毒素(mel，优先结合m2巨噬细胞中的cd206)、pd-1、sirpa、lilrb1或siglec-10(受体)的特异性配体。

13、如图2所示，表面修饰的ev也可负载治疗性货物，这些货物是可透过膜的药物化合物，可经由浓度梯度扩散到ev中。

14、因此，本文还公开了一种抑制有此需要的受试者的肿瘤生长或肿瘤转移的方法，该方法包括选择性地靶向tam。作为具体实施例，上述方法包括向哺乳动物施用药物有效量的本文公开的纳米载体系统。

15、在附图和以下描述中阐述本发明的一个或多个实施例的细节。根据描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。

技术特征：

1.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的用cd200r靶向配体修饰的细胞外囊泡。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞外囊泡包含融合蛋白，所述融合蛋白包含cd200和外泌体或溶酶体跨膜蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述cd200包含氨基酸序列seq id no:1、或包含seq id no:1的至少250个连续氨基酸的cd200的片段、或其与seq id no:1或其所述片段具有至少95％同一性的能够与肺巨噬细胞相互作用的变体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞外囊泡进一步包含治疗性货物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述治疗性货物是抗肿瘤剂。

技术总结
本文公开了一种有效靶向TAM以治疗癌症的纳米载体系统。所公开的纳米载体是负载有治疗性货物诸如抗肿瘤剂的定制细胞外囊泡(EV)，并且经由用TAM中的特异性受体的配体进行修饰而官能化以用于靶向递送。因此，本发明还公开了一种抑制有此需要的受试者的肿瘤生长或肿瘤转移的方法，所述方法包括选择性地靶向TAM。

技术研发人员：娜塔莉亚·希吉塔·卡斯特罗,丹尼尔·加勒戈·佩雷斯,安娜·萨拉查·普埃塔
受保护的技术使用者：俄亥俄州国家创新基金会
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5