对用于同种异体CART细胞疗法的干细胞进行工程化的制作方法

本公开涉及对干细胞进行工程化以供在同种异体细胞疗法中使用的方法。

背景技术：

1、t细胞的体外产生和扩增可用于广泛的临床应用，包含癌症治疗。例如，临床数据显示，具有肿瘤抗原特异性受体的经工程化的t细胞在一些患者中对于引起转移性癌症的消退是有用的。不幸的是，并不是所有的患者都受益于这种治疗。一种解释是在体外扩增期间，一些t细胞变得耗尽或衰老，这限制了治疗功效和体内持久性。

技术实现思路

1、本公开提供了用于产生具有增强的抗肿瘤表型的t细胞的系统和方法。具体地，本公开提供了从用包含t细胞受体(tcr)、嵌合抗原受体(car)和至少一种另外的转基因在内的多种转基因工程化的干细胞(例如，hsc)制备t细胞的方法。通过从hsc开始，本发明的系统和方法利用干细胞的自我再生和细胞分化能力来制备具有改善的抗肿瘤表型的t细胞。具体地，本公开提供了将核酸引入到编码tcr、car和至少一种另外的转基因的cd34+干细胞中。tcr和car的组合表达可用于提供具有特异性癌细胞靶向性质的t细胞。此外，通过本发明的方法产生的被赋予至少一种另外的转基因的t细胞装备有货物(例如，细胞因子)，当与靶癌细胞接触时，该货物对于治疗癌症是有用的。

2、干细胞(例如，hsc)的优点包含这些干细胞的再生和扩增的能力。同种异体细胞疗法通常需要数十亿个细胞用于单剂量的治疗。由于干细胞潜在的无限扩增能力，本发明的方法非常适于大规模产生高质量细胞产品并且使那些产品可快速地用于治疗。此外，干细胞的标志是其分化为不同细胞类型的能力。在本公开的上下文中，分化能力提供了可以产生各种t细胞亚型(包含例如自然杀伤t细胞、αβt细胞、γδt细胞等)的细胞制造平台。

3、在一方面，本发明提供了产生经工程化的恒定型自然杀伤t细胞的方法。该方法涉及将编码t细胞受体(tcr)、嵌合抗原受体(car)和至少一种另外的转基因的一种或多种核酸引入到造血干细胞(hsc)中；以及将该hsc转化为表达该tcr和该car并且包括该转基因的恒定型自然杀伤t(inkt)细胞。在优选的实施例中，该一种或多种核酸是由单一载体如慢病毒载体提供的。然而，在一些情况下，例如，当整合大的转基因时，使用至少两种不同的核酸分子，如多个载体(例如，慢病毒载体)，整合该一种或多种核酸可能是有用的。该至少两种不同的核酸分子可以依次或同时被引入到这些hsc中。

4、在优选的实施例中，本发明的方法涉及通过慢病毒转导将核酸引入到hsc中。该一种或多种核酸的引入提供了表达至少一种tcr、car和另外的转基因的hsc。该另外的转基因的并入可用于提供具有改善的功能性质(如改善的细胞扩增、持久性、安全性和/或抗肿瘤活性)的治疗性t细胞。该一种或多种另外的转基因可以包含以下中的任何一种或多种：细胞因子、检查点抑制剂、转化生长因子β信号传导的抑制剂、细胞因子释放综合征的抑制剂或神经毒性的抑制剂。例如，可以提供编码以下中的一种或多种的转基因：il-2、il-7、il-15、il-12、il-18或il-21。

5、因此，在一些情况下，本发明的方法提供了通过例如引入编码il-2、il-7、il-1-15中的一种或多种的核酸来制备具有改善的扩增和持久性能力的car t细胞。在一些情况下，方法可以通过例如引入编码il-12、il-18中的一种或多种的转基因来为car t细胞提供增加的ifn-g产生并且因此改善的t细胞效力。在其它情况下，本发明的方法可用于通过引入包含il-21在内的转基因来增强原初t细胞产生。在一些情况下，本文所述的方法通过例如引入il-6、gm-csf的抑制剂或细胞因子释放综合征和神经毒性的其它介质来提供具有改善的安全性的car t细胞的产生。方法可以通过提供可用于对抗肿瘤微环境的有效载荷(例如，通过tgf-b的抑制剂、检查点)来提供具有改善的功效的car t细胞。

1.一种产生经工程化的恒定型自然杀伤t细胞的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种核酸是由单一载体提供的。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述单一载体包括慢病毒载体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中引入所述一种或多种核酸涉及通过多个载体将至少两种不同的核酸分子并入到所述hsc中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少两种不同的核酸分子包括慢病毒载体。

6.根据权利要求4所述的方法，其中将所述至少两种不同的核酸分子依次或同时引入到所述hsc中。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述hsc源自祖细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述祖细胞是多能干细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种核酸进一步编码诱导核糖体跳跃的序列。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述序列编码2a序列。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述inkt细胞是α/βinkt细胞或γ/δinkt细胞。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种另外的转基因包括以下中的至少一种：细胞因子、检查点抑制剂、转化生长因子β信号传导的抑制剂、细胞因子释放综合征的抑制剂或神经毒性的抑制剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞因子包括以下中的一种：il-2、il-7、il-15、il-12、il-18或il-21。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述car包括单结构域抗体。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述car包括重链抗体的可变区。